采用不同的血清學(xué)檢測(cè)法對(duì)羊布病檢測(cè)的對(duì)比

劉金錄，李生福，鐘衛(wèi)東，趙婧

(青海省民和縣畜牧獸醫(yī)站，民和 810800)

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌引起的人、畜共患傳染病，牛、羊、豬均可發(fā)病。臨床表現(xiàn)為生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起母畜流產(chǎn)，公畜睪丸炎、不育等。母畜流產(chǎn)后將大量布魯氏菌病隨著胎兒、胎水和胎衣排出，可通過污染的飼料、飲水經(jīng)消化道等途徑傳播。人主要通過與患病動(dòng)物、污染的動(dòng)物產(chǎn)品接觸而感染，感染后主要表現(xiàn)長期低熱、寒戰(zhàn)、盜汗、全身不適、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)痛、睪丸炎等，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)生產(chǎn)和人體健康，因此，國家將其列為法定傳染病，對(duì)種畜實(shí)施布病檢測(cè)，撲殺陽性畜[1]。近幾年來，部分地區(qū)牛羊布魯氏桿菌病呈高發(fā)、流行態(tài)勢(shì)，通過調(diào)運(yùn)引起布病流行并傳染于養(yǎng)殖者，民和縣養(yǎng)殖者發(fā)病數(shù)例，引起業(yè)務(wù)主管部門的高度重視，投入大批的人力、物力、財(cái)力于2020年11月對(duì)民和縣12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的養(yǎng)殖場(chǎng)(大戶)飼養(yǎng)的6964只羊進(jìn)行了布病檢測(cè)，對(duì)檢出的陽性羊進(jìn)行了撲殺[2,3]。為了快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)布病，筆者對(duì)養(yǎng)殖者感染布病的養(yǎng)殖場(chǎng)(大戶)的羊群采用三種不同的血清學(xué)檢測(cè)法進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)，篩選出適合縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室對(duì)布病檢測(cè)的最佳方法。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1羊 被檢6964只羊?yàn)榇阪?zhèn)、總堡鄉(xiāng)等12個(gè)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))的養(yǎng)殖場(chǎng)(大戶)所飼養(yǎng)的小尾寒羊及其雜種羊、其他羊。

1.1.2血清 采集羊頸靜脈血，分離血清，2℃～8℃保存，待檢。

1.1.3診斷試劑 布病虎紅平板凝集抗原(批號(hào)20200915)、布病試管凝集抗原(批號(hào)20191030)、布病試管凝集試驗(yàn)陰、陽性血清(批號(hào)20191030)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)；布魯氏桿菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(批號(hào)EB022006)由廣州悅洋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1布魯氏桿菌病按GB/T18464-2018執(zhí)行[4]采用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)分別對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.1虎紅平板凝集試驗(yàn) 取30μL的被檢血清與30μL的虎紅平板凝集抗原在一次性凹槽式布病檢測(cè)凝集板上混用，在5min內(nèi)出現(xiàn)凝集者，判為陽性。

2.1.2試管凝集試驗(yàn) 被檢血清按1∶25、1∶ 50、1∶100、1∶200稀釋，加布病凝集抗原0.5mL，混用，置37℃溫箱反應(yīng)24h,被檢血清1∶25出現(xiàn)“++”者判為可疑，1∶50及以上者出現(xiàn)“++”判為陽性。

2.1.3布魯氏桿菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試驗(yàn) 按布魯氏桿菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說明書執(zhí)行。

2.1.3.1樣品處理 將待檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清均稀釋20倍，將單克隆抗體稀釋50倍。

2.1.3.2操作步驟 將稀釋好的待檢血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清分別加入到抗原包被板中，每孔50μL，每孔再加單克隆抗體50μL,37℃孵育30min；洗板3次，拍干；每孔加入稀釋好的羊抗鼠酶標(biāo)抗體100μL，37℃孵育30min；洗板3次，拍干；每孔加入底物A和底物B按1∶1混合的底物100μL,室溫避光靜置顯色15min；每孔加入50μL終止液50μL,反應(yīng)終止后，15min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm。

2.1.3.3結(jié)果判定 計(jì)算抑制率，抑制率(PI)=(陰性對(duì)照OD450nm-待測(cè)樣品OD450nm)/陰性對(duì)照OD450nmX100%，當(dāng)樣品的PI≥30%時(shí)，為布魯氏桿菌病抗體陽性，當(dāng)樣品的PI<30%時(shí)，為布魯氏桿菌病抗體陰性。

3 結(jié)果

3.1被檢血清中布氏桿菌特異性抗體檢測(cè)結(jié)果見下表。

表 被檢血清中布氏桿菌特異性抗體檢測(cè)結(jié)果

3.2檢測(cè)羊血清218份，檢出布病陽性17份，陽性率為7.8%，這些羊群中都存在引進(jìn)種羊。

3.33種不同的血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)的結(jié)果符合率為100%。

4 分析與建議

4.13種不同的血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)的結(jié)果符合率為100%。布病虎紅平板凝集試驗(yàn)快速、準(zhǔn)確，可做大批量檢測(cè)；布病試管凝集試驗(yàn)準(zhǔn)確，檢測(cè)數(shù)量不受限制，但檢測(cè)時(shí)間長；布魯氏桿菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)準(zhǔn)確，但價(jià)格貴，且適宜一次做92份樣品，單個(gè)或數(shù)份樣品會(huì)造成試劑浪費(fèi)。因此，在人力財(cái)力匱乏的縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室大批量檢測(cè)時(shí)應(yīng)選擇布病虎紅平板凝集試驗(yàn)初檢，再用布病試管凝集試驗(yàn)確診為最佳。

4.2這3種血清學(xué)檢測(cè)方法均為檢測(cè)布魯氏桿菌病抗體，只能表明血清學(xué)檢測(cè)陽性，無法分清免疫抗體還是感染抗體，對(duì)于無免疫羊群可按感染抗體處理，對(duì)于免疫羊群必須進(jìn)行病原學(xué)診斷，因此，對(duì)于免疫羊群要加施免疫標(biāo)識(shí)，以免誤診。

4.3 本次檢測(cè)出較多的布病陽性羊只并且較集中，經(jīng)調(diào)查是引進(jìn)的種羊無法提供免疫、檢疫證明，屬于違法引進(jìn)。建議養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)要依法檢疫，引進(jìn)種羊時(shí)必須對(duì)布病實(shí)施檢測(cè)，否則不得引進(jìn)。

4.4由于本次大批量檢測(cè)是人感染布病后由衛(wèi)生部門反饋信息而知，故對(duì)養(yǎng)羊戶的羊群進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)而檢出布病陽性羊，因此提示獸醫(yī)部門要把好檢疫關(guān)，對(duì)引進(jìn)種羊及時(shí)檢測(cè)，淘汰陽性羊，平時(shí)做好布病檢測(cè)，由被動(dòng)檢測(cè)轉(zhuǎn)為主動(dòng)檢測(cè)，及時(shí)淘汰陽性羊。執(zhí)法部門要加大執(zhí)法力度，對(duì)違規(guī)調(diào)運(yùn)者進(jìn)行嚴(yán)格處罰。

4.5加大宣傳力度，使養(yǎng)殖者清楚掌握布病防控知識(shí)，布病是人畜共患病，應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)胎兒須進(jìn)行無害化處理，對(duì)污染的環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒。