白藜蘆醇通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路協(xié)同5-氟尿嘧啶對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用

崔勇和，沈先敏

（湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院，襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，襄陽(yáng) 441021）

結(jié)腸癌是全球第3位常見(jiàn)的惡性腫瘤，病死率較高[1]。針對(duì)每位患者腫瘤類(lèi)型、分期及身體健康情況，其治療方法的選擇也有較大差異。目前，結(jié)腸癌最常見(jiàn)的治療方法包括手術(shù)、放療和化療[2]。然而，每種治療方式都存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)、益處和不良反應(yīng)，從而迫切需要開(kāi)發(fā)治療該疾病的新策略。

5-氟尿嘧啶（5-FU）是極其常見(jiàn)治療結(jié)腸癌的化療藥物之一[3]。5-FU作為一種常見(jiàn)抗腫瘤藥物，也存在耐藥現(xiàn)象[4]。因此，5-FU與其他藥物聯(lián)合使用，可以提供一種更有效的方法，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性，同時(shí)降低對(duì)正常細(xì)胞的毒性。

白藜蘆醇（RES）是一種植物抗毒素，存在于多種植物中（如葡萄、花生和漿果）；已有證據(jù)表明，RES可以防治多種疾病，包括結(jié)腸炎和結(jié)腸癌[5-6]。已有研究指出RES可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路降低肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[7]。本實(shí)驗(yàn)嘗試在體外研究5-FU聯(lián)合RES對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的抗腫瘤活性，并觀察其作用的分子機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及試劑 RES購(gòu)自Sigma公司，批號(hào)：492-37-10；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自英國(guó)Gibco公司；CCK8試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：WST-8；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于武漢巴菲爾生物有限公司，批號(hào)：C1062S；p-p85、p-110β、p-PDK1、p-Akt、Akt、Cle-caspase 9、Cle-caspase 7 和 Cle-PARP 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 結(jié)腸癌SW620細(xì)胞來(lái)源于武漢巴菲爾生物有限公司，采用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%FBS、1%的100U/mL青霉素和100g/mL鏈霉素）孵育細(xì)胞，培養(yǎng)溫度37℃、CO2濃度為5%。待細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底的90%左右，便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，RES處理細(xì)胞濃度為 5、10、20、40 μmol/L，5-FU 處理細(xì)胞濃度為25、50、100、150 μmol/L，RES 和 5-FU 聯(lián)合處理濃度分別為40、50 μmol/L，干預(yù)細(xì)胞時(shí)間為24 h。

1.3 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞一遍，每孔加入10 μL的CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度OD值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=藥物組OD值/對(duì)照組A值×100%。

1.4 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。并隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算平均值作為細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，PBS清洗2次，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞（按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞3次，裂解、超聲破碎、12 000 r/min離心12 min后收集上清（離心半徑=20 cm），BCA試劑盒測(cè)定上清蛋白濃度。每個(gè)樣本上樣50 μg進(jìn)行凝膠電泳，待蛋白完全分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。結(jié)束后加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h后，分別加入對(duì)應(yīng)一抗抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）4℃反應(yīng)過(guò)夜。次日TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶3000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min，以ECL試劑顯影后進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析。

1.7 PI3K抑制劑LY294002對(duì)SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔板，將細(xì)胞分為對(duì)照組、LY294002 （2 μmol/L）、RES+5-FU 組和LY294002+RES+5-FU組。首先采用LY294002預(yù)處理SW620細(xì)胞8 h，然后采用40 μmol/L的RES和50 μmol/L的5-FU處理細(xì)胞24 h，最后檢測(cè)細(xì)胞活力、克隆數(shù)及凋亡率。

1.8 PI3K過(guò)表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔板，將細(xì)胞分為對(duì)照組、PI3K mimics組、RES+5-FU組和PI3K mimics+RES+5-FU組。將PI3K mimics質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞16 h，然后采用 40 μmol/L的RES和 50 μmol/L的 5-FU 處理細(xì)胞24 h，最后檢測(cè)細(xì)胞活力、克隆數(shù)及凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RES增強(qiáng)5-FU對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度 RES（5～40 μmol/L）處理 SW620 細(xì)胞24h，各濃度藥物均能夠明顯抑制細(xì)胞活力（P<0.05），見(jiàn)圖1A。然后采用不同 5-FU（25～150 μmol/L）與40 μmol/L的RES共同處理SW620細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)5-FU處理組比較，不同濃度5-FU+RES組中SW620細(xì)胞活力均明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖1B。另外，SW620細(xì)胞克隆檢測(cè)表明，單獨(dú)RES（40μmol/L）、單獨(dú) 5-FU（50 μmol/L）和 RES+5-FU 聯(lián)合處理均能明顯減少SW620細(xì)胞克隆數(shù)（P<0.05），并且RES+5-FU組相比于RES組和5-FU組細(xì)胞克隆數(shù)也顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖1C、1D。

圖1 RES和5-FU聯(lián)合處理對(duì)SW620細(xì)胞活力和克隆的影響Fig.1 Effects of RES and 5-FU combination on the ability and colonies of SW620 cells

