青海毛驢馬腺疫病原菌的分離鑒定

黃榮，索佳佳，高楠楠，沈秀英，朱偉，董建寶

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧81000；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊261061)

腺疫記載于我國唐代綜合性獸醫(yī)學(xué)著作《司牧安驥集》中“槽結(jié)”，是一種由C型鏈球菌屬馬鏈球菌馬亞種引起的急性接觸性馬屬動(dòng)物傳染病，是世界范圍內(nèi)最常見的馬屬動(dòng)物傳染病之一[1]。該病以馬屬動(dòng)物發(fā)熱、上呼吸道炎癥、喉囊和頭頸頜下淋巴結(jié)腫脹化膿破潰為主要特征，發(fā)病率高，傳染性強(qiáng)，幼駒死亡率較高[2]，感染后病原體很難被徹底清除[3]。

馬鏈球菌(Streptococcusequi)包括馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubspeciesequi,S.euqi)和馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus,S.zooepidemicus)[4]，馬鏈球菌馬亞種宿主特異性強(qiáng)，只感染馬屬動(dòng)物，在感染宿主時(shí)主要通過鼻腔和口腔兩個(gè)途徑[5]，經(jīng)口腔或鼻腔感染后侵襲扁桃體隱窩，短暫停留，感染后約3小時(shí)侵入頭頸頜下淋巴結(jié)，48小時(shí)可到達(dá)黏膜固有層[6]。該菌對(duì)外界環(huán)境適應(yīng)力較強(qiáng)，在水中可存活一周左右，在干燥的膿汁和鼻液中可存活數(shù)周，本菌不耐熱，普通消毒劑即可將其殺滅[7]。

截至目前，關(guān)于馬腺疫的報(bào)道大都為馬的感染，有關(guān)驢發(fā)生腺疫研究較少，且未見有關(guān)于青海毛驢發(fā)生腺疫的報(bào)道。本研究以發(fā)生腺疫的青海毛驢為研究對(duì)象，對(duì)引發(fā)腺疫的病原菌進(jìn)行分離鑒定，確定其致病菌為馬鏈球菌馬亞種，并對(duì)該菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，篩選出敏感藥物，為該病的預(yù)防和治療提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

使用棉拭子和細(xì)菌采樣管采集發(fā)生腺疫的青海毛驢的膿性鼻液或破潰的淋巴結(jié)膿汁。

1.2 主要試劑及儀器

營(yíng)養(yǎng)肉湯、5%綿羊血平板購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，DL2000 DNA Marker、Taq酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；細(xì)菌藥敏紙購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1病原分離純化與染色鏡檢

將無菌采集的病料分別涂片，進(jìn)行美藍(lán)染色鏡檢。病料分別劃線接種于5%綿羊血平板，37℃培養(yǎng)20h后，觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和鑒定。

1.3.2PCR鑒定及測(cè)序分析

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取所分離菌落的DNA。參考《馬腺疫檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 2977-2011)中的PCR診斷技術(shù)對(duì)所提取的DNA樣品進(jìn)行核酸PCR擴(kuò)增。使用Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)試劑盒，反應(yīng)體系為25μL，組成如下：Ex Taq 12.5μL，DNA模板2.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，超純水8μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳觀察，1%的瓊脂糖凝膠，電壓80V～100V，電流40mA～50mA，電泳30min～40min。使用QIAquick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒對(duì)陽性目的帶進(jìn)行回收，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行核苷酸測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析。

1.3.3藥敏試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)K- B紙片瓊脂擴(kuò)散法，將37 ℃培養(yǎng)16 h～18h生長(zhǎng)良好的分離菌液30 μL接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16h后，檢測(cè)分離菌株對(duì)青霉素、頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢西叮、氨曲南、多粘菌素B、紅霉素、麥迪霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素12種抗生素的敏感性，按照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 涂片鏡檢和分離培養(yǎng)

對(duì)采集鼻拭子和膿汁樣品進(jìn)行美藍(lán)染色鏡檢，顯微鏡視野可觀察到圓形或卵圓形球菌，少數(shù)成對(duì)多數(shù)呈鏈狀排列，幾個(gè)到幾十個(gè)球菌連成鏈(圖1)，5%綿羊血液瓊脂分離培養(yǎng)出現(xiàn)透明、中央微隆起、表面光滑、濕潤(rùn)黏稠的露珠樣小菌落，且呈現(xiàn)β型溶血，即在露珠樣菌落周圍形成界限分明、完全透明的溶血帶(圖2)。

