接種4種外生菌根真菌對槲樹幼苗生長、光合及營養(yǎng)元素含量的影響

孫佳琦，曹文琪，冷平生，胡增輝，c

（北京農(nóng)學院 a.北京林木分子設計育種高精尖創(chuàng)新中心；b.園林學院；c.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 102206）

外生菌根為土壤的擔子菌（少數(shù)為子囊菌和低等菌）等外生菌根真菌侵染植物營養(yǎng)根，與根系形成的一種互利互惠的共生體[1-3]。據(jù)統(tǒng)計，超過20 000 種的擔子菌和子囊菌能夠與近7 000 種植物共生形成外生菌根[4]。外生菌根在促進宿主植物生長，提升養(yǎng)分吸收與利用效率，提高抗逆能力，改善土壤環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)出不同的效應[5-7]。因此，明確外生菌根對植物的影響，對于理解植物環(huán)境適應能力及抗逆機制具有重要意義。

研究表明，殼斗科櫟屬Q(mào)uercus樹種是典型能形成外生菌根的樹種，對外生菌根具有較強的依賴性[8-9]。鉚釘菇Gomphidius viscidus、臭紅菇Russla foetens、褐環(huán)乳牛肝菌Suillus leteus、厚環(huán)乳牛肝菌S.grevillei、美味牛肝菌Boletus edulis及彩色豆馬勃Pisolithus tinctorius均能與遼東櫟Q.liaotungensis形成良好的外生菌根[10]，且接種苗的株高、生物量和光合速率均顯著優(yōu)于未接種苗[11]。接種美味牛肝菌、紅絨蓋牛肝菌Xerocomus chrysenteron和綿毛絲膜菌Cortinarius sublanatus后，栓皮櫟Q.variabilis幼苗的株高、地徑和生物量明顯增加[12]，葉綠素含量和光合速率顯著提高，蒸騰速率明顯下降，水分利用效率有了較大提升[13-14]，對養(yǎng)分的吸收能力也顯著增強[15]。接種印度塊菌Tuber indicum的麻櫟Q.acutissima菌根化幼苗具有較強的水分吸收和保水能力，表現(xiàn)出較強的抗旱性，并且其土壤的含水量及硝酸還原酶活性相較于對照也有明顯增加[16]。接種了黑松露T.melanosporum的冬青櫟Q.ilex細根表面積明顯增加，并具有高的導水率，凈同化率和氣孔導度也明顯提升[17]。由紅蠟蘑Laccaria laccata、褐絨蓋牛肝菌B.badius和彩色豆馬勃侵染形成外生菌根的夏櫟Q.robur，在樹高、胸徑、葉數(shù)、干質(zhì)量等方面有顯著增加[18]。彩色豆馬勃形成的外生菌根同樣也顯著促進了蒙古櫟Q.mongolica苗木的生長，并通過提升抗氧化酶活性增強苗木耐旱能力[19]。槲樹Q.dentata廣泛分布于我國北方山區(qū)，是北方暖溫帶和溫帶森林的重要組成樹種[20]，不僅抗逆性強，并且樹形優(yōu)美，秋季葉片變紅，是優(yōu)良的園林綠化觀賞樹種，但目前對于外生菌根在其生長和環(huán)境適應中的作用還不清楚。

本研究以槲樹1年生實生苗為材料，選擇4種成功與櫟屬植物形成菌根的外生菌根真菌，鉚釘菇、美味牛肝菌、褐環(huán)乳牛肝菌和厚環(huán)乳牛肝菌進行接種，通過測定苗高、地徑、生物量、葉綠素含量、光合速率、水分利用效率及營養(yǎng)元素含量等指標，分析接種不同菌根真菌對槲樹幼苗生長、光合和營養(yǎng)吸收的影響，為揭示外生菌根在其生長發(fā)育中的作用，進而促進槲樹的推廣應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用苗為槲樹1年實生苗。槲樹種子采集于北京市平谷區(qū)玻璃臺林場。將種子置于0.5%的KMnO4溶液中浸泡消毒30 min 后，埋于滅菌的河沙中進行沙藏層積催芽，白天溫度控制在30℃，夜間20℃，待根發(fā)出1 cm 左右，進行播種。種植基質(zhì)由草炭、蛭石、珍珠巖按4∶2∶1 的體積比混合制成，在高壓滅菌鍋中120℃滅菌20 min，裝入15 cm×20 cm 的盆中，用于播種。待播種7 d 后接種外生菌根真菌。