2.2 RES增強(qiáng)5-FU對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 與對(duì)照組比較，RES組、5-FU組和RES+5-FU組SW620細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES組和5-FU組SW620細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP表達(dá)水平則明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 RES和5-FU聯(lián)合處理對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of RES and 5-FU combination on the apoptosisof SW620 cells

2.3 RES和5-FU聯(lián)合處理對(duì)SW620細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，RES組、5-FU組和RES+5-FU組SW620細(xì)胞中PI3K亞基p85、110β和PDK1及Akt磷酸化水平顯著降低（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES組和 5-FU組SW620細(xì)胞中p85、110β和PDK1及Akt磷酸化水平則明顯升高（P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 RES和5-FU聯(lián)合處理對(duì)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響Fig.3 Effects of RES and 5-FU combination on the transduction of PI3K/Akt pathway

2.4 PI3K抑制劑LY294002對(duì)SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組比較，LY294002組、RES+5-FU組和RES+5-FU+LY294002組SW620細(xì)胞活力和克隆數(shù)明顯降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與RES+5-FU組比較，RES+5-FU+LY294002組SW620細(xì)胞活力和克隆數(shù)明顯降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 LY294002處理SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of LY294002 on the growth of SW620 cells

2.5 PI3K過(guò)表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組比較，PI3K mimics組SW620細(xì)胞活力和克隆數(shù)顯著升高（P<0.05），RES+5-FU組和RES+5-FU+PI3K mimics組SW620細(xì)胞活力和克隆數(shù)顯著降低，而細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。與RES+5-FU組比較，RES+5-FU+PI3K mimics組SW620細(xì)胞活力和克隆數(shù)明顯升高，而細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 PI3K過(guò)表達(dá)對(duì)SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of PI3K overexpression on the growth of SW620 cells

3 討論

5-FU作為結(jié)腸癌臨床化療的一線(xiàn)藥物，有效的提高了總體生存率。然而，5-FU治療也存在嚴(yán)重的局限性，如廣泛的腫瘤耐藥和毒性，導(dǎo)致治療效果受到限制，迫切需要提高其化療的效果。

已有研究指出，RES具有抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和促凋亡的作用，還可以通過(guò)靶向多條信號(hào)通路治療胃腸道腫瘤[6]。本項(xiàng)研究主要探討結(jié)腸癌SW620細(xì)胞對(duì)RES和5-FU聯(lián)合治療的反應(yīng)。研究已證實(shí)5-FU和RES分別能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[8]，但是聯(lián)合作用抗結(jié)腸癌的活性尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，RES和5-FU增強(qiáng)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是通過(guò)同時(shí)調(diào)節(jié)Caspase/PARP和PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。該研究證實(shí)RES增強(qiáng)了人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU化療的敏感性，并考察了其聯(lián)合作用潛在的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為天然化合物輔助治療提高腫瘤化療藥物療效的依據(jù)，并支撐RES和5-FU的協(xié)同作用。

流式細(xì)胞術(shù)分析表明，RES和5-FU對(duì)SW620細(xì)胞毒性的增強(qiáng)作用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序性死亡是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展和組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生物學(xué)過(guò)程[9]。caspase信號(hào)途徑的激活是細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)，其中細(xì)胞色素c從線(xiàn)粒體膜間隙釋放至細(xì)胞質(zhì)中是caspase依賴(lài)性凋亡通路的前提。釋放的細(xì)胞色素c可與ATP結(jié)合，并與pro-caspase 9結(jié)合形成凋亡小體，從而切斷caspase 9前體，激活效應(yīng)因子caspase 3[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，RES顯著增強(qiáng)5-FU介導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶Cle-caspase 9、Cle-caspase 7和Cle-PARP的激活作用。因此，結(jié)果提示5-FU和RES聯(lián)合抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與caspase依賴(lài)性凋亡通路的激活有關(guān)。

PI3K/Akt信號(hào)通路與多種腫瘤的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，抑制其激活已被證實(shí)能阻斷生存信號(hào)通路，加速腫瘤細(xì)胞的死亡[11-12]。針對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路及其相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)分子的有效靶向作用，有望成為腫瘤治療的重要方式。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RES和5-FU聯(lián)合處理可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路。另外，PI3K抑制劑干預(yù)可部分促進(jìn)RES和5-FU介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，而PI3K過(guò)表達(dá)則部分降低對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。然而，早期已有相關(guān)報(bào)道指出RES可通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低髓核細(xì)胞凋亡[13-14]。該結(jié)論與本研究結(jié)果不一致的主要原因是，PI3K/Akt在不同細(xì)胞類(lèi)型中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)不同，并且RES可通過(guò)不同途徑去調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)的生物學(xué)行為。

綜上所述，RES通過(guò)增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤細(xì)胞增殖及促其凋亡活性，協(xié)同5-FU抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RES協(xié)同5-FU對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的抑制作用，可以通過(guò)同時(shí)靶向caspase/PARP和PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為RES協(xié)同5-FU治療結(jié)腸癌的分子機(jī)制提供了新見(jiàn)解，并表明這種組合干預(yù)可能成為結(jié)腸癌治療的一種更有效方法。