藏藥紅景天苷對(duì)斑馬魚發(fā)育及急性毒性的評(píng)價(jià)

樊紅艷 何樹梅 楊建偉 劉紅旭

西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部生命科學(xué)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 咸陽 712082

藏藥是民族醫(yī)藥的代表之一，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中發(fā)揮著重要作用。藏藥紅景天是景天科多年生草本植物，又名“掃羅瑪布爾(藏語)”“薔薇紅景天”等，被人們稱為“高原人參”[1]。紅景天苷(Salidroside，SAL)是由紅景天中提取的一種主要有效成分[1]。近年來，紅景天苷在是一種開發(fā)前景較好的藥物，在臨床上得到日益廣泛的應(yīng)用。在抗衰老方面，紅景天苷通過激活A(yù)MPK磷酸化，抑制NF-κBp65和NLRP3炎性小體的活化來改善內(nèi)皮炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。據(jù)報(bào)道[3]：紅景天苷中分離出的一種成分與白藜蘆醇具有相當(dāng)?shù)目顾ダ闲Чㄟ^miR22/SIRT1途徑增加線粒體的生物合成，從而延緩衰達(dá)到抗衰老的功效。在抗腫瘤方面，紅景天苷一方面通過抑制相關(guān)信號(hào)通路的激活降低腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4-6]；另一方面通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和T、B淋巴細(xì)胞的免疫功能來預(yù)防腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。在抗炎癥方面，紅景天苷在各種病理狀態(tài)下均具有抗炎活性，較其他抗炎制劑安全性更高、副作用更小[8]。其他方面，紅景天苷還能夠促進(jìn)大鼠脊髓損傷的功能恢復(fù)[9]，通過AKT /GSK3β信號(hào)傳導(dǎo)抑制血小板功能和血栓形成，在治療血栓或心血管疾病方面具有重要的作用[10]等。紅景天苷對(duì)不同疾病的治療及預(yù)后起到了積極的保護(hù)作用，因而具有重要的研究?jī)r(jià)值。

新興的模式生物斑馬魚以其胚胎透明、發(fā)育迅速、體積小、成本較低等優(yōu)勢(shì)已被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)和人類疾病的研究中[11]。斑馬魚的胚胎具有藥物滲透性，可應(yīng)用于藥物研究及毒性的研究[12]，為評(píng)價(jià)藥物毒性提供了理想的工具。本研究采用受精后6h(6 hours-post-fertilization,6hpf)斑馬魚胚胎及受精后4d(4 days-post-fertilization,4dpf)幼魚來評(píng)價(jià)紅景天苷急性毒性效應(yīng)及對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸作用，為確定紅景天苷對(duì)斑馬魚疾病模型的安全劑量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型AB斑馬魚由上海市公共衛(wèi)生臨床中心斑馬魚實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)提供。循環(huán)養(yǎng)殖水根據(jù)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚使用指南[13-14]中的方法配置。水溫控制在(28±0.5)℃，PH值7.0～7.2，電導(dǎo)率450～550 μS/cm,光亮/黑暗周期為14 h/10 h。成年斑馬魚每日喂食3次(人工孵育豐年蝦2次，輔助飼料1次)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 紅景天苷購(gòu)置于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 斑馬魚飼養(yǎng)系統(tǒng)(上海鱗道)；變倍體視顯微鏡(日本奧林巴斯)；生化培養(yǎng)箱(濟(jì)南創(chuàng)日新)；六孔板；移液槍；塑料吸管；50ml離心管；培養(yǎng)皿；交配缸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚的配種及胚胎的收集 實(shí)驗(yàn)前一晚8點(diǎn)將野生型雌雄斑馬魚按照1∶1或1∶2配對(duì)，放入裝有隔板的交配缸中，第二天早上8點(diǎn)給予光照，抽離隔板，雄魚開始追逐雌魚并在30 min內(nèi)完成交配產(chǎn)卵。產(chǎn)卵完成后，用養(yǎng)殖水輕柔沖洗數(shù)次除去未受精卵、糞便等殘留物后收集于盛有養(yǎng)殖水的培養(yǎng)皿中，置于28.5 ℃溫箱中培養(yǎng)待用。

1.2.2 給藥方法 給藥方式為浸泡法，具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15]所述以及Patricia McGrath的斑馬魚評(píng)價(jià)藥物安全和毒性方法[16-17]進(jìn)行。

1.2.3 紅景天苷樣品溶液的配置 本實(shí)驗(yàn)使用胚胎培養(yǎng)液將母液稀釋至0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM五個(gè)濃度梯度。