1.2 外生菌根菌種及培養(yǎng)

4 種用于接種的外生菌根真菌（表1）購于中國農(nóng)業(yè)科學研究院菌種保護中心。用PDA 培養(yǎng)基對真菌進行平板培養(yǎng)后，將菌斑分別挑入裝有500 mL 的PDA 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于恒溫搖床上28℃下震蕩培養(yǎng)7 d，制成接種菌液。菌液經(jīng)高溫滅菌后作為接種對照液。

表1 供試菌種Table 1 The fungi strain used

1.3 外生菌根真菌接種

在距苗5 cm 的基質(zhì)處以“品”字形打3 個5 cm深的孔，將10 mL 菌液灌入孔中，覆土。接種后置于溫室中自然培養(yǎng)，進行指標測定。

1.4 指標測定

所有的測定指標均在接種5 個月，槲樹幼苗生長穩(wěn)定后測定，在每個處理中選取5 株代表平均生長水平的植株作為重復。

生長指標測定：使用米尺測量株高，使用游標卡尺測量地徑。

生物量測定：采集整個植株，分為根、莖、葉3 部分，置于烘箱中105℃殺青10 min，再于80℃烘干至恒質(zhì)量后，稱量干質(zhì)量，計算總生物量和根冠比。

葉綠素含量測定：參考曹磊等[21]的方法，采用比色法測定提取液總?cè)~綠素濃度，根據(jù)以下公式計算葉片葉綠素含量。

Ca=13.95×A665-6.88×A649；

Cb=12.7×A649-2.69×A665；

Ct=(1 000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb)/245；

葉綠素含量（mg/g）=(Ct×提取液體積)/樣品鮮質(zhì)量。

式中：Ca，葉綠素a 濃度；Cb，葉綠素b 濃度；Ct，葉綠素總濃度；A665，提取液在665 nm 下的吸光值；A649，提取液在649 nm 下的吸光值；A470，提取液在470 nm 下的吸光值。

光合參數(shù)測定：使用Li-6400XT 便攜式光合儀測定凈光合速率、蒸騰速率，并計算水分利用效率（水分利用效率=光合速率/蒸騰速率）。每株選擇成熟的3 片功能葉（從頂端開始的第4～6枚葉片）進行測定，以3 片葉片的平均值作為每株的測定值。

營養(yǎng)元素含量測定：采用凱氏定氮法測定N 含量。精確稱取根、莖、葉粉末各0.1 g，倒入消煮管中，用硫酸和混合催化劑催化消煮。消煮完成后通過半微量凱式定氮儀進行滴定，計算N 含量。P、K、Ca、Mg 和S 含量測定參考李廣魯?shù)萚22]的方法，精確稱取根、莖、葉粉末各0.1 g 倒入50 mL帶蓋離心管中，加入10 mL 1 mol/L 的HNO3，沸水浴加熱30 min，冷卻后過濾至50 mL 容量瓶中定容，于8 000 g 下離心10 min，吸取15 mL 上層液體，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定各元素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種外生菌根真菌對槲樹幼苗株高和地徑的影響

接種外生菌根真菌促進了槲樹幼苗的高生長（圖1A）。除接種S.g 與對照相比無顯著差異外，接種其余3 種外生菌根真菌幼苗的株高均顯著高于對照（P＜0.05）。特別是接種B.e 的幼苗，其株高較對照提高了74.87%（圖1A）。接種G.v 和S.l 的幼苗地徑與對照沒有明顯差異，而接種B.e和S.g 的幼苗則顯著增加（P＜0.05），分別提高了15.51%和22.44%（圖1B）。

圖1 接種不同外生菌根真菌對槲樹幼苗株高（A）、地徑（B）的影響Fig.1 Effect of different ectomycorrhizal fungi on the plant height (A) and ground diameter (B) of Q.dentata seedlings

2.2 接種外生菌根真菌對槲樹幼苗生物量和根冠比的影響

接種菌根真菌后，槲樹幼苗的生物量表現(xiàn)出不同的變化趨勢（圖2A）。接種G.v、B.e 和S.l均顯著提高了槲樹幼苗的生物量，比對照分別增加了35.14%、21.92%和25.18%（圖2A，P＜0.05）。而接種S.g 沒有提高生物量，反而出現(xiàn)了一定的降低。接種后的幼苗根冠比也表現(xiàn)出不同的結(jié)果（圖2B）。接種S.g 的幼苗根冠比最大，較對照高16.97%，接種G.v、B.e 和S.l 幼苗的根冠比出現(xiàn)了降低，特別是接種G.v 的幼苗較對照顯著降低了31.05%（圖2B，P＜0.05）。

圖2 接種不同外生菌根真菌對槲樹幼苗生物量（A）和根冠比（B）的影響Fig.2 Effect of different ectomycorrhizal fungi on the biomass (A) and root/shoot ratio (B) of Q.dentata seedlings

2.3 接種外生菌根真菌對槲樹幼苗葉綠素含量和葉綠素a/b 的影響

接種外生菌根真菌顯著提高了槲樹幼苗葉片總?cè)~綠素含量（圖3A，P＜0.05）。接種G.v、B.e、S.l和S.g 的槲樹幼苗葉片總?cè)~綠素含量較對照分別提高10.27%、14.73%、11.16% 和18.30%。而幼苗葉片葉綠素a/b 的值則表現(xiàn)出降低的趨勢，特別是B.e 侵染的幼苗較對照明顯低16.20%（圖3B，P＜0.05）。

圖3 接種不同外生菌根真菌對槲樹幼苗葉片的葉綠素含量（A）、葉綠素a/b（B）的影響Fig.3 Effect of different ectomycorrhizal fungi on the chlorophyll content (A) and chlorophyll a/b ratio (B) in the leaves of Q.dentata seedlings

2.4 接種外生菌根真菌對槲樹幼苗光合、蒸騰和水分利用效率的影響

接種外生菌根真菌的槲樹幼苗凈光合速率較對照均出現(xiàn)升高，其中接種B.e 的幼苗升高最為明顯，較對照高45.32%，而接種S.g 的幼苗雖然也升高，但與對照相比差異不顯著（圖4A，P＜0.05）。接種G.v、B.e 和S.l 幼苗的蒸騰速率出現(xiàn)明顯降低（圖4B，P＜0.05）。與對照相比，接種B.e導致槲樹幼苗蒸騰速率降低了24.66%，而接種S.g則沒有引起明顯變化。對于水分利用效率，接種G.v、B.e 和S.l 槲樹幼苗較對照顯著提升，分別提高了43.50%、92.96%和43.84%（圖4C，P＜0.05）。而接種B.e 則沒有引起水分利用率發(fā)生明顯變化（圖4C）。

圖4 接種不同外生菌根真菌對槲幼苗葉片光合速率（A）、蒸騰速率（B）和水分利用率（C）的影響Fig.4 Effect of different ectomycorrhizal fungi on Pn (A),Tr (B),and WUE (C) in the leaves of Q.dentata seedlings

