西弗射盾子囊霉研究進(jìn)展

唐秀雅 周萬(wàn)青

(1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210008；2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013)

西弗射盾子囊霉(Stephanoascusciferrii)屬子囊菌類酵母，與孢子絲菌屬和念珠菌屬同源，但在形態(tài)特征上差別較大，除單細(xì)胞的酵母菌外，營(yíng)養(yǎng)體菌絲中有隔膜，可通過(guò)有性繁殖在子囊中產(chǎn)生子囊孢子[1-2]。該菌可造成健康個(gè)體的淺表感染，在免疫缺陷或免疫低下人群可造成侵襲性感染且結(jié)局較為嚴(yán)重[3]。近年隨著激素及其他藥物的廣泛使用，西弗射盾子囊霉等少見(jiàn)真菌引起的臨床感染逐年增多[4]。對(duì)該菌的鑒定方法有傳統(tǒng)的培養(yǎng)表型分析，亦可采用基因測(cè)序和質(zhì)譜等精準(zhǔn)檢測(cè)手段。而西弗射盾子囊霉的藥敏監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示具有一定的差異性[5]，多種抗真菌藥物耐藥菌株的檢出給臨床治療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。而該菌的致病機(jī)制等方面仍存在很多未知。本文將從西弗射盾子囊霉的命名、培養(yǎng)鑒定技術(shù)的應(yīng)用、耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)以及臨床治療等方面全面闡述。

1 西弗射盾子囊霉的命名

西弗射盾子囊霉別名較多，如西弗念珠菌(Candidaciferrii)、類西弗念珠菌(Candidaallociferrii)、西弗毛滴蟲(chóng)(Trichomonascusciferrii)，屬于酵母綱、酵母目、酵母科、子囊菌屬，其特征是有性生殖形成子囊孢子[6]。西弗射盾子囊霉作為少見(jiàn)感染性真菌，自1965年首次被Kreger-van Rij發(fā)現(xiàn)并描述為假絲酵母-西弗念珠菌(Candidaciferrii)[2]。該菌可形成真正的菌絲和出芽酵母細(xì)胞，菌絲有隔膜，這方面與酵母菌屬和毛孢子菌屬相似。因其獨(dú)特的、加冠的、成熟的子囊形成，使其區(qū)別于子囊科的所有屬，由于菌株缺乏形成分裂細(xì)胞的能力，在單一或混合培養(yǎng)中均不能產(chǎn)生一種具子囊的狀態(tài)，因此在1976年Smith Mt將其歸為念珠菌屬[7]。正是由于對(duì)于該菌的認(rèn)識(shí)不夠，曾先后出現(xiàn)多種命名，亦稱其為西弗射盾子囊霉復(fù)合群。在2002年，依據(jù)18S rDNA序列分析最終將西弗射盾子囊霉復(fù)合群進(jìn)行了精準(zhǔn)的分類[6]。之前多種別名菌種其實(shí)可分為A、B、C 3個(gè)組，Group A(無(wú)內(nèi)含子)包括Candidaallociferrii；Group B(有一個(gè)I類內(nèi)含子，位置為1506處的Sc1506-1)包括Stephanoascusciferrii、Candidaciferrii和Sporothrixcatenata；Group C(有兩個(gè)I類內(nèi)含子，位置為943的Sc943和1506的Sc1506-2，1506位的Sc1506-1和Sc1506-2有19個(gè)堿基差異，但非常相似)包括Candidamucifera[6]。DNA雜交數(shù)據(jù)表明同一組中不同模式菌株相似性極高，而3個(gè)組間密切相關(guān)又各自不同。通過(guò)DNA雜交顯示A組和B組菌株DNA相似度是中等，表明它們代表了既有區(qū)別又關(guān)系密切的物種。由于A組菌株不能單獨(dú)形成子囊，故將其定義為假絲酵母新物種-類西弗念珠菌(Candidaallociferrii)；B組包含了Stephanoascusciferrii、Candidaciferrii和Sporothrixcatenata，并且能頻繁地產(chǎn)孢子，其生理特性介于A組和C組之間，所以B組統(tǒng)一命名為Stephanoascusciferrii；而C組因其與復(fù)合群內(nèi)所有菌株DNA相似值較低(10%～41%)，獨(dú)立于其他菌株，因此被認(rèn)為是Stephanoascusciferrii復(fù)合群中一個(gè)獨(dú)立的品種-Candidamucifera[6]。

