降香黃檀內生細菌多樣性研究

藍柏成，劉君昂，肖 柏，周國英

（中南林業(yè)科技大學 a.南方人工林病蟲害防控國家林業(yè)局重點實驗室；b.森林有害生物防控湖南省重點實驗室；c.經濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

降香黃檀Dalbergia odorifera是我國珍貴的瀕危紅木樹種[1]，因其心材質地堅硬、花紋美觀、文理細密、不易開裂和變形、耐腐蝕等優(yōu)點，通常被用來制作高檔家具[2]。降香黃檀木材富含芳香油，尤其是其心材部位，降香油就是通過蒸餾技術從心材中提取的芳香油物質，該物質氣味清香持久，不容易揮發(fā)，是良好的定香劑。同時在醫(yī)學上具有阻止血液凝固和擴張心臟冠脈等作用是一種高級鎮(zhèn)痛藥材[3-4]。近年來，國家在我國廣東、云南、廣西等降香黃檀生長適宜地大力發(fā)展降香黃檀人工林的培育工作[5-7]。而降香黃檀在自然條件下的生長周期長，木材成型時間晚[8-9]，同時降香黃檀純林極易遭受風害、病害、蟲害等自然災害。根據董文統(tǒng)等[10]、劉成鋒等[11]和周斌[12]對海南島降香黃檀病害的全面調查結果顯示，降香黃檀的常見病害包括葉枯病、細菌性穿孔病、炭疽病、黑痣病等。這些病害嚴重影響了降香黃檀的生長發(fā)育尤其降香黃檀的成材。因此對于促進降香黃檀的健康生長及抗病能力的提高等科學問題的解決迫在眉睫。

已有研究表明降香黃檀內生菌對降香黃檀的生長發(fā)育有重要的影響，降香黃檀心材的形成與降香黃檀的內生菌緊密相關[13]。2014年，賈瑞豐[14]研究發(fā)現4 種真菌都對降香黃檀心材的形成存在促進作用，其中以多毛孢Pestalotiopsis palmarum對心材的促進作用效果最為明顯。2020年，劉昌霖等[15]對降香黃檀內生真菌的多樣性及其與內環(huán)境因子的關系進行研究，初步探討了內生真菌對降香黃檀生長的影響。但是都是關于降香黃檀內生真菌的研究，尚未見降香黃檀內生細菌的報道。

從植物的內生細菌中篩選出對于病原菌具有拮抗作用的細菌是十分重要的新型微生物資源，這些拮抗細菌往往更適應植物的內環(huán)境，能更好的定殖在植物體內[16]。對于降香黃檀病害的生物防治，內生拮抗細菌也有相關實例被報道。研究表明，降香黃檀葉部內生細菌中的一些芽孢桿菌屬Bacillus細菌能有效抑制炭疽病病原菌的生長發(fā)育[17]。由此可見，降香黃檀病害相關的內生拮抗菌資源還有待開發(fā)。

因此，為全面了解內生細菌在降香黃檀中的群落結構及群落多樣性，尤其是心材和邊材的之間的差異，本研究使用HiSeq 高通量測序的方法，測序分析了降香黃檀木材樣本中的內生細菌。同時測定降香黃檀心材邊材的理化性質。結合兩者的結果，綜合分析兩者之間的相關性。為后續(xù)人工促進降香黃檀健康生長及降香黃檀病害內生拮抗細菌的篩選提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

采樣地概況：地處海南省瓊海市市郊。土壤肥力較高，土層不深厚，土層中夾有母巖半風化物，為砂紅壤。主要樹種包括降香黃檀Dalbergia odorifera、小葉欖仁Terminalia neotaliala、天料木Homalium hainanense、沉香Aquilaria sinensis。

采樣方法：選取樹齡均為15 a，胸徑大小相近的降香黃檀。選取降香黃檀距離地面15 cm 處的莖干部分取。在無菌條件下，將樣品處理成厚度0.5 cm 薄片。為了釋放降香黃檀木材樣本中的內生細菌，配置0.9% NaCl 溶液至于錐形瓶中，然后加入5 g 樣本，最后將錐形瓶至于溫度控制在25℃的搖床上，搖瓶培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)后將的得到的樣本，用0.22 μm 濾膜真空抽濾備用[15]。心材樣本以下均使用代號HW，邊材樣本均使用代號SW。