2.5 接種外生菌根真菌對槲樹幼苗營養(yǎng)元素含量的影響

接種外生菌根真菌還影響了槲樹幼苗營養(yǎng)元素的含量（圖5）。接種菌根真菌幼苗根莖葉中N 元素含量均高于對照，特別是葉中含量升高最為顯著（圖5A，P＜0.05）。升高最多的是接種B.e 的幼苗，其葉片N 含量較對照高41.39%。接種也導致了槲樹幼苗根莖葉中P 含量的升高（圖5B）。與對照相比，接種B.e 的槲樹幼苗根部P 含量顯著升高（圖5B，P＜0.05），增加了34.58%。接種B.e 引起葉中P 含量升高幅度最大，較對照升高了73.20%（圖5B，P＜0.05）。而接種后的莖中P 含量未出現(xiàn)明顯變化。對于K 含量，在接種B.e 的幼苗根中顯著升高，較對照高31.09%（圖5C，P＜0.05）。接 種B.e 和S.l 幼苗莖中K 含量分別升高了27.18%和29.15%（圖5C）。接種S.g 幼苗根和莖中K 含量均表現(xiàn)出明顯增加，而接種S.l 則引起葉片中K 含量的顯著增加（圖5C，P＜0.05）。接種后，幼苗莖和葉中的Ca 含量均有明顯提升，而根中Ca 含量僅在接種S.g 的幼苗中出現(xiàn)顯著增加（圖5D，P＜0.05）。且莖中Ca 含量在接種S.g 后的增加也最為顯著，較對照提高了23.43%（圖5D，P＜0.05）。在葉中，接種G.v 的幼苗Ca 含量提高最顯著，較對照高25.57%（圖5D，P＜0.05）。對于Mg 含量，除接種S.l 幼苗莖中較對照降低外，在根和葉片中，及其他3 種菌根真菌接種的幼苗中均有提高（圖5E）。接種B.e 幼苗葉片中Mg 含量較對照提高程度最大，達到對照的1.58 倍。接種對槲樹幼苗S元素含量也有一定的影響（圖5F），雖然沒有顯著影響葉片中S 含量，但提高了槲樹幼苗根和莖中S 含量。

圖5 接種不同外生菌根真菌對槲樹幼苗N 含量（A）、P 含量（B）、K 含量（C）、Ca 含量（D）、Mg 含量（E）、S（F）含量的影響Fig.5 Effect of different ectomycorrhizal fungi on the contents of N (A),P (B),K (C),Ca (D),Mg (E),and S (F) of Q.dentata seedlings

3 結(jié)論與討論

研究表明，外生菌根真菌能顯著提高寄主植物的適應性，對植物的生長發(fā)育起到明顯的正調(diào)控作用[23]。槲樹是北京山區(qū)重要的鄉(xiāng)土樹種，抗逆性強，是具有開發(fā)潛力的多功能生態(tài)景觀樹種，雖然已發(fā)現(xiàn)其普遍形成外生菌根，但目前對外生菌根在槲樹生長發(fā)育中的作用還不清楚。本研究通過測定接種不同的外生菌根真菌的生理指標，分析和比較了其對槲樹生長、光合及營養(yǎng)吸收的影響。

接種合適的外生菌根能促進苗木的生長[15]。在本研究中，接種4 種外生菌根真菌總體上均在一定程度上提高了槲樹幼苗的株高、地徑及生物量。菌根可通過分布廣泛的伸長菌絲來增強植物對水分和養(yǎng)分的獲取范圍和吸收面積，并且可以優(yōu)化改良植物土壤環(huán)境，促進植物的生長[24]。鄒慧等[25]研究發(fā)現(xiàn)，接種6 種不同外生菌根真菌均提高了西南樺Betula alnoides的生物量，但每種菌根真菌促進增長量并不相同。接種紫晶蠟蘑L.amethystea對黑松Pinus thunbergii生長量和耐鹽性提高程度要高于空團菌Cenococcum geophilum[26]。對接種不同外生菌根真菌的遼東櫟[10]和栓皮櫟[15]同樣表現(xiàn)出不同的促進效果。菌根真菌具有廣譜性寄、宿生和專性寄生，不同外生菌根真菌與宿主植物特異結(jié)合，對寄主生長發(fā)育影響程度也不相同，從而導致了差異[9,27]。此外，接種后的幼苗根冠比也發(fā)生了變化。S.g 侵染后地徑的明顯增粗和根冠比的顯著升高，表明其影響了生物量分配，將更多的光合產(chǎn)物分配到地下部分，從而表現(xiàn)出耐旱的形態(tài)特征[28]，但沒有引起株高和生物量的明顯升高，對生長的促進作用不明顯。而接種G.v雖然顯著提高生物量，但根冠比大幅度降低，說明其將更多的光合產(chǎn)物分配到地上部分，這可能會影響其耐旱性及穩(wěn)固性。接種B.e 和S.l 后的槲樹幼苗根冠比雖然也出現(xiàn)了一定的降低，但基本保持對照水平，光合產(chǎn)物分配比例變化不大，但從生物量來看，促生效果明顯。