2 西弗射盾子囊霉的生物學(xué)性狀及培養(yǎng)鑒定

2.1 生物學(xué)性狀

菌落特征 西弗射盾子囊霉在血瓊脂平板、科瑪嘉顯色平板和沙堡弱培養(yǎng)基等培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)。血平板35℃及28℃培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)乳白色細(xì)小菌落；48 h后菌落呈鑲嵌瓊脂生長(zhǎng)；延長(zhǎng)培養(yǎng)菌落變粗糙呈奶油色或淡黃色，中心似菜花樣，有細(xì)微絨毛狀氣生菌絲?？片敿物@色平板培養(yǎng)24 h為無(wú)色細(xì)小菌落且不易刮起和研碎；48 h后菌落光滑濕潤(rùn)針尖狀并逐漸顯藍(lán)色；72 h菌落變粗糙呈中心凹陷，邊緣皺起并突出平板生長(zhǎng)；延長(zhǎng)培養(yǎng)菌落形似藍(lán)色的小蘑菇一般。在沙堡弱培養(yǎng)基上最初為不明顯乳白色酵母樣菌落，延長(zhǎng)培養(yǎng)為黃色加重的奶黃色菌落[1,8-9](見(jiàn)圖1)。

圖1 西弗射盾子囊霉不同培養(yǎng)時(shí)間生長(zhǎng)菌落Fig.1 Characteristics of Stephanoascus ciferrii colonies in different time

鏡下特征 可采用革蘭染色、棉蘭染色、熒光染色及墨汁染色進(jìn)行鏡下觀察。大致呈現(xiàn)為酵母樣真菌，呈球形或少許突起，可見(jiàn)呈樹(shù)枝狀分枝細(xì)長(zhǎng)的菌絲，卵圓形的單細(xì)胞孢子延菌絲周邊或者散在分布[4,8]。

2.2 培養(yǎng)鑒定

真菌的鑒定方法有表型鑒定、生化鑒定、分子水平鑒定和蛋白質(zhì)水平鑒定等。隨著分子鑒定手段的提升，真菌的分類也在不斷變化。而快速、準(zhǔn)確的菌種鑒定是啟動(dòng)適當(dāng)?shù)目拐婢委煹年P(guān)鍵[10]。

形態(tài)鑒定 臨床樣本的直接涂片鏡檢在識(shí)別特定真菌中有重要價(jià)值。而對(duì)于西弗射盾子囊霉的表型鑒定，則更多的是依賴培養(yǎng)后的涂片染色和菌落特征識(shí)別。顯微鏡下可觀察到西弗射盾子囊霉酵母樣真菌形態(tài)，可見(jiàn)孢子和菌絲。在各種培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同的菌落特征，例如在科馬嘉平板上呈藍(lán)色小蘑菇樣菌落，在沙堡弱培養(yǎng)基中為黃色菌落，但共有的特性則是菌落質(zhì)地硬、不易刮起。

生化檢測(cè) 文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)于西弗射盾子囊霉的鑒定可采用Vitek 2、API 20C AUX、ID 32C等系統(tǒng)。Vitek 2和API 20C AUX鑒定系統(tǒng)較ID 32C更方便、快捷和精準(zhǔn)，臨床應(yīng)用也更為廣泛。PCR的快速性和API 20C AUX的全面結(jié)合能提高酵母菌的鑒定準(zhǔn)確率[10]。雖然各種生化反應(yīng)系統(tǒng)能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)鑒定，但在一些少見(jiàn)菌種及生化反應(yīng)不活躍菌種的鑒定上仍受限，與表型檢測(cè)、分子檢測(cè)等多種檢測(cè)手段相結(jié)合可提升其鑒定能力。

