肌萎縮側(cè)索硬化癥模型小鼠腦干蛋白質(zhì)組學(xué)分析

熊伯成, 黎上明, 但丁, 鄒良玉, 楊細飛

1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,山西太原 030000;2.深圳市疾病預(yù)防控制中心 深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點實驗室深圳市衛(wèi)生毒理學(xué)醫(yī)學(xué)重點學(xué)科,廣東深圳 518000;3.深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東深圳 518020

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種致命的進行性神經(jīng)退行性疾病,以進行性運動神經(jīng)元死亡為特征,表現(xiàn)為肌肉無力、進行性癱瘓,并在發(fā)病后3～5年內(nèi)因呼吸衰竭而死亡[1-2]。

ALS的發(fā)病機制尚不完全清楚,主要的機制假說有RNA毒性、興奮性毒性、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)破壞、神經(jīng)炎癥、軸突運輸缺陷、氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙[3]。在ALS的病理過程中,腦干是重要的受損部位,ALS患者出現(xiàn)呼吸、循環(huán)和消化功能障礙,同時腦干調(diào)節(jié)運動和感覺功能也受到影響,導(dǎo)致患者出現(xiàn)肌無力、肌萎縮和肌陣攣等癥狀。研究表明,ALS患者的延髓和腦橋出現(xiàn)了病理學(xué)上的改變,如神經(jīng)元喪失和膠質(zhì)細胞激活[4]。磁共振成像顯示,ALS患者的腦干體積較健康人群明顯縮小[5]。

腦干作為腦組織的一部分,對ALS的發(fā)生發(fā)展有至關(guān)重要的作用,但關(guān)于ALS與腦干關(guān)系的研究較少。本研究對ALS模型小鼠腦干蛋白質(zhì)組學(xué)進行分析,為藥物開發(fā)提供新的思路和視角。

1 材料和方法

1.1 主要材料

13周齡攜帶人類SOD1基因突變體的ALS模型(SOD1G93A)雌鼠[體質(zhì)量(22.20±0.97)g]和野生型雌鼠[體質(zhì)量(19.60±0.71)g]各4只,均購自常州卡文斯實驗動物有限公司;TMT標記試劑盒、蛋白酶和磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher公司;胰蛋白酶購自Promega公司;脫鹽柱購自O(shè)ASIS公司;三乙基碳酸氫銨、乙腈、TFA、NaH2PO4、NaCl購自Sigma公司;尿素、DTT、IAA購自GEhealthcare公司;抓力測試儀購自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司;小鼠步態(tài)分析系統(tǒng)購自諾達思(北京)信息技術(shù)有限責任公司。

1.2 動物分組

將13周齡SOD1G93A雌鼠作為模型組,野生型雌鼠作為對照組。所有小鼠均在深圳市疾病預(yù)防控制中心飼養(yǎng)[許可證號:SYXK(粵)2022-0282,倫理號:ER-0013-005]。小鼠置于12 h明暗周期、(22±2)℃、55%±15%濕度的房間中生活,自由飲水和進食。

1.3 行為學(xué)測試

小鼠18周齡末檢測行為學(xué)(抓力、爬桿、轉(zhuǎn)棒、懸掛、步態(tài));隨后戊巴比妥鈉麻醉,取出腦干立即放入-80 ℃冰箱中。

1.3.1 抓力測試 將小鼠輕放于儀器抓板的中央,等小鼠抓穩(wěn)抓板后,均勻用力輕輕地拉小鼠尾巴。每只動物測試3次,取3次結(jié)果最大值。抓力值越大說明四肢肌肉力量越大。

1.3.2 懸掛測試 每只動物被放置在一個60 cm×40 cm的金屬網(wǎng)中央。等小鼠抓緊金屬網(wǎng)后,將其旋轉(zhuǎn)180°呈倒置水平。記錄小鼠掛在金屬網(wǎng)格上的時間(小鼠在測試前均進行了訓(xùn)練,設(shè)定180 s為測試時間上限)。每只重復(fù)實驗2次,取每只小鼠平均懸掛時間。懸掛時間越長,小鼠四肢的抓取力越大。

