西部旱區(qū)紫花苜蓿地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

丁成翔

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

西部旱區(qū)是我國(guó)主要的紫花苜蓿種植區(qū)，該地區(qū)光合有效輻射高、生長(zhǎng)季晝夜溫差大等氣候特點(diǎn)益于紫花苜蓿光合產(chǎn)物的形成和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，充足的水分供給可提高苜蓿草產(chǎn)量。土壤微生物作為重要的土壤肥力影響因素，加之高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征分析逐步納入土壤質(zhì)量評(píng)估中[1]。土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要功能，參與養(yǎng)分的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)[2]，不同土壤生境的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異，進(jìn)而影響土壤微生物功能。土壤養(yǎng)分影響土壤微生物生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，在糧食作物生產(chǎn)、草地生態(tài)系統(tǒng)已有較多研究例證[3]，區(qū)域氣候條件和海拔亦是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。王艷廷等[4]研究發(fā)現(xiàn)，土壤物理特性改善能增加土壤微生物活性和未培養(yǎng)的微生物種類；谷永建等[5]培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降水顯著改變了微生物量，從而影響闊葉林凋落物分解速率，同樣結(jié)果在草地生態(tài)系統(tǒng)也得到了驗(yàn)證[6]；周煜杰等[7]應(yīng)用文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)研究方法發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)類型土壤微生物群落的海拔分布規(guī)律不一致。當(dāng)前在大空間尺度對(duì)土壤微生物研究報(bào)道多為天然草地、林地和荒漠等，對(duì)人工種植的苜蓿地的報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)將從研究區(qū)環(huán)境因素、土壤特性等角度探索苜蓿地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，分析影響苜蓿地土壤微生物的關(guān)鍵因子，為苜蓿高產(chǎn)栽培技術(shù)與田間管理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)

研究區(qū)位于青海省烏蘭縣、內(nèi)蒙古鄂爾多斯鄂托克旗和甘肅肅南裕固族自治縣，所選試驗(yàn)點(diǎn)為當(dāng)?shù)刈匣ㄜ俎７N植地。烏蘭縣屬干旱大陸性氣候，平均海拔2960m，年平均氣溫3.5℃，年平均降雨量159.3～197.6mm，土壤類型為棕鈣土；鄂托克旗屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，平均海拔1365m，年平均氣溫6.4 ℃，年降水量為250mm，土壤類型為壤質(zhì)沙土；肅南屬高寒半干旱氣候，平均海拔1300m，年平均氣溫為3.6℃，年均降水量254.8mm，土壤類型為壤質(zhì)沙土。

1.2 樣品采集

采樣時(shí)間為2020年7月中旬，每個(gè)研究區(qū)紫花苜蓿核心種植地內(nèi)隨機(jī)選取6個(gè)采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)相隔500m，每個(gè)采樣點(diǎn)為1m×1m，使用直徑8cm的土鉆采用5點(diǎn)取樣法采集土樣，5個(gè)重復(fù)，采樣深度為0-20cm，取樣后將5個(gè)重復(fù)土樣混合均勻。土樣分為兩部分保存，一部分保存在4℃中用于理化性質(zhì)分析，一部分在-20℃保存用于高通量測(cè)序。此外，每個(gè)樣點(diǎn)用環(huán)刀采集部分土壤用于容重分析。

1.3 土樣分析

土壤理化性質(zhì)的測(cè)定指標(biāo)主要為土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、氨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷、速效鉀、含鹽量、含水量、容重、pH、土壤質(zhì)地(粘粒、粉粒、砂粒)以及導(dǎo)水率。

將原狀土置于150°C恒溫烘箱中，烘干6～8h到恒重，稱重測(cè)定其容重，每個(gè)測(cè)點(diǎn)容重為3個(gè)對(duì)照樣組的平均值。土壤質(zhì)地組成使用英國(guó)馬爾文Mastersizer2000激光粒度儀濕法測(cè)定，將土壤顆粒有效直徑按美國(guó)農(nóng)部制標(biāo)準(zhǔn)分三個(gè)等級(jí)：粘粒(<0.002mm,%)、粉砂(0.05～0.002mm,%)、砂粒(2～0.05mm,%)。土壤養(yǎng)分按照鮑士旦編著的農(nóng)化分析書測(cè)定[8]。

