倒心盾翅藤總皂苷提取工藝優(yōu)化

王婉麗 樊 馨 陳雄敏 李婷婷 楊亞彬 李宜航 李 光*

1．西雙版納傣族自治州職業(yè)技術學院，云南 景洪 666100；2．滇西應用技術大學傣醫(yī)藥學院，云南 景洪 666100；3.西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院，云南 景洪 666100；4.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100

傣藥倒心盾翅藤為AspidopterysobcordataHemsL.金虎尾科植物倒心盾翅藤的木質藤莖，傣藥名嘿蓋貫，主要分布于越南、緬甸北部、泰國以及我國的海南、云南等地，生長在山地雨林、溝谷雨林及季雨林的林緣、疏林及灌木叢中[1-2]。該藥性澀、涼，有消炎利尿、清熱排石之功效，傣族民間常用于泌尿系炎癥、感染及結石的治療，也用于產后消瘦，惡露不盡等癥，是傣醫(yī)傳統(tǒng)經方“五淋化石膠囊”的主要組方藥材，同時也是目前傣醫(yī)臨床用量最大的一味藥材[1, 3]。倒心盾翅藤中含有多種類型的化學成分，包括鞣質、甾體、酚酸、蒽醌、三萜以及黃酮類化合物，經實驗證實具有抗炎、抗腫瘤、抗結石等多種藥理活性[4-5]。在抗結石活性的研究中，倒心盾翅藤中甾體總皂苷被逐步證實是其抗結石的主要活性成分之一[6-7]。為了更好的滿足防治腎結石的需求，也是為了充分開發(fā)利用倒心盾翅藤植物資源，本研究對倒心盾翅藤甾體總皂苷的提取方法進行了優(yōu)化，并對提取物活性進行了驗證。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 分析天平(美國奧豪斯，DV215CD)；小型臺式組織脫水機(賽默飛世爾科技，STP 120)；組織包埋機(賽默飛世爾科技，HISTOSTAR)；全自動切片機(賽默飛世爾科技，HM355S)；染色機(賽默飛世爾科技，GEMINI AS)；電熱鼓風干燥箱(中興，101型)；光學顯微鏡(OLYMPUS,BX53)；離心機(SIGMA，3K15)；電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療器械有限公司，DZKW-S-6)；旋轉蒸發(fā)儀(BUCHI Labortechnik AG，R-210)；超聲清洗機(寧波科技園區(qū)新江南儀器有限公司，JN-500DT)；真空泵(萊伯泰科，VP50)。

1.2 實驗藥材與試劑 倒心盾翅藤藥材飲片購于西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院，保存于樣品室，提取前粉碎過篩。菝葜皂苷元(中國科學院成都生物研究所，批號：MUST-18081402，純度：99.57%)；茴香醛(阿達瑪斯，批號：P1438355，質量分數：99%以上)；無水乙醇(分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司)；甲醇(分析純，天津風船化學試劑科技有限公司)；硫酸(分析純，重慶川東化工有限公司)；水為自制純水。

2 方法與結果

2.1 甾體總皂苷的測定方法

2.1.1 工作溶液的配制 樣品溶液：倒心盾翅藤粉末加乙醇回流提取，濃縮、干燥，即得樣品。精密稱取樣品適量，加甲醇，配制成1 mg·mL-1的供試品溶液。對照品溶液：精密稱取菝葜皂苷元對照品加甲醇溶解定容，配制成0.2 mg·mL-1的對照品溶液。顯色劑：取8 mL甲醇至10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL濃硫酸，冷卻至室溫, 加100 μL茴香醛, 搖勻，即得1%茴香醛-硫酸顯色劑[8-9]。

2.1.2 線性關系考察 取1 mL對照品溶液揮干，加入4 mL顯色劑，置100 ℃水浴中保溫20 min，冰水浴10 min，補加顯色劑至10 mL，以甲醇做空白對照于380～800 nm波長進行掃描[8-10]。菝葜皂苷元在428.5 nm處有最大吸收峰，選擇 428.5 nm作為測定波長。

