活化的PPAR-γ對潰瘍性結腸炎大鼠Th細胞的調控研究

曹艷 程正位 程思

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是結腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，病變局限于大腸黏膜及黏膜下層[1]，特征是腸道炎癥反復和病程長，潰瘍性結腸炎發(fā)病原因及機制復雜，目前尚不明確，有研究認為該病是由遺傳、環(huán)境、免疫及精神心理等多種不同因素共同作用的結果，而免疫調節(jié)在該病中具有重要作用[2]。潰瘍性結腸炎的腸道病變不僅與上皮炎癥和壞死有關，也與上皮細胞過度凋亡有關，過氧化物酶體增生物激活受體-γ（peroxisome proliferator activated receptor-gamma， PPAR-γ）可能參與了潰瘍性結腸炎腸道炎癥的調控。近年來研究表明UC患者T細胞免疫失衡與其發(fā)病機制密切相關[3-4]。PPAR-γ屬于核激素受體超家族的亞族，為配體依賴性轉錄因子，近年發(fā)現，PPAR-γ廣泛表達于T細胞、B細胞等免疫細胞，參與機體的免疫調節(jié)。目前研究表明，PPAR-γ可通過參與調控Th1/Th2細胞分化而發(fā)揮免疫調節(jié)功能[5-6]。本文旨在研究配體活化的PPAR-γ對潰瘍性結腸炎模型大鼠T細胞免疫紊亂的調控作用，為UC的臨床治療提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

實驗動物（SD）大鼠60只（購自實驗動物中心），重量（200±20）g，酶標儀及IFN-γ、IL-4的ELISA試劑盒購自深圳達科為科技公司，TZD類藥物羅格列酮片為葛蘭素史克公司出品，4 mg/片；UC的陽性藥物柳氮磺吡啶（SASP）為上海三維制藥有限公司產品，0.25 g/片；三硝基苯磺酸（TNB）購自Sigma公司。

1.2 潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立

實驗模型建立及分組[7]：取實驗動物（SD）大鼠60只，其中50只應用三硝基苯磺酸（TNB）/乙醇方法制備大鼠潰瘍性結腸炎模型，實驗前禁食24 h，自由飲水，10%（w/v）水合氯醛腹腔麻醉（300 mg/kg），將TNB溶于500 ml/L乙醇至終濃度100 g/L，取塑料導管一根，術前石蠟油潤滑，從大鼠肛門中插入深度約8 cm，緩慢推注TNB/乙醇溶液，每只大鼠約0.3 ml，推注完畢后緩慢拔出硅膠管，以手壓迫肛門并抬高鼠尾。實驗設正常對照組（健康小鼠）、模型對照組、SASP處理組（SASP，100 mg/kg）、低劑量羅格列酮組（羅格列酮2 mg/kg）、中劑量羅格列酮組（羅格列酮4 mg/kg）、高劑量羅格列酮組（羅格列酮8 mg/kg），每組10只，SASP處理組每天給予SASP 100 mg/kg混懸液灌胃，不同劑量羅格列酮組分別每天給予羅格列酮2、4、8 mg/kg混懸液灌胃，正常對照組、模型對照組每天給予等體積生理鹽水3 ml/只灌胃，每天灌胃給藥1次，給藥時間從造模后第2天至實驗結束共10 d，每日觀察大鼠一般狀況及糞便性狀，記錄評分。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 疾病活動指數（DAI） DAI=體重下降分數+糞便性狀分數+便血分數。每日記錄各組動物體重和大便性狀，采用DAI對動物狀態(tài)進行綜合評分[8]。體重：不變?yōu)?分，比正常下降1%～5%為1分，下降6%～10%為2分，下降11%～15%為3分，下降15%以上為4分。大便黏稠度：正常為0分，松散的大便為2分，腹瀉為4分。大便出血：正常為0分，顯性出血為2分。

1.3.2 ELISA法檢測各組外周血中IFN-γ、IL-4的水平 在培養(yǎng)的最后1天（第10天）取大鼠尾靜脈血，并分離上清，采用ELISA法檢測血清中IFN-γ、IL-4水平，具體操作按試劑盒提供的說明書進行，每個樣本和標準品均設3個復孔，酶標測試儀450 nm處讀數，計算Th1型與Th2型細胞因子的比值IFN-γ/IL-4。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究數據采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行分析和處理，實驗結果以表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組DAI比較

與正常對照組比較，模型對照組與低劑量羅格列酮組DAI更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；SASP處理組和中、高劑量羅格列酮組與正常對照組DAI比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組DAI比較 [分，（±s）]

表1 各組DAI比較 [分，（±s）]

