自然發(fā)酵牦牛酸奶中乳酸菌的分離鑒定

金鑫燕，閆忠心

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

乳酸菌是一類革蘭氏染色呈陽性的桿菌或球菌，不形成芽孢，不運(yùn)動(dòng)，過氧化氫酶試驗(yàn)呈陰性，對(duì)葡萄糖發(fā)酵能產(chǎn)生50%以上乳酸，而且在缺少氧氣的環(huán)境中生長良好的兼性厭氧性細(xì)菌的總稱。在形態(tài)學(xué)上，主要包括乳酸桿菌和乳酸球菌屬兩個(gè)主要類群。乳酸菌在自然界中分布相當(dāng)廣泛，在土壤、植物根系和許多人類食品、動(dòng)物的飼料，還有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些臨床樣品中都發(fā)現(xiàn)有乳酸菌的存在[1]。乳酸菌能促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的分解和吸收、促進(jìn)乳糖吸收減少乳糖不耐受、調(diào)節(jié)體內(nèi)消化道的正常菌群、維持微生態(tài)平衡、使胃腸道健康、增強(qiáng)免疫功能[2-4]。乳酸菌廣泛用于乳制品、蔬菜和肉類產(chǎn)品的發(fā)酵和防腐中。許多乳酸菌除產(chǎn)生乳酸、乙酸、雙乙酰和過氧化氫外，還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌生物活性物質(zhì)，在抑制各種病原菌和食物腐敗等方面起重要作用[5，6]。

牦牛乳跟我國高寒牧區(qū)牧民生活息息相關(guān)。與普通牛乳相比，牦牛乳含有豐富的蛋白質(zhì)、必需氨基酸、脂肪、乳糖和礦物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值[7]，其礦物質(zhì)易被人體吸收和利用[8，9]。同時(shí)，傳統(tǒng)牦牛酸奶微生物菌群能夠產(chǎn)生多種對(duì)人身體健康有益的物質(zhì)如維生素、氨基酸等，彌補(bǔ)了牧民對(duì)必須氨基酸、維生素及礦物質(zhì)攝入的不足，平衡了牧民的飲食結(jié)構(gòu)[10]。牧民沿用傳統(tǒng)方法加工牦牛酸奶和牦牛酥油等乳制品，較好地保存當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的有益微生物(特別是乳酸菌)[11]。有研究表明，傳統(tǒng)牦牛酸奶來源的乳酸菌具有抗氧化作用與清除氧自由基能力[12-14]。因此，發(fā)酵牦牛酸奶是乳酸菌的資源寶庫，通過分離出牦牛酸奶中的乳酸菌，對(duì)其菌種進(jìn)行分離鑒定，將為牦牛酸奶的商品開發(fā)提供研究基礎(chǔ)[15-17]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采自青海省海北藏族自治州海晏縣、黃南藏族自治州澤庫縣及同仁市3個(gè)不同地區(qū)當(dāng)?shù)鼐用褡匀话l(fā)酵的牦牛酸奶。

1.2 試劑及耗材

試驗(yàn)試劑：生理鹽水、MRS(Man Rogosa Sharpe broth)培養(yǎng)基、結(jié)晶紫染色液、革蘭氏碘液、沙黃復(fù)染液、茚三酮溶液、75%酒精、蒸餾水。

試驗(yàn)耗材：無菌均質(zhì)袋、無菌試管、微量移液器及配套吸頭、無菌錐形瓶等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品的采集

將采集好的牦牛酸奶移至于無菌的密封袋內(nèi)封口，標(biāo)記采集地名稱、序號(hào)、奶源等信息后迅速放入裝有冰袋的冰盒內(nèi)。隨時(shí)更換冰袋，將牦牛酸奶保持在低溫的環(huán)境下帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行乳酸菌的分離培養(yǎng)。

1.3.2乳酸菌的分離純化及鑒定

1.3.2.1準(zhǔn)備工作 將樣品用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋后，分別吸取0.1mL傾注于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，用涂布棒在MRS瓊脂平板進(jìn)行表面涂布，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。然后放入36℃±1℃恒溫厭氧環(huán)境中培養(yǎng)72±2h。

