HPLC法測定9種飲料中阿斯巴甜含量研究①

夏秋霞, 王 晴, 張東京, 姚 坤, 李宛蓉, 趙 國

(宿州學院生物與食品工程學院,安徽 宿州234000)

0 引 言

阿斯巴甜常被用來代替蔗糖,添加到飲料、泡菜和罐頭等食品中[1-3]。可是現(xiàn)今食品商標中對阿斯巴甜的標注混亂,有的甚至不標注,容易造成苯丙酮尿癥意外消耗阿斯巴甜[4]。消費者超量或者過量食用阿斯巴甜會對自身健康造成一定危害[5]。研究表明阿斯巴甜與氧化應激、炎癥和肝臟損傷有關,長期服用可導致小鼠肝臟纖維化、炎癥小體激活和葡酮生成障礙[6]。研究報道HPLC法可以用來測定碳酸飲料[7]、酸奶[8]、筍制品[9]和檳榔[10]等食品中阿斯巴甜含量,實驗采用HPLC法對市場中9種飲料樣品中阿斯巴甜測定,優(yōu)化色譜條件,為今后阿斯巴甜的檢測和與此相關的研究提供了一定的理論參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

9種飲料均購于當?shù)爻?按順序依次編號1-9;阿斯巴甜標準品(純度＞99.8%)購于中國藥品生物制品檢定所、甲醇、乙醇等均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

高效液相色譜儀Agilent(安捷倫科技(中國)有限公司);數(shù)控超聲波清洗器KQ5200D型(昆山市起聲儀器有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 阿斯巴甜標準曲線的測定[11]

取阿斯巴甜標準品配制5.0μg/m L、10.0μg/m L、25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L的 標 準 使 用溶液系列,經過濾測定,得到標準線性回歸方程是

1.3.2 飲料中阿斯巴甜的提取[12-14]

碳酸類飲料:稱取5g(精確到0.001g)碳酸飲料樣品,在40℃水浴,超聲5min,經定容離心,過濾測定。果味類飲料:稱取2g(精確到0.001g)果味飲料試樣,定容和混勻后同碳酸飲料。乳味類飲料:稱取5g(精確到0.001g)乳味飲料試樣,加入10m L乙醇,混勻靜置1min,離心過濾,沉淀洗滌離心后過濾測定。

1.3.3 色譜條件實驗

取10.0μg/m L標準使用溶液,過濾進樣測定10次,流動相甲醇百分含量分別為35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%;柱溫為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃;流速為0.4m L/min、0.6m L/min、0.8m L/min、1.0m L/min、1.2m L/min、1.4m L/min、1.6m L/min;波長 為204nm、206nm、208nm、210nm、212nm、214nm、216nm,進樣測定。

1.3.4 含量的計算方法

式中:X樣為品中阿斯巴甜的含量(mg/kg);ρ為阿斯巴甜的濃度(μg/m L);V為定容體積(m L);m為樣品質量(g);

1.3.5 實驗質量控制

(1)精密度實驗:取10.0μg/m L標準液,經超聲過濾后測定6次,記錄每次測量結果。

(2)穩(wěn)定性實驗:取5份20.0μg/m L標準液,按順序編號1-5,分別放置在室溫陰涼處1h、2h、3h、4h、5h后超聲過濾后測定。

(3)加標回收實驗:在處理樣品的同時每個編號再額外稱取兩份等量樣品,加入阿斯巴甜標準使用液,1-9編號樣品加標濃度分別7.00mg/L、7.00mg/L、7.00mg/L、10.0mg/L、10.0mg/L、10.0mg/L、13.0mg/L、13.0mg/L、13.0mg/L進 樣 測定其實際濃度并計算回收率。

2 結果分析

2.1 阿斯巴甜的標準曲線

2.2 色譜條件分析結果

2.2.1 甲醇百分含量結果分析

由圖1可知:當甲醇含量在35%～44%范圍時,檢測峰面積先增大后緩慢降低,在流動相甲醇百分含量為39%時達到最大5.57,根據標準曲線可知峰面積與阿斯巴甜濃度成正比,即甲醇百分含量為39%時,阿斯巴甜有最大吸收。所以實驗流動相甲醇百分含量選用39%。

圖1 甲醇百分含量對峰面積的影響

2.2.2 柱溫結果分析

由圖2可知:從5℃至30℃隨著柱溫的增大,峰面積也不斷增大,在30℃達到最大5.5m AU*min;從30℃至35℃隨柱溫增大,峰面積反而減小。出現(xiàn)這種情況可能是因為柱溫增大的同時,不僅峰面積會增大,色譜柱中的分子擴散效應也會增加,而劇烈的擴散效應并有礙于待測組分的分離。所以實驗的最適柱溫應為30℃。