血清學(xué)方法 侵襲性真菌感染發(fā)生時(shí)可通過(guò)檢測(cè)患者體內(nèi)真菌特異抗原實(shí)現(xiàn)診斷，包括β-D-1，3葡聚糖、半乳甘露聚糖和隱球菌莢膜抗原等[4]；亦可通過(guò)特異抗體的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)既往感染的診斷。但現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)或指標(biāo)均未在西弗射盾子囊霉的臨床感染中應(yīng)用，因此仍需探索新型血清學(xué)標(biāo)志物用于該菌的臨床感染診斷。

分子水平 真菌18S rDNA和ITS測(cè)序分析是真菌菌種鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。ITS測(cè)序主要是針對(duì)真菌多樣性的研究，準(zhǔn)確度較高；18S rDNA測(cè)序針對(duì)的是真核微生物，檢測(cè)范圍廣，就真菌來(lái)說(shuō)精確度相對(duì)較低。有研究對(duì)臨床分離12株西弗念珠菌采用Vitek 2 compact系統(tǒng)鑒定和ITS測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，顯示商品化鑒定系統(tǒng)在該菌種鑒定上較為準(zhǔn)確[1]。

蛋白水平 質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)以其準(zhǔn)確性、鑒定快速性等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的檢測(cè)平臺(tái)。并經(jīng)過(guò)了大量的臨床菌株鑒定的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[11]。在西弗念珠菌臨床感染報(bào)道中，采用Vitek 2 compact、ITS測(cè)序和MALDI-TOF MS 3種鑒定技術(shù)均實(shí)現(xiàn)了1例氟康唑不敏感西弗念珠菌的準(zhǔn)確鑒定[8]，進(jìn)一步驗(yàn)證各種鑒定技術(shù)的一致性。

3 西弗射盾子囊霉的體外藥敏數(shù)據(jù)

目前尚未建立西弗射盾子囊霉的最低抑菌濃度(MIC)標(biāo)準(zhǔn)，大多參照念珠菌解釋標(biāo)準(zhǔn)。臨床分離菌株大多對(duì)氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑，兩性霉素B、氟胞嘧啶和卡泊芬凈等抗真菌藥物敏感[1,3]，但也出現(xiàn)過(guò)對(duì)氟康唑等抗真菌藥物耐藥(MIC=32 μg/mL)或不敏感菌株[8]。臨床檢出西弗射盾子囊霉藥敏試驗(yàn)多采用ATB Fungus 3進(jìn)行，但該試劑適用于念珠菌和隱球菌藥敏測(cè)試，用于西弗射盾子囊霉仍有待商榷[1]。真菌耐藥主要為膜通透性降低、藥物作用靶酶增多、缺失或者結(jié)構(gòu)改變以及細(xì)胞壁合成障礙等[12]，但目前對(duì)西弗射盾子囊霉的抗真菌藥物耐藥機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。近年文獻(xiàn)報(bào)道臨床檢出西弗射盾子囊霉藥敏數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 西弗射盾子囊霉臨床感染分離及藥敏數(shù)據(jù)Tab.1 Clinical infection and drug susceptibility data of Stephanoascus ciferrii

(續(xù)表)