1.3.2.2乳酸菌的純培養(yǎng) 準(zhǔn)備工作：取出第一次培養(yǎng)的平板，觀察菌落是否形成后，使用接種環(huán)挑取有透明環(huán)的、大小、形狀、顏色不同的單個(gè)菌落，分區(qū)劃線在滅菌MRS瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃厭氧條件下培養(yǎng)48h，進(jìn)一步純化菌株。待平板上菌落形成后，在光線充足的地方觀察平板中的菌落是否為單一、相同的菌落，如有不同菌落，繼續(xù)分離純化。直到培養(yǎng)基表面生長的全部為單一、相同的菌落時(shí)，對(duì)菌株進(jìn)行編號(hào)，并記錄顏色、大小、表面突起程度等特征。

1.3.2.3乳酸菌的形態(tài)學(xué)鑒定 用接種環(huán)挑取適量生長良好的分離株菌落，涂片、固定于載玻片上，放置待冷后進(jìn)行革蘭氏染色。在顯微鏡下仔細(xì)觀察和記錄細(xì)胞染色情況、細(xì)胞形態(tài)和分散情況。在鏡檢觀察時(shí)紫色或藍(lán)紫色呈陽性反應(yīng)，紅色為陰性反應(yīng)。

1.3.2.4乳酸菌的生化鑒定 利用生化鑒定試劑盒(蔗糖發(fā)酵管、纖維二糖發(fā)酵管、麥芽糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、水楊苷發(fā)酵管、山梨醇發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、七葉苷發(fā)酵管、棉子糖發(fā)酵管、1%馬尿酸鈉發(fā)酵管)對(duì)從中分離到的乳酸菌進(jìn)行菌種的鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌分離鑒定結(jié)果

2.1.1乳酸菌菌落形態(tài)特征

從三個(gè)地區(qū)不同樣品中分離出10株乳酸菌。培養(yǎng)基的菌落形態(tài)主要呈現(xiàn)出表面光滑，中部稍微凸起或平坦、邊緣整齊的白色菌落，以及菌落中間凸起或平坦、具有粗糙的表面，以及具有邊緣不整齊的乳白色菌落。各菌株的具體形態(tài)見圖1-圖3，特征見表1。

圖 1 海晏縣牦牛乳奶乳酸菌形態(tài)特征

圖 2 同仁縣牦牛酸奶乳酸菌形態(tài)特征圖

圖3 澤庫縣牦牛酸奶乳酸菌形態(tài)特征圖

表1 乳酸菌的形態(tài)特征

2.1.2乳酸菌鏡檢結(jié)果

乳酸桿菌部分彎曲，分布不規(guī)則。乳酸鏈球菌排列成圓形簇狀。

從鏡檢結(jié)果圖4來看，1為桿狀，2、3、4均為鏈球狀。

圖4 海晏縣牦牛酸奶中乳酸菌鏡檢結(jié)果

從鏡檢結(jié)果圖5來看，1、3、4均為桿狀，2為鏈球狀。

圖5 同仁市牦牛酸奶中乳酸菌鏡檢結(jié)果

從鏡檢結(jié)果圖6來看，1、2均為鏈球狀。

圖6 澤庫縣牦牛酸奶中乳酸菌鏡檢結(jié)果

2.1.3乳酸菌生化鑒定結(jié)果

生化鑒定管在37℃下培養(yǎng)24h以后結(jié)果如表2所示。

表2 發(fā)酵管生化鑒定

經(jīng)過生化鑒定發(fā)酵管試驗(yàn)，結(jié)合各乳酸菌鏡檢結(jié)果圖得出表2，從三個(gè)地區(qū)不同樣品中分離出10株乳酸菌。其中4株為桿菌分離株和6株球菌分離株。海晏縣樣品菌種有干酪乳桿菌干酪亞種L.caseisubsp.casei和嗜熱鏈球菌S.thermophilus，同仁市樣品中的菌種有嗜酸乳桿菌L.acidophilus、嗜熱鏈球菌S.thermophilus和羅伊氏乳桿菌L.reuieri，澤庫縣樣品中的菌種為嗜熱鏈球菌S.thermophilus。