外生菌根真菌也能顯著促進寄主植物的光合作用[14]。在本研究中，接種外生菌根真菌的槲樹幼苗葉綠素含量均高于對照。植物吸收光能主要是由葉綠素完成的，槲樹幼苗葉綠素含量的提高對光合作用也起到促進作用。葉綠素a/b 值反映植物的耐陰性，比值越小，植物的耐陰性越強[29]。由此可見，接種外生菌根真菌后，槲樹幼苗葉綠素a/b 值的降低表明其耐陰性的增強。接種G.v、B.e 和S.l 后，槲樹幼苗的凈光合速率和水分利用效率分別有不同程度的升高，而蒸騰速率有所降低，表明接種菌根真菌有助于提高槲樹的光合利用能力。在楊樹Populus×euramericanacv.Nanlin 895[30]、白皮松P.bungeana[31]和板栗Castanea mollissima[32]等，同樣發(fā)現(xiàn)外生菌根真菌提高對光能的利用率，顯著促進了光合作用，但促進作用因菌種不同而存在差異[33]。

菌根真菌能夠促進植物對N、P、K 等營養(yǎng)元素，以及一些微量元素的吸收[34-36]，從而促進了宿主植物的生長[37]。在本研究中，接種外生菌根后，槲樹幼苗的各營養(yǎng)元素含量高于對照。接種美味牛肝菌和馬勃菌Scleroderma citrinum能有效提高板栗對P、K、Mg 等營養(yǎng)元素的吸收能力[38]。于萌[39]在油松P.tabuliformis中也發(fā)現(xiàn)，接種外生菌根真菌促進了油松對營養(yǎng)元素的吸收。菌根形成的密集菌絲網(wǎng)擴大了根部吸收營養(yǎng)的能力，這樣的菌絲網(wǎng)對磷元素的吸收尤其顯著[40]。此外，寄主植物將自身的光合產(chǎn)物提供給菌根真菌，菌根真菌協(xié)助和促進了宿主植物對土壤中活性低、含量低的營養(yǎng)元素的吸收[35,41]。菌根真菌還可以分泌磷酸酶和硝酸還原酶將土壤中不可吸收的元素轉(zhuǎn)化為可吸收利用的元素從而增加養(yǎng)分的獲取[27]。接種菌根真菌后，槲樹幼苗N、P、K、Ca含量增加，促進了槲樹的生長，Mg 的增加能促進葉綠素的合成，進而提升光合能力，而S 元素的積累則能增加相關(guān)蛋白及次生代謝物的合成，有利于植物抗逆性和環(huán)境適應能力的提升。

總之，接種4 種菌根真菌總體上提升了對營養(yǎng)元素的吸收，提高了葉綠素含量，增強了光合速率，提高了水分利用效率，最終能促進了槲樹幼苗的生長。經(jīng)過綜合比較，在接種的4 種菌根真菌中，B.e 對槲樹生理和生長的提升效果最明顯。本研究僅從生理角度對槲樹接種菌根真菌的后生長效果進行了分析，在抗逆方面的效果是下一步要做的工作，并且還需從生化及分子層面對其中的機制進行研究。