基于MRI與病理對照的骨肉瘤動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI定量參數(shù)與腫瘤微循環(huán)及乏氧性表達(dá)的相關(guān)性研究*

李佳璐 王瑤 馬煥 李梅 李鹍 丁瑩瑩 陶海波

作者單位：①杭州醫(yī)學(xué)院附屬臨安人民醫(yī)院放射科（杭州市310000）；②昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院放射科；③昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院病理科

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，是青少年因腫瘤死亡的主要原因之一，好發(fā)于長骨干骺端，以股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端為主[1-2]。為準(zhǔn)確評(píng)估骨肉瘤新輔助化療療效，尋求能夠提供與術(shù)前療效相關(guān)的腫瘤組織學(xué)信息的影像評(píng)估手段尤為重要。研究表明，腫瘤壞死程度、微血管生成及乏氧狀態(tài)與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、療效密切相關(guān)[3-4]。目前，病理學(xué)上評(píng)價(jià)腫瘤微血管生成及乏氧情況最常用的方法是檢測腫瘤組織微血管密度（microvessel density，MVD）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和乏氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)水平[3-5]。MVD 和VEGF 可反映腫瘤微血管生成情況，是骨肉瘤抗血管生成治療研究的重要依據(jù)；HIF-1α 主要在腫瘤組織中表達(dá)，腫瘤乏氧區(qū)對化療藥物具有一定的耐藥性[3-4]。動(dòng)態(tài)增強(qiáng)磁共振成像（dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI）是一種定量灌注成像方法，已廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤[6]、乳腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、軟組織肉瘤[9]等惡性腫瘤微血管生成情況的評(píng)價(jià)，但應(yīng)用于骨肉瘤的研究相對較少。本研究采用MRI 影像與病理組織對照的方法，探究骨肉瘤DCE-MRI 圖像上病灶各感興趣區(qū)（region of interest，ROI）內(nèi)各定量參數(shù)（Ktrans、Kep、Ve、Vp）與相應(yīng)病理組織標(biāo)本的TNR、MVD、VEGF 及HIF-1α 表達(dá)水平之間的關(guān)系，旨在通過定量參數(shù)反映骨肉瘤腫瘤微環(huán)境中微血管生成及乏氧情況。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院2019年1月至2020年6月間經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的原發(fā)于股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端骨肉瘤患者10 例，其中男性9 例，女性1 例；年齡11～32 歲，中位年齡17.5 歲。發(fā)病部位為脛骨近端6 例，股骨遠(yuǎn)端4 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）所有患者就診前未接受任何治療；2）無MRI、新輔助化療（NAC）及手術(shù)禁忌證，化療方案為阿霉素+順鉑、甲氨蝶呤+長春新堿、異環(huán)磷酰胺序貫化療；3）按期完成NAC 后行MRI 檢查，2 周內(nèi)行擴(kuò)大根治手術(shù)；4）MRI 影像資料均滿足數(shù)據(jù)測量要求。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者及監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 MRI 檢查及定量參數(shù)測量 采用Philips Ingenia 3.0 T MR 儀及膝關(guān)節(jié)線圈進(jìn)行檢查，依次行常規(guī)MRI 平掃、定量DCE-MRI、MRI 常規(guī)增強(qiáng)。常規(guī)平掃包括多體位T1WI、T2WI 及脂肪抑制T2WI 序列。定量DCE-MRI 采用擾相梯度回波快速3D-DYNAMIC 序列行矢狀位T1WI 連續(xù)多期動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描，序列參數(shù)：反轉(zhuǎn)角度分別為5°、15°，TE 2.0 ms、TR 4.0 ms、層厚3.5 mm、間距0、FOV 250×250 mm，第5 期結(jié)束后高壓注射器團(tuán)注對比劑（Gd-DTPA 0.1 mmoL/kg，2.5 mLs）并生理鹽水沖管（20 mL，2.5 mL/s），共掃描80 期，每期采集圖像24 幅，掃描時(shí)間4.7 s，共采集1 920 幅圖像。