圖2 柱溫對峰面積的影響

2.2.3 流速結果分析

由圖3可知:在流速為0.4m L/min至0.8m L/min時,峰面積隨流速增大而增大;在流速為0.8m L/min至1.6m L/min時,峰面積隨流速增大而減小,當流速為0.8m L/min時,峰面積最大5.3m AU*min。由此知道當其他條件不變時,峰面積并非與流速成正比。主要原因可能是流速增大,管道中的渦流效應也相應增加,而一定的渦流效應會影響樣品組分的分離和檢測器的信號采集,從而影響峰面積。

圖3 流速對峰面積的影響

2.2.4 檢測波長結果分析

由圖4可知:在204nm至210nm時,峰面積逐漸增大由4.96m AU*min增到5.60m AU*min;在208nm至216nm時,峰面 積 減 小 至4.95m AU*min,圖中波長在208nm-210mn處,圖像較為平緩,說明此波段內,阿斯巴甜有最大吸光度,所以實驗最適檢測波長應在此波段內選取,經綜合考慮,實驗選取210nm為實驗檢測波長。

圖4 檢測波長對峰面積的影響

2.3 樣品測定結果

由圖5中可知:1-9號樣品中阿斯巴甜含量均未超標,其中被測組分中3號測定含量最大,為0.202mg/kg,4號組分未檢出。若按飲料類別來看:編號1、2、3是碳酸飲料類,其平均含量為0.148mg/kg;編號4、5、6是果味飲料類,其平均含量為0.024mg/kg;編號7、8、9是乳味飲料類,平均含量為0.079mg/kg,含量關系:碳酸飲料類＞乳味飲料類＞果味飲料類。由此推測在市場中飲料中的用量使用滿足:碳酸飲料類＞乳味飲料類＞果味飲料類,主要因素與阿斯巴甜的性質有關,但猜想是否成立還需要進一步探究和驗證。

圖5 阿斯巴甜含量分布圖

2.4 精密度實驗結果分析

由表1可知:精密度實驗得出6組峰面積數(shù)值,對其進行數(shù)據處理計算數(shù)據之間的RSD值為1.233,符合實驗質量控制要求,同時表明儀器進樣穩(wěn)定,對樣品色譜峰面積測定靈敏。

表1 精密度實驗結果

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2.5 穩(wěn)定性實驗結果分析

由表2可知,從2h到12h時,峰面積隨放置時間稍有增加。造成這種現(xiàn)象的原因可能儀器測定后存在微量的殘留,但這種現(xiàn)象對實驗并沒有影響,通過計算得出數(shù)據結果間的RSD值為0.395%,符合實驗質量控制要求。

表2 穩(wěn)定性實驗結果

2.6 加樣回收率結果分析

從表3可知,在所做的9組實驗中,編號1-3為碳酸飲料類,實驗提取方法簡單,提取過程中阿斯巴甜不易損耗,所以選擇加標濃度為7mg/m L;編號4-6為果味飲料類,實驗提取方法比碳酸飲料類復雜,阿斯巴甜損耗也多,所以增加加標濃度到10mg/m L,;編號7-9為實驗中最難提取的乳味飲料類所以選擇加標濃度為13mg/m L。從實驗結果看,9組實驗結果平均回收率為100.3%,RSD值為0.33%,各組回收率也均大于90%,符合實驗質量控制要求。

表3 加樣回收率結果

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3 結 論

通過對色譜分析條件實驗得到檢測飲料中阿斯巴甜含量的最佳色譜條件:流動相39%甲醇水溶液、柱溫30℃、流速0.8m L/min、檢測波長210nm,在此色譜條件下測得編號1-9真實含量分別為0.164mg/kg、0.079mg/kg、0.202mg/kg、0.00mg/kg、0.029mg/kg、0.043mg/kg、0.121mg/kg、0.063mg/kg、0.053mg/kg,碳酸飲料類平均含量為0.148mg/kg;果味飲料類平均含量為0.024mg/kg;乳味飲料類,其平均含量為0.079mg/kg,其中碳酸飲料類＞乳味飲料類＞果味飲料類。為了提高阿斯巴甜含量測定的準確率,進行精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、加標回收實驗。精密度實驗得出6組峰面積RSD值為1.233%,小于1.5%;穩(wěn)定性實驗得出RSD值為0.395%;9組實驗平均回收率為100.3%,RSD值為0.33%,研究為食品中阿斯巴含量測定提供理論依據[18]。