1.2 內生細菌的高通量測序

使用總DNA 提取試劑盒（北京畢特博）提取降香黃檀內生細菌DNA。PCR 擴增實驗方法參考劉昌霖等[15]研究論文，正向引物：341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）；反向引物：806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。后續(xù)的文庫構建及高通量測序實驗由mega genomics（美因健康）完成。

1.3 理化性質測定

含水率、pH 值、灰分含量、熱水抽提物含量和礦質元素含量的測定，具體方法及步驟參考文獻[15]。

1.4 數據處理

下機后，獲得原始測序數據。對于原始數據的分析以及初始結果的獲得，由Mega genomics（美因健康）完成。

初始結果的相對豐度制圖使用R 軟件完成；方差、相關性分析和冗余分析分別使用SPSS 19.0軟件和Canoco 4.5 軟件完成。

本研究OUT 聚類分析選用Unite 數據庫，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學和生物信息統(tǒng)計分析[15]。

2 結果與分析

2.1 內生細菌測序數據質控結果

平均每個樣品產生序列：心材115 985 條，邊材185 600 條。經過過濾質控后，有效序列的平均長度為447.5 bp，平均降香黃檀心材和邊材得到有效序列為75 638 條和140 889 條。降香黃檀心材和邊材總共獲得堿基數為96 481 212 bp（表1）。

表1 測序結果統(tǒng)計Table 1 Statistics of sequencing results

心材和邊材的內生細菌Observed OTUs 稀釋結果看出（圖1），降香黃檀心材和邊材的稀釋曲線末端都逐漸達到平坦，說明了對于本研究的樣本，此次測序數據量的結果是合理的。

圖1 Observed OTUs 稀釋曲線Fig.1 Observed OTUs rarefaction curves

2.2 內生細菌OTU 聚類分析

為了更直觀的展示降香黃檀的OUT 在心材和邊材中的分布情況，根據OTU 的分析結果繪制Venn 圖（圖2）發(fā)現降香黃檀木材內生細菌總共有4 678 個OTU，其中心材和邊材共有的OTU 數量有1 494 個，心材特有的OTU 有2 368 個，邊材特有的OTU 有816 個。

圖2 心材和邊材OTU 的Venn 圖Fig.2 Venn of HW and SW OTU

統(tǒng)計降香黃檀心材和邊材注釋到界、門、綱、目、科、屬、種以及未鑒定的序列數目，統(tǒng)計結果如圖3所示。屬分類水平上，心材和邊材的OTU注釋數量最多，且心材和邊材之間較大的差異。

圖3 心材和邊材在各分類水平上的OTU 數目Fig.3 Number of OTU at each classification level for HW and SW

2.3 降香黃檀心材和邊材內生細菌群落結構

在門分類水平上（圖4），降香黃檀心材內生細菌群落中豐度最大的是變形菌門Proteobacteria（73%），其次是藍細菌門Cyanobacteria（13%），除此之外主要的內生細菌群落還有厚壁菌門Firmicutes、酸桿菌門Acidobacteria 和擬桿菌門Bacteroidetes，這些菌群豐度均高于1%，低于10%。邊材內生細菌優(yōu)勢菌群為變形菌門，占比96%，豐度遠遠高于其他菌群（豐度均低于1%）。由此可見，無論是在心材還是邊材，變形菌門都是優(yōu)勢菌群。

圖4 心材和邊材內生細菌組成Fig.4 Endophytic bacteria of HW and SW

在屬分類水平上，內生細菌在降香黃檀心材和邊材的分布結果如圖5，可以看出無論是降香黃檀的心材還是邊材腸桿菌屬Enterobacter都是明顯優(yōu)勢菌屬相對豐度都超過了10%。與心材不同的是，不動桿菌屬Acinetobacter在邊材中也占有很大的比例，它與腸桿菌屬在邊材的相對豐度達到了85%。在心材中也有其他菌屬相對豐度超過了1%，相對豐度由大到小分別泛菌屬Pantoea、伯克氏菌屬Burkholderia、乳桿菌屬Acidobacterium和檸檬酸桿菌屬Citrobacter。而在邊材內生細菌相對豐度超過1%的菌群依次為：腸桿菌屬、不動桿菌屬Acinetobacter、泛菌屬、腸球菌屬Enterococcus和克洛諾菌屬Cronobacter。