使用GE Healthcare 血流動(dòng)力學(xué)軟件Omni Kinetics 分析DCE-MRI 圖像數(shù)據(jù)，以股動(dòng)脈為參考血管并勾畫動(dòng)脈輸入函數(shù)（AIF），選擇Extended Tofts linear 血流動(dòng)力學(xué)模型[10]。在與瘤段病理組織切片對應(yīng)的正中矢狀位影像層面建立坐標(biāo)系，按照瘤段切片分割的組織塊樣本定位并等比例勾畫1 cm×1 cm 大小ROI，測量各ROI 內(nèi)定量參數(shù)，包括容量轉(zhuǎn)移常數(shù)（volume transfer constant，Ktrans）、速率常數(shù)（rate constant，Kep）、血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)（volume fraction，Ve）、血漿容積分?jǐn)?shù)（plasma volume fraction，Vp）（圖1）。同1 個(gè)AIF 重復(fù)測量3 次，取3 次測量的平均值為最終分析數(shù)據(jù)。

圖1 定量DCE-MRI

1.2.2 病理組織定位取材方法及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn) MRI 檢查后2 周內(nèi)經(jīng)手術(shù)取得完整瘤段，沿正中矢狀面剖開，選擇一側(cè)剖面取5 mm 厚度切片，并網(wǎng)格狀分割為若干1 cm×1 cm 組織塊，依次進(jìn)行編號(hào)、制備蠟塊、H&E 染色、CD34、VEGF 及HIF-1α 免疫組織化學(xué)染色（圖2，3）。由兩名分別具有5年和10年以上工作經(jīng)驗(yàn)的骨腫瘤病理醫(yī)師判讀H&E 及免疫組織化學(xué)染色切片，評(píng)估TNR、計(jì)數(shù)MVD，并判斷VEGF、HIF-1α表達(dá)情況。TNR 根據(jù)Huvos 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]分級(jí)，MVD采用Weinder 計(jì)數(shù)方法[12]，VEGF 及HIF-1α 表達(dá)結(jié)果判讀參考《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)》[13]。

圖3 組織樣本影像及病理表現(xiàn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s或M（P25%，P75%）表示；計(jì)數(shù)資料采用絕對值或百分比（%）表示。采用Shapiro-Wilk 和Levene 檢驗(yàn)樣本的正態(tài)性及方差齊性。采用Poisson 回歸及Logistic 回歸分析DCE-MRI 定量參數(shù)與MVD、VEGF、HIF-1α 的關(guān)系并繪制受試者工作特征曲線（ROC），計(jì)算診斷閾值、敏感度和特異性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理樣本一般情況及TNR、MVD、VEGF、HIF-1α 表達(dá)情況

獲取完整瘤段10 例，腫瘤最大徑為4.4～20.7 cm，平均11.3 cm；分割組織塊共取得病理樣本507 個(gè)，排除H&E 染色證實(shí)非腫瘤組織樣本47 個(gè)，共460 個(gè)有效病理樣本納入分析。根據(jù)Huvos 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]，TNRⅠ級(jí)346 個(gè)（75.2%），Ⅱ級(jí)55 個(gè)（12.0%），Ⅲ級(jí)32 個(gè)（7.0%），Ⅳ級(jí)27 個(gè)（5.8%）。反應(yīng)良好組（TNR≥90%）為Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)，共59 個(gè)（12.8%），反應(yīng)差組（TNR＜90%）為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)，共401 個(gè)（87.2%）。VEGF 陽性表達(dá)311 個(gè)（67.6%），陰性149 個(gè)（32.4%）。HIF-1α 陽性表達(dá)68 個(gè)（14.8%），陰性392 個(gè)（85.2%）。

2.2 病理樣本反應(yīng)良好組與反應(yīng)差組間DCE-MRI定量參數(shù)、MVD 計(jì)數(shù)、VEGF 及HIF-1α 表達(dá)情況比較

化療后，反應(yīng)良好組Ktrans、Kep、Ve、Vp均明顯高于反應(yīng)差組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。反應(yīng)良好組MVD 計(jì)數(shù)明顯高于反應(yīng)差組（Z/χ2=-4.067，P＜0.01)。反應(yīng)良好組VEGF 陽性率高于反應(yīng)差組，而HIF-1α 陽性率低于反應(yīng)差組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表2）。