3 討論

3.1 其他動(dòng)物酸奶制品中乳酸菌群組成分析

孟和畢力格等從內(nèi)蒙古采集的10份雙峰駝酸奶和1份新鮮駝奶中分離得出30株乳酸菌，分別歸屬于乳桿菌屬，乳球菌屬，腸球菌屬和明串珠菌屬等14種：德氏乳桿菌乳亞種、植物乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、干酪乳桿菌假植物亞種、發(fā)酵乳桿菌、彎曲乳桿菌、香腸乳桿菌和嗜酸乳桿菌群的菌株；乳酸球菌乳亞種、糞腸球菌、鳥腸球菌和堅(jiān)強(qiáng)腸球菌；腸膜明串珠菌葡聚糖亞種和腸膜明串珠菌腸膜亞種。其中桿菌16株，球菌14株[18]。賈旭等從內(nèi)蒙古采集了35份山羊奶及奶制品樣品分離出31株乳酸菌。并表明在新鮮山羊奶、山羊酸奶和稀奶油中均能分離得到乳酸菌，這些菌分別歸屬于乳桿菌屬、腸球菌屬和乳球菌屬3個(gè)屬8個(gè)種，乳酸桿菌為20株，乳酸球菌為11株[19]。該地區(qū)乳酸桿菌比乳酸球菌豐富，這是分離菌株在溫差較大的環(huán)境中長期適應(yīng)的結(jié)果。由于季節(jié)變化和包內(nèi)生活做飯加熱導(dǎo)致包裝內(nèi)溫度變化特別大，從而導(dǎo)致了從內(nèi)蒙古牧區(qū)分離到的乳酸桿菌具有了生長溫度范圍廣的特點(diǎn)。

3.2 青海地區(qū)牦牛酸奶樣品中乳酸菌群組成分析

羅毅皓等從青海大通、剛察、共和、玉樹地區(qū)的牦牛酸奶樣品和酥油樣品中分離出來的乳酸菌，分別是嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、菌種為干酪乳桿菌干酪亞種或鼠李糖乳桿菌。牦牛酸奶樣品的主要優(yōu)勢(shì)菌是乳酸桿菌和鏈球菌，除玉樹樣品中唾液鏈球菌嗜熱亞種較多外，而其他3個(gè)地方牦牛酸奶樣品都是乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，有少量唾液鏈球菌嗜熱亞種和極少量其他種菌類[20]。本試驗(yàn)從青海海晏、同仁和澤庫3個(gè)不同地區(qū)采集到的牦牛酸奶樣品中分離到4株乳桿菌和6株乳酸球菌。海晏和同仁樣品中乳酸球菌是優(yōu)勢(shì)菌，同仁市樣品中乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。

3.3 影響牦牛酸奶中微生物種類和數(shù)量的環(huán)境因素

自然發(fā)酵牦牛酸奶中微生物的種類和數(shù)量與其生存和分離環(huán)境密切相關(guān)。地理、地形、氣候等自然環(huán)境因地區(qū)而異，少數(shù)民族牧民在生產(chǎn)牦牛酸奶時(shí)使用的方法也不同，如發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、制作方法、牧民生活習(xí)慣、擠奶器具和發(fā)酵容器等。這使不同地區(qū)不同自然發(fā)酵牦牛酸奶制品中分離的乳酸菌種類及優(yōu)勢(shì)菌群存在一定差異。

4 結(jié)論

從海晏、澤庫、同仁三個(gè)地區(qū)牦牛酸奶樣品中分離出10株乳酸菌。其中4株為桿菌分離株和6株球菌分離株。海晏縣樣品菌種有干酪乳桿菌干酪亞種L.caseisubsp.casei和嗜熱鏈球菌S.thermophilus，同仁市樣品中的菌種有嗜酸乳桿菌L.acidophilus、嗜熱鏈球菌S.thermophilus和羅伊氏乳桿菌L.reuieri，澤庫縣樣品中的菌種為嗜熱鏈球菌S.thermophilus。研究結(jié)果為青海地區(qū)牦牛乳酸菌資源數(shù)據(jù)庫的豐富提供了依據(jù)。