腸桿菌屬菌群在心材和邊材中都屬于優(yōu)勢菌群，且優(yōu)勢很大（圖5），說明其在降香黃檀邊材和心材兩種環(huán)境中適應性都很強。不動桿菌屬菌群在邊材中為優(yōu)勢菌群，且心材和邊材中豐度差異較大，更加適應邊材環(huán)境。泛菌屬菌群在心材和邊材中相對豐度差異很小，且都是主要菌群。對于剩余的相對豐度低于1%的菌群，這些菌群中的大部分在邊材中的豐度低于心材。

圖5 心材和邊材內生細菌組成Fig.5 Endophytic bacteria of HW and SW

2.4 內生細菌群落多樣性分析

通過對比降香黃檀心材和邊材的OTU 的數量，發(fā)現心材的數量（1 426）明顯多于邊材（808）。3 項指數即豐度指數、香儂指數和辛普森指數計算結果顯示降香黃檀心材均大于邊材。說明無論是內生細菌的物種數量還是多樣性，心材都大于邊材。

表2 多樣性分析Table 2 Diversity index

2.5 降香黃檀心材和邊材理化性質

降香黃檀心材含水率（39.87%）高于邊材含水率（36.99%）。通過單因素方差分析結果得知，含水率在降香黃檀心材和邊材之間并未存在顯著性差異（P=0.05）（圖6A）。

在常溫常壓下，降香黃檀木材pH 顯酸性，與林場的土壤性質一致。心材和邊材pH值分別為4.52和5.47。經過單因素方差分析表明，心材和邊材pH 值存在極顯著差異（P＜0.01）（圖6B）。

灰分（Ash）的高低可反映不同的植物的不同部位對礦質元素選擇吸收積累的特點[18]。心材Ash 含量明顯較邊材Ash 含量低。心材的含量0.18%，邊材的含量0.32%。單因素方差分析結果表明，降香黃檀心材和邊材灰分含量存在顯著性差異（P＜0.05）。由此可以推測，邊材對礦物元素（揮發(fā)性氧化物除外）的吸收和累積要比心材多（圖6C）。

通常熱水抽提物成分是糖類營養(yǎng)物質和可溶性無機鹽等[19]。降香黃檀心材熱水抽提物含量高于邊材部分，分別為13.51%和11.69%，心材為邊材的1.16 倍。單因素方差分析結果顯示，降香黃檀心材、邊材熱水抽提物含量存在顯著差異（P＜0.05）。心材中抽提物沉積物越多，心材顏色越深。熱水抽提物含量多少，反映了邊材和心材所含的營養(yǎng)物質多少。心材中具有更多糖類營養(yǎng)物質（圖6D）。

礦質元素在樹體內的循環(huán)是從衰老邊材向其他活體部分轉移的[20]。研究發(fā)現心材、邊材礦質元素的移動呈現一定的規(guī)律，部分移動的Mg 元素和不移動的Ca 元素在心材部分含量較邊材高，可移動的K 元素比邊材低[21]。降香黃檀心材鈣元素含量較邊材部位高，分別為5.76 和2.87 mg/g，單因素方差分析顯示存在極顯著差異（P＜0.01）。鎂元素含量心材和邊材差距不大，心材鎂元素含量（0.49 mg/g）比邊材（0.43 mg/g）稍高一點，單因素方差顯示不存在顯著差異（P=0.113）。在鉀元素含量方面，邊材鉀元素含量（1.69 mg/g）遠高于心材鉀元素含量（0.58 mg/g）。單因素方差表明，心材和邊材鉀元素含量存在極顯著差異（P＜0.01）（圖6E）。