表1 病理樣本反應(yīng)良好組與反應(yīng)差組間DCE-MRI 定量參數(shù)比較

表2 病理樣本反應(yīng)良好組與反應(yīng)差組間VEGF 及HIF-1a 比較 n（%）

2.3 DCE-MRI 定量參數(shù)與MVD 計(jì)數(shù)之間的關(guān)系

MVD 計(jì)數(shù)符合Poisson 分布，將lg（MVD）與DCE-MRI 定量參數(shù)帶入Poisson 回歸模型，經(jīng)逐步回歸篩選變量后，結(jié)果顯示Ktrans、Kep、Ve與MVD 具有相關(guān)性（均P＜0.01），其中Ktrans與MVD 呈負(fù)相關(guān)，Kep和Ve與MVD 呈正相關(guān)，回歸系數(shù)分別為-0.652、0.525、0.418；Vp與MVD 的相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 DCE-MRI 定量參數(shù)與VEGF、HIF-1α 表達(dá)之間的關(guān)系

利用Logistic 回歸模型分析DCR-MRI 定量參數(shù)與VEGF、HIF-1α 關(guān)系，結(jié)果顯示Ve預(yù)測VEGF、Kep預(yù)測HIF-1α 的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ve＞0.634 時(shí)，預(yù)測VEGF 表達(dá)陽性的AUC 為0.609，敏感性為63.7%，特異性60.0%（圖4A）；當(dāng)Kep＞0.115 min-1時(shí)，預(yù)測HIF-1α 表達(dá)陽性的AUC 為0.614，敏感性為42.2%，特異性83.3%（圖4B）。

圖4 定量DCE-MRI 參數(shù)ROC 曲線預(yù)測VEGF 和HIF-1α 表達(dá)效能

3 討論

腫瘤組織微循環(huán)、新生血管狀態(tài)、細(xì)胞壞死及乏氧性等腫瘤異質(zhì)性因素與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、療效等密切相關(guān)[3-4]。定量DCE-MRI 技術(shù)具有實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、可重復(fù)監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)，能夠有效的反映腫瘤血管的通透性和腫瘤組織的血液灌注并進(jìn)行定量評(píng)估，在腫瘤療效評(píng)價(jià)方面應(yīng)用廣泛[6-9]。

TNR 是評(píng)估骨肉瘤NAC 療效的病理學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”[5,11]。增殖活躍的腫瘤組織細(xì)胞排列密集，細(xì)胞外間隙小，新生血管豐富，不成熟微血管隨之增多，均導(dǎo)致微血管滲透性增高。因此，Ktrans、Ve、Vp值較高。隨著腫瘤生長、體積增大及化療藥物作用，腫瘤細(xì)胞壞死增多，微血管密度減小，血管外細(xì)胞外間隙增大，故Ktrans、Ve、Vp值降低，Kep值升高，本研究結(jié)果與既往研究一致[6-9,14]。Guo 等[15]對69 例接受NAC 的骨肉瘤患者研究表明，反應(yīng)良好組（TNR≥90%）DCEMRI 定量參數(shù)值隨化療進(jìn)展明顯下降，其中Ktrans、Vp值在化療反應(yīng)良好組和反應(yīng)差組中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），與本研究結(jié)果大致相同。因此，Ktrans和Ve預(yù)測骨肉瘤組織壞死情況具有意義。