*與正常對照組比較，P<0.05；#與正常對照組比較，P>0.05。

組別 D A I正常對照組（n=1 0） 0.7 5±0.1 7模型對照組（n=1 0） 4.9 1±2.2 5*S A S P處理組（n=1 0） 0.8 4±0.2 1#低劑量羅格列酮組（n=1 0） 3.2 2±1.5 4*中劑量羅格列酮組（n=1 0） 0.8 8±0.2 7#高劑量羅格列酮組（n=1 0） 0.7 1±0.1 5#

2.2 UC大鼠模型經過藥物處理前后外周血中細胞因子的變化比較

模型對照組IFN-γ/IL-4高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），SASP處理組IFN-γ/IL-4與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；中、高劑量羅格列酮組IFN-γ/IL-4與正常對照組及SASP處理組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 UC大鼠模型處理組與正常對照組外周血細胞因子的檢測（±s）

表2 UC大鼠模型處理組與正常對照組外周血細胞因子的檢測（±s）

*與正常對照組比較，P<0.05；#與正常對照組比較，P>0.05。

IFN-γ/IL-4正常對照組（n=10） 13.40±6.22 19.26±5.12 0.70±0.21模型對照組（n=10） 20.42±7.54* 14.02±4.92* 1.46±0.51*SASP 處理組（n=10） 14.50±4.22# 18.20±5.76# 0.79±0.37#低劑量羅格列酮組（n=10） 18.42±6.54* 15.02±5.92* 1.16±0.41*中劑量羅格列酮組（n=10） 14.56±3.28# 19.70±4.16# 0.74±0.32#高劑量羅格列酮組（n=10） 13.56±3.28# 18.90±5.16# 0.73±0.23#組別 IFN-γ（pg/ml）IL-4（pg/ml）

3 討論

潰瘍性結腸炎是一種病因不明的結腸黏膜和黏膜下炎癥性疾病，重者可發(fā)生潰瘍。目前認為UC是多種因素，如遺傳、環(huán)境、免疫因素在具有遺傳易感性的宿主中通過異常黏膜免疫反應引起的。TNB類藥物誘導的結腸炎模型表達Th2型細胞因子，中性粒細胞浸潤局限于黏膜淺層，類似于人類UC，已廣泛應用于UC發(fā)病機制、藥物療效評價等研究。PPAR-γ屬于核激素受體超家族的亞族，為配體依賴性轉錄因子，主要有α、γ和δ/β三種亞型，其在脂代謝、糖代謝和腫瘤細胞的分化和凋亡中起重要作用。近年發(fā)現，PPAR-γ廣泛表達于T細胞、B細胞、NK細胞等免疫細胞，參與機體的免疫調節(jié)[9-11]。Th1和Th2細胞都是輔助T細胞，其通過分泌多種細胞因子使人體產生免疫應答[12]。Th1細胞主要分泌IL-2和IFN-γ，參與細胞免疫和遲發(fā)性超敏性炎癥反應；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，其可輔助B細胞分化為抗體分泌細胞，參與體液免疫應答。目前更有研究表明，PPAR-γ可通過參與調控Th1/Th2細胞分化而發(fā)揮免疫調節(jié)功能。但是活化的PPAR-γ在動物實驗中對UC的Th細胞的免疫調節(jié)作用尚不明確[13-15]。

在本次實驗中，通過構建了UC的大鼠模型，探討活化的PPAR-γ對UC模型大鼠外周血中Th1/Th2細胞分化相關細胞因子的影響。與正常對照組比較，模型對照組與低劑量羅格列酮組DAI更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），SASP處理組及中、高劑量羅格列酮組與正常對照組DAI比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），這為該實驗的合理性提供佐證。在經過藥物處理前后外周血中細胞因子的變化比較中，模型對照組Th1型與Th2型細胞因子的比值高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），SASP處理組IFN-γ/IL-4與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；中、高劑量羅格列酮組IFN-γ/IL-4與正常對照組、SASP處理組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示羅格列酮可通過激活PPAR-γ的活化，參與調控Th1/Th2細胞分化，從而發(fā)揮緩解結腸炎癥的作用，但具體的機制有待進一步研究。

目前，潰瘍性結腸炎的病例日益增多，臨床治療面臨困境，常規(guī)治療手段療效不佳或副作用多。活化的PPAR-γ可調節(jié)Th1/Th2細胞分化，且應用合成的PPAR-γ配體（TZD）治療一些自身免疫性疾病，具有療效好、副作用小、耗費低等優(yōu)點，從而有可能成為治療UC的有效藥物。因此本課題為闡明配體活化的PPAR-γ調節(jié)UC患者外周血Th1/Th2細胞分化的分子機制，為該藥應用于UC的臨床治療提供了實驗數據，同時還可為臨床上Th1/Th2細胞分化失衡的其他免疫調節(jié)失衡性疾病的治療提供了新靶點和手段[16]。