圖6 心材和邊材的理化性質Fig.6 Physical and chemical properties of HW and SW

2.6 內生細菌群落結構與理化性質的關系

冗余分析結果如圖7所示，圖中橫向坐標軸解釋64.9%的信息，縱向坐標軸解釋35.1%的信息。從圖7可以看出，降香黃檀邊材中的優(yōu)勢菌群在圖中分布相對集中，說明這些菌群的相關性較大。但是降香黃檀心材優(yōu)勢菌群在圖中分布相對分散。說明這些菌群的相關性較小。pH 值和鉀元素同時處在同一個方向，所以他們呈極顯著正相關，且pH 值和鉀元素剛好處在礦質元素鈣和鎂元素的反方向，呈極顯著負相關。心材優(yōu)勢菌腸桿菌屬受到木材因子影響大小依次為：HWE、Ash、Ca、K、pH、Mg、MC，與Ash、K 和pH 值正相關，與MC、Mg、Ca 和HWE 含量負相關。木材因子對邊材優(yōu)勢菌不動桿菌屬的影響大小與之正好相反，且同樣與含水率、鎂、鈣和熱水抽提物含量負相關。腸球菌屬與pH 值和礦質元素鉀極顯著正相關，與礦質元素鈣和鎂極顯著負相關。

圖7 內生細菌菌群與理化性質的冗余分析Fig.7 RDA analysis of endophytic bacteria and physical and chemical properties

2.7 內生細菌群落多樣性指數與理化性質的關系

對心材和邊材樣品內生細菌多樣性指數和理化性質進行相關性分析（表3），結果表明，豐度指數、香儂指數與辛普森指數都互為正相關。pH值與豐度指數極顯著正相關性，豐度指數、辛普森指數和香儂指數與含水率、灰分和礦質元素鉀負相關，與熱水抽提物、礦質元素鈣和鎂正相關。木材理化因子中含水率和pH 值對內生細菌群落多樣性影響最大，具有顯著相關性。其中內生細菌群落多樣性受到木材因子pH 值的影響最大。

表3 理化性質與內生細菌多樣性的相關性分析?Table 3 Correlation analysis of physical and chemical diversity and endophytic bacteria diversity

3 結論與討論

3.1 討 論

3.1.1 降香黃檀內生細菌和木材內環(huán)境因子的關系

影響降香黃檀內生細菌群落結構的木材內環(huán)境因子主要是灰分含量、熱水提取物、pH 值、Ca含量和K 含量。內生細菌群落多樣性受到木材因子pH 值的影響最大。pH 值在心材邊材中呈顯著差異，在含水率相近的情況下，木材pH 值對內生細菌的群落結構影響更大。降香黃檀心材和邊材的熱水抽提物含量分別為13.51%和11.69%，熱水抽提物反映的是有機質等營養(yǎng)物質的含量。營養(yǎng)物質含量高的微生物種類和數量都多。這與心材內生細菌群落豐富度大于邊材的結果相符合?；曳趾康慕Y果表明，降香黃檀中邊材比心材礦質元素累積的要多。其中Ca 含量和K 含量是引起內生細菌群落結構差異的主要礦質元素。心材礦質元素中鈣元素的含量比邊材高，研究表明鈣含量的提高會降低變形菌門的豐度[22]，而心材中變形菌門的相對豐度低于邊材。解鉀菌稱硅酸鹽細菌（Silicate bacteria），能有效分解并利用磷、鉀等礦物元素；主要為厚壁菌門中的芽孢桿菌屬Bacillus的細菌[23]。在心材內生細菌群落中，厚壁菌門Firmicutes豐度明顯大于邊材，因此的鉀的含量會低于邊材。

3.1.2 降香黃檀心材和邊材的內生細菌多樣性與差異性

研究表明，不同植物內生菌在不同植物體內的分布不同，在宿主不同器官的分布也存在著差異[24-25]。本研究顯示，心材的多樣性指數豐度指數和OUT 數量都高于邊材，說明心材內生細菌的物種總數多于邊材。辛普森指數和香儂指數，心材中內生細菌多樣性要多于邊材。這說明降香黃檀心材內生細菌的物種豐富度大于邊材。也反映了降香黃檀內生細菌的分布受到了心材邊材不同木材結構性質及理化性質的影響，使降香黃檀心材邊材內生細菌的分布表現出了明顯的差異。

分析降香黃檀內生細菌的群落結構組成上，心材邊材也存在差異性。在門的分類水平上，變形菌門在心材和邊材中都占絕對優(yōu)勢，同時在屬水平上，腸桿菌屬無論在心材還是邊材也都是優(yōu)勢菌，這反映變形菌門的細菌能很好地適應心材邊材的環(huán)境。有研究表明變形菌門是植物根際最豐富的優(yōu)勢菌群，主要原因是其生長速度快，同時能夠充分利用植物根際分泌的各種物質[26]，因此，這一觀點在沙棘[27]、紅豆杉[28]、醉馬草[29]、人參[30]和甘草[31]等植物上得到了很好的證明。同時本研究顯示變形菌門在心材和邊材中都占絕對優(yōu)勢，同時變形菌門在邊材的豐度大于心材，說明降香黃檀心材和邊材的一些細菌可能來源于根際土壤。