圖1 樣品美藍(lán)染色鏡檢結(jié)果 圖2 血瓊脂平板培養(yǎng)呈現(xiàn)β溶血

2.2 PCR及測(cè)序結(jié)果

對(duì)分離純化的細(xì)菌提取DNA，進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示本研究所采集的腺疫樣品均為陽性(圖3)。將陽性目的帶進(jìn)行DNA回收純化和測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示PCR所擴(kuò)增目的帶的核苷酸序列為馬鏈球菌馬亞種的SeM基因的序列片段，確定所分離菌株為馬鏈球菌馬亞種。

圖3 樣品PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)本研究所分離的馬鏈球菌馬亞種進(jìn)行藥敏試驗(yàn)(K-B紙片瓊脂擴(kuò)散結(jié)果如表1)，結(jié)果顯示β-內(nèi)酰胺類藥物(青霉素和頭孢類)對(duì)分離株最為敏感。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

S表示敏感，R表示耐藥，I表示中介。

3 小結(jié)與討論

國際上對(duì)馬腺疫的研究主要集中在馬上，對(duì)驢發(fā)生腺疫的報(bào)道較少。2015年，F(xiàn)irew等人報(bào)道了埃塞俄比亞的驢發(fā)生馬腺疫，并對(duì)驢發(fā)生馬腺疫的臨床癥狀進(jìn)行了描述，對(duì)致病病原進(jìn)行了分離和鑒定[8]。而我國對(duì)驢發(fā)生馬腺疫的報(bào)道要遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于其他國家，張八軍于1990年首次報(bào)道了驢暴發(fā)馬腺疫的情況，并詳細(xì)記錄了驢發(fā)病的臨床癥狀、傳播方式、預(yù)防和治療方法等[9]。2018年以后，隨著規(guī)?；B(yǎng)驢的興起，規(guī)?；H場(chǎng)暴發(fā)腺疫的情況被陸續(xù)報(bào)道[10-12]，研究表明規(guī)?；H場(chǎng)各年齡段的驢均易感，但驢駒發(fā)病率和死亡率最高[2]，而且全國大部分的規(guī)?；H場(chǎng)都有腺疫的發(fā)生，防控形勢(shì)較為嚴(yán)峻。本研究對(duì)引起青海毛驢發(fā)生腺疫的病原進(jìn)行了分離鑒定，證實(shí)了馬鏈球菌馬亞種為致病原，并對(duì)所分離的菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。

在馬腺疫的治療方面，青霉素是目前公認(rèn)的首選藥物，而且截至目前尚未發(fā)現(xiàn)馬鏈球菌馬亞種的青霉素耐藥菌株。本研究對(duì)青海毛驢的分離株進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)顯示，青霉素和頭孢類藥物為敏感藥物，但在臨床使用過程中青霉素性價(jià)比較高，在綜合考慮的基礎(chǔ)上建議使用青霉素進(jìn)行治療。

馬腺疫是影響馬屬動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一，也是世界范圍內(nèi)最常見的馬屬動(dòng)物傳染病之一[1]，該病對(duì)馬屬動(dòng)物，尤其是幼齡馬屬動(dòng)物的感染率和致死率較高，嚴(yán)重威脅著馬屬動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。青海毛驢是一種以役用為主的小型品種，主要生活在青海地區(qū)，雖然個(gè)體矮小，但具有適應(yīng)高原艱苦的自然環(huán)境、抗病力強(qiáng)、耐粗飼和易管理等優(yōu)點(diǎn)，是非常具有地方特色的優(yōu)良品種。2021年1月13日，青海毛驢作為特色畜種，入選了國家畜禽遺傳資源委員會(huì)辦公室發(fā)布的《國家畜禽遺傳資源品種名錄(2021年版)》。近年來,青海毛驢的數(shù)量急劇減少，保護(hù)其品種資源變得非常重要，而在保種的過程中，疫病防控是重要的工作之一，馬腺疫應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。