蘆丁對(duì)羅丹明6G的熒光猝滅機(jī)理研究及其含量測定

劉曉慧 呂慶鑾 王懷友

(山東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理處，濟(jì)南 250014) (魯南煤化工研究院，濟(jì)寧 272000) (山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院,濟(jì)南 250014)

蘆丁(又名維生素P)是一種分布廣泛的黃酮類化合物，存在于槐米、蕓香葉、煙葉、棗、杏、橙皮、番茄等物質(zhì)中。蘆丁具有降低毛細(xì)管的通透性和脆性，改善微循環(huán)的作用，還可作為抗氧劑和天然食用黃色素[1]，在臨床上主要用于糖尿病、高血壓的輔助治療[2]。蘆丁除了在食品工業(yè)中可作保健品外，在化妝品行業(yè)，蘆丁是目前較為理想的一種天然廣譜防曬劑[3]。

蘆丁的測定方法主要有電化學(xué)發(fā)光法[4]、熒光光度法[5]、分光光度法[6]、高效液相色譜法[7]，毛細(xì)管電泳法[8]等。蘆丁本身熒光很弱，因此分析工作者采用敏化蘆丁熒光的方法對(duì)其測定。目前，熒光探針猝滅法測定蘆丁還未見報(bào)道。羅丹明6G(Rhodamine 6G，Rh6G)是一種水溶性陽離子熒光染料，在水中可發(fā)強(qiáng)綠色熒光，光穩(wěn)定性好，對(duì)pH不敏感，Stokes位移大，熒光量子產(chǎn)率高等，因而被廣泛用于熒光標(biāo)記或定量分析[9]。筆者研究發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)羅丹明6G的熒光具有顯著猝滅作用，并確定了熒光猝滅類型，據(jù)此建立了測定蘆丁的新方法。該方法簡便、快速、靈敏度高，用于片劑中蘆丁含量的測定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)：LS-50型，美國Perkin-Elmer公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-265型，日本島津公司；

酸度計(jì)：pHS-3C型，上海雷磁儀器廠；

超純水系統(tǒng)：Direct-Q3型，美國Millipore公司；

羅丹明6G儲(chǔ)備液：1.0 mg/mL，上海國藥化學(xué)試劑有限公司，臨用前用水稀釋100倍；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0 mg/mL，準(zhǔn)確稱取100.0 mg蘆丁(BR，北京化學(xué)試劑公司)，溶于適量無水乙醇中，移入100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，混勻；

蘆丁片：購于藥店；

Na2HPO4-KH2PO4緩沖液：pH 5.29，將Na2HPO4(1/15 mol/L)和KH2PO4(1/15 mol/L)以體積比5∶95混合均勻;

除特別注明，實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，電阻率不小于18.2 MΩ·cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)步驟Ⅰ

取不同濃度的蘆丁溶液于10 mL比色管中，依次加入pH 5.29的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液1.0 mL，10 mg/L羅丹明6G溶液0.1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，放置30 min后于熒光分光光度計(jì)上，以λex338 nm、λem540 nm進(jìn)行掃描，記錄熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射狹縫皆為15 nm，掃描速度為500 nm/min。

(2)步驟Ⅱ

于10 mL比色管中，依次加入pH 5.29的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液1.0 mL，10 mg/L羅丹明6G溶液0.1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，記作溶液A；加入不同濃度的蘆丁溶液于另一10 mL比色管中，再按照上述試劑量依次加入，定容搖勻，記作溶液B；另一10 mL比色管中，以1.0 mL 1.0 mg/mL的蘆丁溶液代替溶液A中的羅丹明6G溶液，定容搖勻，記作溶液C。以水為參比，在紫外可見分光光度計(jì)上繪制其吸收光譜，狹縫寬度為2 nm。

1.3 樣品溶液的制備

取本品5片，研細(xì)，準(zhǔn)確稱取細(xì)粉50 mg，加無水乙醇使之溶解, 轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，定容，過濾，作為待測液。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

按照分析步驟Ⅰ，分別繪制在蘆丁(濃度為10 μg/mL)存在和不存在下羅丹明6G的熒光光譜，結(jié)果見圖1。

a、b—分別為羅丹明6G的激發(fā)和發(fā)射光譜；c、d—分別為加入蘆丁后羅丹明6G的激發(fā)和發(fā)射光譜圖1 羅丹明6G的激發(fā)和發(fā)射光譜

2.2 熒光猝滅機(jī)理探討

實(shí)驗(yàn)表明，蘆丁對(duì)羅丹明6G的熒光有猝滅作用。猝滅機(jī)理分為靜態(tài)猝滅、動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)動(dòng)態(tài)混合猝滅[10]；靜態(tài)和動(dòng)態(tài)猝滅Stern-Volmer曲線的特征都是直線，混合猝滅Stern-Volmer曲線的特征是向上彎曲的非線性關(guān)系[11]。為了確定熒光猝滅機(jī)理的類型，進(jìn)行了熒光猝滅實(shí)驗(yàn)。按照實(shí)驗(yàn)步驟Ⅰ，測定F0及F的值(F、F0分別為猝滅劑存在和不存在下羅丹明6G的相對(duì)熒光強(qiáng)度)，得到Stern-Volmer圖，如圖2所示。由圖2可知，Stern-Volmer圖為線性，所以蘆丁對(duì)羅丹明6G的熒光猝滅機(jī)理不是靜態(tài)動(dòng)態(tài)混合猝滅。