1.3.3 爬桿測試 將一根長約50 cm、直徑約1 cm自制木桿用醫(yī)用紗布纏繞以增加摩擦。將小鼠頭朝下放在垂直桿的頂部,記錄從桿頂?shù)降撞科脚_的下降時間。在測試前,每只小鼠連續(xù)訓(xùn)練3天,每天2次,分界值為15 s。實驗過程重復(fù)3次,計算每只小鼠平均爬行時間。爬行時間越短,小鼠的運動和協(xié)調(diào)能力越強。

1.3.4 轉(zhuǎn)棒測試 將每只小鼠放在轉(zhuǎn)棒疲勞測試儀的轉(zhuǎn)棒上,旋轉(zhuǎn)速度最大為25 r/min[6](實驗前,每只小鼠訓(xùn)練3天,每天2次,以180 s為分界值)。實驗重復(fù)3次,每次測試間隔至少1 h。取每只小鼠平均堅持時間。堅持時間越長,小鼠耐力和平衡能力越強。

1.3.5 步態(tài)測試 采用步行追蹤分析系統(tǒng)(Framework 4.0)進行測試。將實驗小鼠放置于避光步行通道中(寬5 cm),視頻采集系統(tǒng)在步行通道下方,對準小鼠經(jīng)過的通道顯示出小鼠足跡。實驗時讓小鼠自然進入步行通道,高速攝像機連續(xù)記錄至少3個步行周期的視頻進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析,小鼠中途不能有停頓時間,否則重新記錄小鼠步行視頻。

1.4 蛋白質(zhì)提取和酶切

用尿素裂解腦干,隨后離心吸取上清液。定量后每個樣品取50 μg蛋白質(zhì)用于后續(xù)實驗。在每一個樣品中加入DTT,混勻后在55 ℃干式加熱器中孵育1 h,加入25 mmol/L IAA避光常溫孵育1 h。在樣品中加入胰酶放入37 ℃恒溫箱中消化14 h,脫鹽后TMT標記。

1.5 TMT標記與液相色譜-質(zhì)譜儀/質(zhì)譜儀分析

將不同標簽標記的樣品混合后脫鹽、旋蒸、重新溶解、分組分;之后再旋蒸,重溶;然后進行液相色譜-質(zhì)譜儀/質(zhì)譜儀分析。最后,用蛋白質(zhì)組搜索軟件在UniProt小鼠Fasta數(shù)據(jù)庫中檢索數(shù)據(jù)。根據(jù)各多肽的報告離子強度計算蛋白質(zhì)相對表達量。通過Perseus軟件中的t檢驗方法,將蛋白質(zhì)的差異表達設(shè)定為P<0.05。

1.6 生物信息學(xué)分析

在錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.01的條件下,采用Perseus軟件篩選出差異表達蛋白。通過熱圖分析評估差異表達蛋白的強度。使用David 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)進行蛋白質(zhì)聚類分析及基因本體分析,以確定差異表達蛋白質(zhì)的生物學(xué)過程和通路。用分子絡(luò)合物檢測(MCODE)分析尋找蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)的密集區(qū)域。使用Hiplot網(wǎng)站(https://hiplot-academic.com/)進行圖像可視化處理。

1.7 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異采用非配對t檢驗。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 ALS小鼠運動功能減弱

與對照組比較,模型組小鼠的各項運動表現(xiàn)均有明顯下降:抓力降低;爬桿時間延長;懸掛和轉(zhuǎn)棒時間縮短;擺動速度、身體速度、步幅均顯著下降,步行周期延長(表1)。小鼠步行足印雜亂無章,四肢不協(xié)調(diào)(圖1)。