1.4 測(cè)序分析

樣品按照MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit 試劑盒提取樣品基因組DNA。以提取的樣品基因組DNA為模板針對(duì)微生物 16S rRNA基因V4區(qū)(515F 與 806R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過QIIME平臺(tái)去除原始序列中的低質(zhì)量序列，根據(jù)標(biāo)簽序列分開來自不同樣品的序列。利用Uchime軟件去除在PCR過程中形成的嵌合體，獲得的高質(zhì)量序列用 Usearch方法進(jìn)行聚類，以16S rRNA 基因序列97%相似度作為分類操作單元(operational taxonomic units, OTUs)的劃分標(biāo)準(zhǔn)。通過RDP分類鑒定OTU代表性序列的微生物分類相對(duì)豐度。方差分析(ANOVA)用SPSS Statistics 19.0完成。α和β多樣性采用vegan和picante包(R3.5.1)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同研究區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

如圖1a，在門分類水平上分析3個(gè)研究區(qū)土壤微生物群落組成，前10的細(xì)菌和古菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteriodetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)。在門水平上，不同研究區(qū)微生物分布差異較大，烏蘭縣研究地變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門豐度較高，鄂托克旗和肅南縣研究地放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門的豐度較高。如圖1b，在綱水平上， alpha變形菌門的豐度最高。表明不同研究區(qū)苜蓿種植地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖1 原核微生物門水平和綱水平分類群落組成

3個(gè)研究區(qū)土壤微生物總OTUs數(shù)為8361個(gè)。其中，共同擁有的OTUs數(shù)633個(gè)，占總OTUs的7.6%；特有OTUs數(shù)量最多的是肅南研究地土樣，2677個(gè)，占總OTUs的32%；最少的是烏蘭縣研究地土樣，1780個(gè)，占總OTUs的21.3%；烏蘭縣與鄂托克的共有OTUs數(shù)為12.2%，與肅南的共有OTUs為10.7%；鄂托克與肅南的共有OTUs數(shù)為14.4%。表明鄂托克與肅南的苜蓿種植地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)更為相似(圖2)。

圖2 不同研究地苜蓿地土壤微生物韋恩圖

2.2 alpha和beta多樣性分析

3個(gè)研究區(qū)苜蓿種植地土壤微生物Alpha多樣性指數(shù)分析表明，鄂托克旗土壤微生物香農(nóng)維納指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)均最高，烏蘭縣的alpha多樣性指數(shù)最低，且顯著低于鄂托克旗的多樣性指數(shù)，見圖3a、3b。

圖3 不同地區(qū)苜蓿土壤微生物alpha多樣性分析

對(duì)3個(gè)研究區(qū)苜蓿種植地的土壤微生物分別基于bray-curtis距離和weighted-unifrac距離進(jìn)行beta多樣性分析發(fā)現(xiàn)，不同研究區(qū)的土壤微生物在pCoA第一軸和第二軸上明顯分開，前兩軸總共可以解釋70.2%和72.7%的方差(圖4a、4b)。分別基于這兩種距離使用置換多元方差分析(PERMANOVA)，進(jìn)行999次置換后發(fā)現(xiàn)，3個(gè)研究區(qū)兩兩之間均有著顯著差異(表1)。

表1 beta多樣性的置換多元方差分析

2.3 氣候、海拔及土壤理化性質(zhì)分析

對(duì)3個(gè)研究區(qū)不同因子分析表明，各因子間均存在顯著差異。烏蘭縣海拔高于鄂托克旗和肅南縣；鄂托克旗土壤容重和粉粒占比高于其他兩個(gè)研究區(qū)，肅南的土壤粘粒和砂粒占比最高。在土壤養(yǎng)分方面，3個(gè)研究區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)無顯著差異，土壤全氮、全磷、有效磷、有效鉀、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量差異顯著；鄂托克旗土壤pH值相比最高(見表2)。

表2 不同地區(qū)環(huán)境因子

2.4 不同因子與土壤微生物的關(guān)系

由圖5可知，海拔和全氮是影響不同研究區(qū)苜蓿地土壤微生物alpha多樣性指數(shù)最關(guān)鍵因子。海拔與微生物多樣性指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，全氮與微生物多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)；全磷和速效鉀也與部分多樣性指數(shù)呈顯著相關(guān)。