1.2.4紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎致畸試驗(yàn)方法 在顯微鏡下挑選受精后6 h(6 hour-post-fertilization,6hpf)且發(fā)育狀態(tài)良好的胚胎，并將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度紅景天苷溶液的6孔板，每板設(shè)置5個(gè)(0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM)藥物濃度，同時(shí)以養(yǎng)殖水作為空白組，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定，分別于給藥后12、24、48、72 h觀察并記錄胚胎的形態(tài)學(xué)變化。其中，畸形的種類主要有卵黃囊腫大、尾部彎曲、魚鰭缺失、心包腫脹。取不同親本的胚胎重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.2.5 紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)方法 在顯微鏡下挑選受精后6 h(6 hour-post-fertilization,6hpf)且發(fā)育正常的胚胎，并將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度紅景天苷溶液的6孔板，每板設(shè)置5個(gè)(0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM)藥物濃度，同時(shí)以養(yǎng)殖水作為空白組，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃溫箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定，分別于給藥后12、24、48、72h觀察并記錄胚胎的死亡變化。取不同親本的胚胎重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.2.6 紅景天苷對(duì)斑馬魚幼魚毒性實(shí)驗(yàn)方法 在顯微鏡下挑選受精后4 d(4 days-post-fertilization,4dpf)且發(fā)育正常的胚胎，并將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度紅景天苷溶液(0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM)的培養(yǎng)皿，同時(shí)以養(yǎng)殖水作為空白組，每皿20尾于28.5 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換紅景天苷樣品溶液1次，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定，分別于給藥后24、48、72 h觀察并統(tǒng)計(jì)幼魚的死亡率。取不同親本的幼魚重復(fù)三次試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用統(tǒng)t檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的評(píng)價(jià) 在顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)不同濃度的紅景天苷溶液中與空白對(duì)照組相比，畸形數(shù)均≤2，均沒有出現(xiàn)心包水腫、脊柱彎曲、尾部彎曲及溶解畸形等現(xiàn)象?？瞻讓?duì)照組與不同濃度的紅景天苷組畸形率比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，表明在受試劑量下，紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育無明顯的致畸作用(圖1)。

圖1 斑馬魚胚胎暴露于不同濃度紅景天苷溶液及空白對(duì)照組不同時(shí)期的形態(tài)

2.2 紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎急性毒性的評(píng)價(jià) 在顯微鏡下分別觀察12、24、48、72 h斑馬魚胚胎在不同時(shí)間點(diǎn)各組的死亡數(shù)，不同濃度的紅景天苷組與空白對(duì)照組相比，死亡數(shù)均≤2，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明在受試劑量下，紅景天苷對(duì)斑馬魚胚胎相對(duì)安全，無明顯的急性毒性作用。如圖2所示。

注：與對(duì)照組相比，P>0.05。圖2 斑馬魚胚胎暴露于不同濃度紅景天苷溶液及空白對(duì)照組不同時(shí)期的存活率

2.3 紅景天苷對(duì)斑馬魚幼魚急性毒性的評(píng)價(jià) 將4dpf(4 days-post-fer fertilization,4dpf)的斑馬魚幼魚分別暴露在不同濃度的紅景天苷溶液中，分別在給藥后24、48、72 h觀察幼魚的死亡情況。與空白對(duì)照組相比，不同濃度的紅景天苷組幼魚的死亡數(shù)均≤2，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),不同濃度的紅景天苷對(duì)斑馬魚幼魚無明顯的急性毒性作用。如圖3所示。

圖3 斑馬魚幼魚暴露于不同濃度紅景天苷溶液及空白對(duì)照組的形態(tài)

3 討論

本研究以理想的模式生物斑馬魚為模型，采用浸泡給藥的方式來評(píng)價(jià)紅景天苷對(duì)于斑馬魚胚胎的發(fā)育及幼魚的急性毒性作用。結(jié)果表明，在濃度為0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM的紅景天苷溶液對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育無致畸作用，對(duì)其胚胎和幼魚無明顯的急性毒性作用，這一結(jié)果與大鼠模型中的結(jié)果相似[18]，是否更高的劑量濃度能夠?qū)Π唏R魚胚胎的發(fā)育及幼魚產(chǎn)生致畸作用及毒性作用暫不明確。

紅景天苷作為一種重要的藏藥，具有較高的藥用價(jià)值，而利用斑馬魚模型來評(píng)價(jià)紅景天苷的毒性試驗(yàn)尚未報(bào)道。希望可以通過斑馬魚模型來完善對(duì)紅景天苷毒性的認(rèn)知，以期為紅景天苷在斑馬魚疾病模型的安全用量提供理論依據(jù),同時(shí)也能夠?yàn)槲覀兒罄m(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展奠定基礎(chǔ)。