分別精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL揮干，顯色后于428.5 nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標，甾體總皂苷濃度為縱坐標，計算得到回歸方程為：y=0.3686x- 0.012，R2=0.9966，線性范圍0.04088～0.4088。

2.2 單因素試驗考察及結果

2.2.1 考察乙醇體積分數對總皂苷得率的影響 選擇液料比為11.5、提取溫度為75 ℃、提取時間為1.5 h，乙醇體積分數分別為35%、50%、65%、80%、95%、100%，加熱提取后濃縮回收乙醇，測定皂苷含量，計算得率。乙醇體積分數為50%時，總皂苷得率最高，為2.15%。當乙醇體積分數超過50%以后，總皂苷得率開始下降，故選擇乙醇體積分數為50%最佳，見圖1。

圖1 乙醇體積分數對總皂苷得率的影響

2.2.2 考察液料比對總皂苷得率的影響 在乙醇體積分數為65%、75 ℃、提取1.5 h條件下，液料比分別為4.5、8、11.5、15、18.5、22進行提取，比較總皂苷得率。隨著液料比增大，總皂苷得率總體呈上升趨勢，液料比達到22時，總皂苷得率2.44%?？紤]到實際生產中成本的投入與產率，故選擇液料選擇15最佳，見圖2。

圖2 液料比對總皂苷得率的影響

2.2.3 考察提取溫度對總皂苷得率的影響 使用65%乙醇、液料比為11.5，分別在75 ℃、85 ℃、95 ℃、100 ℃下回流提取1.5 h，比較總皂苷得率。隨著提取溫度的升高，總皂苷得率呈上升趨勢。100 ℃時，總皂苷得率達到最高，為2.21%，見圖3。

圖3 提取溫度對總皂苷得率的影響

2.2.4 考察提取時間對總皂苷得率的影響 選擇65%乙醇、液料比為11.5、75 ℃分別提取1、2、3 h，計算總皂苷得率如圖4所示。隨著提取時間增加，總皂苷得率不斷增加，達到3 h時總皂苷得率為1.77%。在實際生產中考慮到成本的生產效率，故提取時間選擇3 h。如圖4所示。

圖4 提取時間對總皂苷得率的影響

2.3 Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)選提取工藝及結果 在單因素實驗的基礎上進行4因素3水平設計，采用Design Expert 10軟件設計響應面實驗。選取甾體總皂苷得率作為響應值，乙醇體積分數(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)自變量進行實驗設計。響應面試驗設計及結果見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計及結果

對表1和表2中的試驗結果進行擬合分析，得到倒心盾翅藤中甾體總皂苷提取工藝參數回歸方程為：Y=1.43-0.50A+0.079B+0.21C+0.034D+0.37AB-0.21AC+0.018AD+0.37BC+0.095BD+0.084CD。回歸模型的P值=0.0008(P<0.01)，差異顯著，且失擬項P值=0.7412(P>0.05)，差異不顯著，決定系數R2=0.7575，表明無失擬因素存在，方程與試驗擬合度較好，可用于倒心盾翅藤中總甾體總皂苷提取。見表2。

表2 響應面ANOVA結果分析

回歸方程各項方差分析表明4個影響因素對倒心盾翅藤中甾體總皂苷含量影響的大小順序依次為：乙醇體積分數>提取溫度>液料比>提取時間，方程一次項(A、C)和交互項(AB、BC)影響都是顯著的(P<0.05)，方程一次項(B、D)和交互項(AC、AD、BD、CD)影響不顯著(P>0.05)。

各因素兩兩交互作用對總皂苷含量的影響的3D響應曲面圖如圖5所示，乙醇體積分數和液料比、乙醇體積分數和提取溫度、液料比和提取溫度響應曲面圖等高線呈橢圓形，表明兩因素之間交互作用顯著；而提取溫度和提取時間、液料比和提取時間、乙醇體積分數和提取時間兩因素之間的交互作用不顯著。該結果與回歸方程方差分析結果一致。