4 西弗射盾子囊霉的臨床感染與治療

西弗射盾子囊霉作為一種條件致病菌，在免疫正常個(gè)體一般不致病或僅造成淺表感染，而在免疫力低下患者易感且后果嚴(yán)重[34]。淺表感染中以耳部、皮膚、趾甲、足部等[15,24]較為多見(jiàn)，可導(dǎo)致慢性中耳炎、顆粒樣鼓膜炎等耳部疾病[1,13]，亦可引起眼部病變?nèi)缪劭魞?nèi)腫[3,16]，壞疽患者的足部和有皮膚病變部位的混合感染等[22,24,29]。而在一些惡性腫瘤、糖尿病等免疫力低下患者可引起深部感染及系統(tǒng)性感染[8]。最常見(jiàn)在血流、肺組織或其他無(wú)菌體液(如腦脊液、腹透液、膽汁等)中檢出，可導(dǎo)致新生兒血流感染、COPD患者肺部感染、免疫低下患者血流和中心靜脈感染等[17,19,27]。文獻(xiàn)報(bào)道1例62歲急性髓系白血病患者全身感染氟康唑耐藥西弗射盾子囊霉[28]；一項(xiàng)慢性腹瀉患者的真菌研究中發(fā)現(xiàn)該菌可加重腹瀉的嚴(yán)重程度，引起嚴(yán)重脫水、營(yíng)養(yǎng)不良和腹瀉，尤其是對(duì)身體衰弱患者、免疫功能低下的患者、幼兒和老年人[30]。造成全身侵襲性的嚴(yán)重真菌感染有多種因素，包括免疫力缺失或低下、高齡與低齡、患者有基礎(chǔ)病變、進(jìn)行侵襲性操作和多種抗菌藥物的混合使用等。西弗射盾子囊霉不僅造成人體的淺表和侵襲性感染，亦可造成動(dòng)物感染。首次動(dòng)物報(bào)道是從貓耳中檢出[35]，在英國(guó)馬皮膚和黏膜中也曾有檢出[36]，而其是否為人畜共患病尚存未知[37]。

西弗射盾子囊霉的臨床感染報(bào)道近年來(lái)有所增多，準(zhǔn)確識(shí)別并進(jìn)行抗真菌藥敏試驗(yàn)是正確治療和管理的關(guān)鍵。在多數(shù)感染案例中大多使用氟康唑進(jìn)行救治，1項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)10年的念珠菌藥物敏感監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)氟康唑敏感率近50%[38]；也有一些報(bào)道如在真菌性眼內(nèi)炎中用卡泊芬凈治愈的案例[3]；1例結(jié)核性胸膜炎合并HIV感染的患者腦脊液中檢出西弗念珠菌，并顯示對(duì)氟康唑等抗菌藥物呈現(xiàn)多重耐藥性，患者最終治療失敗[4]?？梢?jiàn)淺表感染者易于救治，一旦造成侵襲性感染則可能對(duì)治療造成很大的挑戰(zhàn)。越來(lái)越多不常見(jiàn)的致病菌或新菌種被發(fā)現(xiàn)和檢出，不斷加強(qiáng)對(duì)這些少見(jiàn)菌株的關(guān)注和學(xué)習(xí)，深入了解并研究菌株生物特性與致病性，對(duì)臨床治療至關(guān)重要。

5 小結(jié)與展望

臨床少見(jiàn)真菌的培養(yǎng)與鑒定對(duì)實(shí)際臨床治療至關(guān)重要。西弗射盾子囊霉的分離鑒定應(yīng)注意與隱球菌等菌種的鑒別，準(zhǔn)確的菌種鑒定是實(shí)現(xiàn)臨床治療的關(guān)鍵。更多的臨床分離菌株的藥敏監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)及臨床治療經(jīng)驗(yàn)對(duì)于抗真菌治療意義重大。深入研究其致病性及可能的耐藥機(jī)制對(duì)更好地防控由該菌造成的感染具有重要意義。有文獻(xiàn)報(bào)道西弗射盾子囊霉有生物轉(zhuǎn)化功能[39]，對(duì)于西弗射盾子囊的利用在未來(lái)還有很多可能性，而對(duì)其致病機(jī)制也需進(jìn)一步探索。西弗射盾子囊霉雖然是一種不常見(jiàn)的酵母菌，但仍應(yīng)引起臨床醫(yī)生和微生物工作者的重視。