圖5 土壤微生物alpha多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性分析

冗余分析發(fā)現(xiàn)，研究區(qū)各因子與72.5%的微生物群落變化緊密相關(guān)。其中，降雨量和微生物群落變化相關(guān)性最高，為0.67，顯著相關(guān)；其次分別為研究區(qū)海拔、土壤粉粒占比、土壤全磷含量、土壤砂粒占比和土壤粘粒占比等。相較于土壤化學(xué)因子，區(qū)域氣候、海拔及土壤物理因子對(duì)苜蓿地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響更深。

圖6 不同研究地各因子對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)冗余分析

表3 不同因子與土壤微生物群落的相關(guān)性分析

3 討論

紫花苜蓿因其較高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值在我國(guó)西部干旱區(qū)廣泛種植，種植區(qū)氣候條件以及海拔差異較大。3個(gè)研究區(qū)中，鄂托克旗苜蓿地土壤的微生物香農(nóng)維納多樣性指數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)均是最高；烏蘭縣苜蓿地的土壤微生物多樣性最低。相關(guān)性分析表明，苜蓿地土壤微生物alpha多樣性與海拔成顯著負(fù)相關(guān)，烏蘭縣地處青藏高原，海拔較高，其微生物豐富度和多樣性較低。王穎等[9]在高寒草甸研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤微生物多樣性隨海拔變化呈單峰型曲線；劉秉儒等[10]對(duì)賀蘭山林地土壤微生物多樣性研究發(fā)現(xiàn)，隨著海拔增加，微生物物種多樣性呈增加趨勢(shì)；厲桂香等[11]對(duì)微生物多樣性的海拔分布格局綜述認(rèn)為，不同生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)微生物海拔分布格局具有多種規(guī)律，呈線性、單峰型或無變化的特征。這表明，針對(duì)不同植被類型的生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物海拔分布特征需要結(jié)合區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)因子具體分析與解釋。除海拔因素外，土壤微生物alpha多樣性與土壤全氮含量顯著正相關(guān)，該研究結(jié)論很好的解釋了研究區(qū)烏蘭縣苜蓿種植地土壤全氮含量最低，其土壤微生物多樣性亦最低的原因。該結(jié)論與徐潤(rùn)宏等[12]在青藏高原的施氮試驗(yàn)結(jié)果相似，表明隨著氮沉降增加，土壤細(xì)菌多樣性顯著增加；吳勇等[13]在西北荒漠紫花苜蓿地施肥試驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)，土壤全氮含量與土壤微生物量呈顯著正相關(guān)。

與已有研究結(jié)果相似[14]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)門水平上，3個(gè)研究區(qū)苜蓿地土壤微生物相對(duì)豐度較高的分別為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門。由于不同種類土壤微生物對(duì)干旱脅迫的耐受性不同，本研究中變形菌門和放線菌門豐度最高，這與其較強(qiáng)的耐干旱能力有關(guān)[15]。綱水平分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)豐度較高的為alpha變形菌綱，原因是紫花苜蓿作為豆科類牧草，alpha變形菌綱是根瘤菌的優(yōu)勢(shì)類群之一[16]。

有研究表明，土壤理化性質(zhì)、海拔和區(qū)域氣候特征影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)研究區(qū)苜蓿地土壤共同具有的微生物OTUs數(shù)較少，小于總OTUs數(shù)的10%，說明 3個(gè)研究區(qū)特有的微生物OTUs數(shù)較多，大于總OTUs數(shù)的90%。同樣種植紫花苜蓿，不同地域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著，原因可能是區(qū)域之間差異較大的環(huán)境因子，說明相比于地上植物因子，氣候、海拔和土壤因子與土壤微生物關(guān)系更緊密；也有可能是由于研究區(qū)苜蓿地種植年限較短(<5a)，尚未對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成顯著的影響[18]。此外，冗余分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣候、海拔和土壤物理特征相比于土壤化學(xué)特征對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響更深。

4 結(jié)論

綜上所述，西部干旱區(qū)紫花苜蓿種植地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異顯著，地域海拔和土壤全氮含量是影響不同研究區(qū)苜蓿地土壤微生物多樣性關(guān)鍵因子，水分(降雨量)對(duì)苜蓿地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征有顯著的影響效果，土壤質(zhì)地相比土壤化學(xué)特征對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響更深，相互關(guān)系更緊密。