圖5 各因素交互作用對總皂苷提取率的影響

根據回歸模型最優(yōu)組合分析，最優(yōu)提取工藝參數為: 乙醇體積分數50.28%、液料比15、提取溫度99.99℃、提取時間3h，其倒心盾翅藤中甾體總皂苷得率預測值為2.43%。根據實際情況調整最優(yōu)提取工藝參數為：乙醇體積分數50%、液料比15、提取溫度100 ℃、提取時間3 h進行倒心盾翅藤中甾體總皂苷提取驗證試驗，3次平行試驗實際測得的甾體總皂苷平均得率為2.37%±0.19%，與模型理論預測值之間的相對誤差為1.65%，表明所得結果準確可靠。

2.4 倒心盾翅藤總皂苷生物活性驗 人腎小管上皮細胞HK-2復蘇后，完全MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱內，每3天換液一次。細胞生長至85%以上密度時胰酶消化傳代，接種到96孔板中，每孔4000個細胞，培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)基，加入含有一水草酸鈣結晶和倒心盾翅藤總皂苷的無血清MEM培養(yǎng)基100 μL，每孔一水草酸鈣含量為28 μg·cm-2，給藥組倒心盾翅藤總皂苷含量分別為1.56，3.12，6.25，12.5，25.0 μg·mL-1，每個劑量設置3個復孔?？瞻讓φ湛准尤氲润w積無血清MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，小心移除培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑 10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，酶標儀中450 nm處測定OD值。計算細胞相對存活率：各組OD值/空白組OD值×100%。結果采用均數加減標準差的方式表示，各組間的比較采用單因素方差分析法，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結果證明，倒心盾翅藤總皂苷在1.56～25.0μg·mL-1范圍內可以明顯減輕由草酸鈣結晶引起的HK-2細胞的損傷，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。這表明，上述工藝獲得的總皂苷可通過減少腎小管上皮細胞損傷抑制結石成分的黏附，具有防治腎結石的生物活性。

表3 倒心盾翅藤總皂苷對HK-2細胞草酸鈣損傷模型的影響

3 討論

皂苷是糖的衍生物，非糖的部分稱為苷元。甾體皂苷的苷元部分是螺甾烷的衍生物，主要分布薯蕷科、百合科等植物中，具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗炎、抗血栓、增強免疫、抗菌等多種功效[11]。倒心盾翅藤中的甾體皂苷成分也是其治療腎結石有效成分之一。甾體皂苷的檢測方法通常有分光光度法和高效液相法。為了優(yōu)化提取工藝，本研究首先建立了倒心盾翅藤甾體皂苷成分的檢測方法。因倒心盾翅藤甾體皂苷成分在液相色譜儀的紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器中均無吸收峰，因此采用了分光光度法。分別測試了濃硫酸-甲醇、茴香醛-硫酸、香草醛冰乙酸三種顯色試劑，確定經過1%茴香醛-硫酸顯色結果較好[9, 12-13]。顯色后，菝葜皂苷元和受試樣品在428.5 nm處有吸收，據此建立了較為可靠的倒心盾翅藤甾體皂苷比色定量方法。

甾體皂苷提取工藝包括冷浸提取、加熱提取、超聲輔助提取、微波輔助提取、酶法輔助提取等多種形式。本研究中應用的是加熱提取法，符合工廠生產的常規(guī)工藝，并優(yōu)選了乙醇和水作為提取溶劑，避免了有機試劑的殘留。根據單因素實驗優(yōu)選倒心盾翅藤甾體皂苷的提取方法，作為響應曲面試驗的因素水平，通過 Box- Behnken 響應曲面法考察乙醇體積分數、液料比、提取溫度、提取時間對皂苷得率的影響，確定了最佳的提取工藝為乙醇體積分數50%、液料比15、提取溫度100 ℃、提取時間3 h，該條件下甾體總皂苷得率為2.37%±0.19%，與模型預測值相符。所獲得的皂苷經過體外細胞實驗驗證，具有抗腎結石的生物活性。本研究提出的倒心盾翅藤甾體皂苷提取工藝穩(wěn)定可行，所獲得產物藥理活性較為明確，為倒心盾翅藤的開發(fā)應用提供了參考。