藍細菌門在心材的中的豐度達到了13%。但在邊材中并不是優(yōu)勢菌群。藍細菌門細菌分布廣泛同時生存能力極強，還能與一些植物共生[32]。本研究沒有對藍細菌門進一步研究。后續(xù)應當對這一現象進一步深入研究，進一步明確降香黃檀心材和邊材的內生細菌群落結構，闡述藍細菌門與降香黃檀的關系。

不動桿菌屬菌群在邊材中為優(yōu)勢菌群，是多種植物的內生細菌，廣泛存在于胡楊[33]、銀砂槐[34]等植物體內，從各種植物組織中分離出的幾種不動桿菌已被報道為潛在的生物防治劑。除了抑制病原菌的活性外，不動桿菌還表現出多種促進植物生長的特性，例如生長素的產生，磷酸鹽的增溶，鐵載體的產生和氨的產生[35-36]。與其他腸桿菌屬不同的是，不動桿菌屬心材和邊材中豐度差異較大，更加適應邊材環(huán)境。

3.1.3 降香黃檀內生細菌對降香黃檀生長的影響

內生細菌對于植物生長的促進作用主要分為直接和間接兩種形式[37]。直接促進作用包括：固氮、溶磷、解鉀和產生植物生長調節(jié)激素等。間接促進作用主要有對于植物病原菌的拮抗、產生ACC 脫氧酶、產生鐵載體和誘導系統(tǒng)抗性等。如朱艷蕾[34]對銀砂槐的6 株內生細菌進行促生抗逆作用的研究，研究發(fā)現6 株菌種均具備溶磷、固氮以及產生IAA 和ACC 脫氨酶等不同的促生能力。陸藍翔等[38]對2 株樟樹組織中內生細菌進行分離鑒定，其中有11 株菌對樟樹病害病原菌具有拮抗效果，4 株菌具有解無機磷能力，2 株菌具有解有機磷能力，2 株菌具有產IAA 能力。田紅雨[39]通過調控內生細菌的群落結構增強了桉樹抗青枯病的能力，其中提高黃桿菌屬Flavobacterium在桉樹體內的比例可能是微生態(tài)調控的關鍵。降香黃檀內生細菌的對其的間接促生作用已有報道。2017年陳彧等[17]從降香黃檀葉片分離篩選了芽孢桿菌屬Bacillus的炭疽病拮抗細菌Y23，而對于降香黃檀內生細菌的直接促生作用目前研究卻很少。但是在降香黃檀的根際土壤中發(fā)現了大量的解鉀和固氮的細菌，土壤是內生細菌的一個重要來源，這說明降香黃檀內生細菌資源還有待進一步的開發(fā)。

本研究由于降香黃檀樹種的特殊性及國家政策等原因，考慮到其內生細菌群落結構及理化性質結果與實際情況的差距，可以選擇對正常生長的降香黃檀直接取樣進行研究。在后續(xù)的研究中可以對降香黃檀內生細菌的促生功能、內生拮抗細菌的篩選及應用等方面展開研究。為充分利用降香黃檀的內生細菌資源奠定理論基礎同時也為降香黃檀病害的無公害防治提供科學依據。

3.2 結 論

對降香黃檀的心材邊材理化性質進行分析，降香黃檀心材和邊材各項理化性質均存在不同程度的差異。灰分含量、熱水提取物、pH 值、Ca 含量和K 含量上存在明顯差異。在對降香黃檀內生細菌的分布與木材理化因子的相關性分析中，含水率和pH 值對內生細菌群落結構的影響最大，其中降香黃檀內生細菌群落結構多樣性受到木材因子pH 值的影響最大。

對降香黃檀心材邊材的內生細菌HiSeq 高通量測序并優(yōu)化后，結果表明，降香黃檀心材和邊材內生細菌種群資源豐富多樣，內生細菌群落豐富度心材大于邊材。內生細菌多樣性心材大于邊材，說明降香黃檀心材和邊材的內生細菌的入侵定殖也有差異性。