圖2 F0/F與猝滅劑濃度的關(guān)系

區(qū)分動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅的方法可以用熒光物質(zhì)在猝滅劑不存在和存在時(shí)吸收光譜的變化。通常發(fā)生靜態(tài)猝滅形成了非熒光化合物，會(huì)引起熒光物質(zhì)吸收光譜的變化[10]。按照步驟Ⅱ，掃描羅丹明6G在蘆丁存在和不存在下的吸收光譜，結(jié)果見圖3。由圖3可見，加入蘆丁后，羅丹明6G的吸收光譜發(fā)生紅移，并隨著蘆丁濃度的增大，紅移越顯著，表明蘆丁與羅丹明6G發(fā)生了作用，形成了復(fù)合物。故二者之間的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

1～6—蘆丁濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL； 7—蘆丁圖3 羅丹明6G加入不同濃度的蘆丁后的吸收光譜

對(duì)于靜態(tài)猝滅反應(yīng)，如果假定在分子中有相似的且不相關(guān)的結(jié)合點(diǎn)，那么熒光強(qiáng)度和猝滅介質(zhì)之間可推斷出式(1)[10]：

nQ+B→Qn+B

(1)

B是有熒光的染料分子，Q是具有猝滅作用的分子，Qn+B是猝滅的分子，其形成常數(shù)K可用式(2)表示：

(2)

如果染料分子的總濃度(包括游離的和與猝滅分子反應(yīng)的)是[B]0，則[B]0= [Qn+B]+[B]，[B]是未反應(yīng)的染料分子的濃度，那么熒光強(qiáng)度與未反應(yīng)的分子的濃度之間的關(guān)系是[B]/[B]0=F/F0，則有：

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(3)

K是蘆丁與羅丹明6G的結(jié)合常數(shù)，可通過lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖(見圖4)。從公式(3)可得，斜率為n，截距為lgK，由此可得蘆丁與羅丹明6G的結(jié)合常數(shù)K=5.55×105L/mol，結(jié)合點(diǎn)數(shù)n=1.26，相關(guān)系數(shù)r=0.998 7。

圖4 lg[(F0-F)/F]與lg[Q]的關(guān)系

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

(1)酸度

蘆丁在堿性條件下會(huì)變成金黃色，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH>6.5時(shí)就變色，所以實(shí)驗(yàn)了pH在2.0～6.5間的影響。當(dāng)pH在5.0～5.5間時(shí)熒光猝滅最大，因此選擇pH 5.29的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液控制體系酸度，并且發(fā)現(xiàn)1.0 mL為最佳用量。

(2)試劑加入順序

實(shí)驗(yàn)了3種反應(yīng)物的6種加入順序，結(jié)果表明最佳加入順序?yàn)樘J丁、緩沖液、羅丹明6G。

(3)放置時(shí)間

按照分析步驟Ⅰ，每5 min 測定體系相對(duì)熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在30 min內(nèi)體系相對(duì)熒光強(qiáng)度略有下降，隨后不再變化，且于室溫下至少穩(wěn)定3 h。故選擇最佳放置時(shí)間為30 min。

2.4 共存物質(zhì)的干擾試驗(yàn)

2.5 工作曲線

在所選實(shí)驗(yàn)條件下，蘆丁的濃度在0.92～137.8 μg/mL范圍內(nèi)與F0/F呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F0/F=0.802+0.0797c，相關(guān)系數(shù)為0.999 6。F0和F分別為蘆丁不存在和存在下的羅丹明6G的熒光強(qiáng)度。

2.6 精密度和檢出限

按照分析步驟，將同一樣品測定11次，測得待測液中蘆丁的平均含量為434.4 μg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.45%。檢出限為0.90 μg/mL。

2.7 樣品測定

取一定量蘆丁溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，其結(jié)果與UV法[8]一致，測定結(jié)果見表1。置信度為95%時(shí)，用Cochran檢驗(yàn)[12]，兩種方法間不存在顯著性差異。

表1 本法與UV法測定結(jié)果的比對(duì)(n=3)

2.8 回收試驗(yàn)

用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行了回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，蘆丁的回收率為92.4%～96.3%，說明該方法準(zhǔn)確可靠，因此該方法可用于蘆丁片的測定。

表2 蘆丁片回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié)語

以羅丹明6G為熒光探針測定了蘆丁含量，結(jié)果表明方法具有較高的靈敏度,對(duì)蘆丁的檢出限為0.90 μg/mL；測定結(jié)果與UV法測定結(jié)果相符合，該法可用于蘆丁片劑含量的測定。

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