表1 行為學(xué)測試結(jié)果

圖1 小鼠代表性足印圖

2.2 ALS小鼠組織差異表達蛋白

腦干組織中共鑒定和量化了6 702種蛋白質(zhì)。與對照組小鼠比較,模型組小鼠有423個差異表達蛋白(圖2A),其中上調(diào)265個,下調(diào)158個(圖2B)。

圖2 ALS小鼠腦干中差異表達蛋白A為熱圖;B為火山圖。

2.3 差異表達蛋白質(zhì)生物學(xué)過程與通路

DAVID功能分析指出,ALS小鼠腦干中上調(diào)蛋白質(zhì)主要富集于蛋白質(zhì)運輸、細胞黏附、膠原蛋白纖維組織等生物過程;蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能;細胞質(zhì)、高爾基體等細胞組分(圖3);KEGG通路富集于ECM-受體相互作用、人類乳頭瘤病毒感染等(圖3)。下調(diào)蛋白質(zhì)主要富集于翻譯、細胞死亡的負調(diào)控等生物過程;蛋白質(zhì)結(jié)合、水解酶活性等分子功能;細胞質(zhì)、細胞膜、線粒體等細胞組分;KEGG通路富集于內(nèi)吞、MAPK信號通路等(圖4)。

圖3 ALS小鼠腦干中上調(diào)差異表達蛋白所參與生物過程、分子功能、細胞組分、KEGG通路富集結(jié)果

圖4 ALS小鼠腦干中下調(diào)差異表達蛋白所參與生物過程、分子功能、細胞組分、KEGG通路富集結(jié)果

2.4 差異表達蛋白的PPI

采用MCODE分析尋找核心差異表達蛋白的基因集,并用Cytoscape軟件來闡明變化的蛋白質(zhì)之間的相互作用。功能上涉及氧化磷酸化、ECM-受體相互作用(圖5)。

圖5 差異表達蛋白的PPI圖紅色為上調(diào),藍色為下調(diào)。

3 討 論

ALS是一種進行性和致命的神經(jīng)退行性疾病,腦干是其發(fā)病最嚴重的區(qū)域之一,不同部位起病的患者臨床表現(xiàn)有所不同。在ALS患者中,一部分以腦干癥狀開始,包括構(gòu)音障礙和吞咽困難,嚴重影響患者的生活質(zhì)量[7-8]。研究表明,ALS小鼠腦干神經(jīng)膠質(zhì)增生,氧化應(yīng)激和自噬增加參與了腦干運動神經(jīng)元的退化[9]。本研究補充了本課題組前期對ALS小鼠脊髓的研究[10],并表明ALS小鼠腦干中膠原蛋白纖維組織、細胞黏附蛋白、EMC-受體相互作用蛋白表達增加,線粒體、肌動蛋白、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白表達減少,這些蛋白表達譜的改變可能是ALS小鼠運動功能降低的分子基礎(chǔ)。

膠原蛋白纖維組織、細胞黏附蛋白是炎癥反應(yīng)的重要組成部分[11-12],這些蛋白在本研究中模型組小鼠表達增加,與文獻[13]結(jié)果一致。EMC-受體相互作用蛋白參與傷口愈合和纖維化[14],這些蛋白在模型組小鼠表達增加,說明腦干中存在神經(jīng)元損傷。

線粒體是細胞內(nèi)重要細胞器,不但控制著細胞能量的產(chǎn)生,還控制著細胞的鈣平衡和細胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腦干中線粒體相關(guān)蛋白表達減少,這可能導(dǎo)致三磷酸腺苷的產(chǎn)生減少,從而加速神經(jīng)元的死亡。

MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個參與多種生命過程的信號通路,包括細胞生長、遷移、增殖、分化和存活[16]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腦干中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑蛋白表達減少,這可能影響了神經(jīng)元的正常生物過程,導(dǎo)致神經(jīng)元功能受損。

綜上所述,蛋白組學(xué)結(jié)果提示,ALS小鼠腦干中存在炎癥和纖維化,線粒體功能受損。研究結(jié)果提示多種機制參與了ALS小鼠發(fā)病。