腫瘤微血管生成及分布狀態(tài)與腫瘤增殖能力密切相關(guān)。MVD 能夠評(píng)估病灶內(nèi)微血管生成水平及分布情況。王東等[16]觀察70 例長骨成骨肉瘤發(fā)現(xiàn)，微血管分布體現(xiàn)了骨肉瘤異質(zhì)性，在腫瘤外周區(qū)，以軟組織腫瘤成分為主，細(xì)胞增殖活躍，微血管密度高；在腫瘤中央?yún)^(qū)，以骨性成分為主，微血管密度低，瘤骨細(xì)胞增殖受限。隨訪所有患者生存期繪制生存曲線，結(jié)果表明骨肉瘤患者M(jìn)VD 與生存率相關(guān)。本研究中觀察樣本塊切片可見相似情況，在實(shí)性成分為主的軟組織腫瘤區(qū)，MVD 值高，多數(shù)微血管形態(tài)成熟，畸變率低，而在骨樣組織為主的瘤骨及骨化中心區(qū)，MVD 值低，微血管分化程度低。Jia 等[6]發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中Ktrans與MVD 呈正相關(guān)（r=0.683，P＜0.001）。Liu 等[17]發(fā)現(xiàn)宮頸癌腫瘤組織MVD 較正常宮頸組織明顯升高，同時(shí)宮頸癌Ktrans、Kep、Ve值明顯高于正常宮頸組織。上述研究結(jié)果表明，定量DCE-MRI 在一定程度上能夠反映腫瘤微血管密度和分化程度。本研究中Ktrans與MVD 呈負(fù)相關(guān)，Kep、Ve與MVD 呈正相關(guān)，表明骨肉瘤組織樣本塊在微血管分布熱點(diǎn)區(qū)的微血管多高度分化，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，管壁不全、異形的微血管較少，致血管滲透性低。

VEGF 是腫瘤血管生成通路中最重要的啟動(dòng)誘導(dǎo)因子之一，不僅可促進(jìn)血管生成，而且還能催化腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移[4]。HIF-1α 表達(dá)升高在腫瘤缺氧的適應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用[3]。朱輝嚴(yán)等[18]研究乳腺癌DCEMRI 表現(xiàn)與VEGF 表達(dá)水平的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌VEGF 陽性表達(dá)率達(dá)80%，與乳腺癌MRI 邊緣毛刺（r=0.451，P=0.013）和早期邊緣強(qiáng)化（r=0.843，P=0.001）呈顯著正相關(guān)。韓文梅等[19]研究DCE-MRI診斷非小細(xì)胞肺癌及評(píng)估靶向藥物療效的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)DCE-MRI 診斷NSCLC 準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度分別高達(dá)98.08%、98.67%、83.33%；VEGF 陽性組患者最大強(qiáng)化率（maximum enhancement rate，MER）、強(qiáng)化斜率（slope of increase，Slope）水平均高于陰性患者（P＜0.05）；有效組患者M(jìn)ER、Slope 水平均高于無效組患者（P＜0.05）。譚建兒等[20]報(bào)道32 例膠質(zhì)瘤的HIF-1α 表達(dá)與Ktrans、Kep、Ve具有相關(guān)性（P＜0.05）。

雖然上述研究結(jié)果表明DCE-MRI 在腫瘤診斷及療效評(píng)估中均有較高價(jià)值，但DCE-MRI 大量的數(shù)據(jù)測量涉及ROI 的選取，大部分研究在腫瘤最大層面選取整個(gè)病灶作為感興趣區(qū)，未能將壞死、囊變、出血等區(qū)域剔除，并不能真實(shí)反映各區(qū)域腫瘤組織信息，這可能會(huì)影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性[6-9,14,18-19]。因此，本研究采用影像—病理位置匹配的方法，嚴(yán)格進(jìn)行影像感興趣區(qū)與病理樣本匹配，能夠更準(zhǔn)確反映每個(gè)病理組織塊TNR、MVD、VEGF 及HIF-1α 與定量參數(shù)之間的關(guān)系。本研究基于影像—病理對照結(jié)果提示DCE-MRI定量參數(shù)Kep、Ve評(píng)價(jià)骨肉瘤MVD、VEGF、HIF-1α有一定臨床價(jià)值，或可為骨肉瘤療效評(píng)估及臨床治療決策提供依據(jù)。

綜上所述，DCE-MRI 定量參數(shù)一定程度上能夠反映骨肉瘤腫瘤壞死、微循環(huán)血管生成及乏氧性，有望成為術(shù)前無創(chuàng)評(píng)估療效的方法。本研究也存在一定的局限性。首先，盡管位置匹配采集的大量組織樣本塊基本體現(xiàn)了腫瘤異質(zhì)性，但本研究為單中心研究，入組病例數(shù)較少，在反映人群個(gè)體化差別方面有所欠缺。其次，骨肉瘤骨化區(qū)域和軟組織區(qū)域在病理學(xué)形態(tài)和性質(zhì)方面有較大差別[21]，本研究未將二者區(qū)分開來，在結(jié)果反映上存在局限性。