新生隱球菌SER5基因的敲除與功能驗(yàn)證研究

童雙禮 吳潔 李莎莎 桑軍軍1,

[1.福建醫(yī)科大學(xué)福總臨床醫(yī)學(xué)院(第九○○醫(yī)院)燒傷整形科，福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院皮膚科，福州 350001；3.32231部隊(duì)衛(wèi)生所，福州 350001；4.廈門(mén)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福州 350001]

新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)是一種普遍存在于自然環(huán)境中的機(jī)會(huì)性致病真菌，艾滋病患者等免疫缺陷人群和免疫正常人群都可受累,能引起多種部位的感染，其中以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染最為常見(jiàn)，預(yù)后也最為嚴(yán)重，可引發(fā)致命性的腦膜腦炎[1]。根據(jù)最新的流行病學(xué)研究估計(jì)，全球艾滋病患者中每年約有菌感染約278 000例，而感染死亡患者約181 000例[2]。

37℃生長(zhǎng)、莢膜、黑色素、尿素酶等是目前已知的新生隱球菌的毒力因子[3]。蛋白酶在維持真菌生理正常功能中扮演著重要的角色[4]。新生隱球菌絲氨酸蛋白酶被認(rèn)為是隱球菌的潛在毒力因子，但其在隱球菌感染中的作用和地位還未明確[5]。本研究中，我們通過(guò)基因敲除獲得了絲氨酸蛋白酶家族基因中SER5(CNAG_02494)的基因缺失株，并對(duì)其表型和功能進(jìn)行了初步探究。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株和引物 本研究中使用的菌株為新生隱球菌格魯比變種標(biāo)準(zhǔn)菌株H99，質(zhì)粒為pJL517、pCH233，使用的引物見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 YPD液體培養(yǎng)基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)、YPD固體培養(yǎng)基(1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂)、山梨醇培養(yǎng)基(YPD+1 mol/L山梨醇)、選擇培養(yǎng)基(YPD+200mg/L G418/Neomycin，YPD+100 mg/L Nourseothricin)、LB(0.5%酵母膏、1%蛋白胨、0.5%氯化鈉)、LA(LB+100mg/L Ampicilin)、LK(LB+100 mg/L Kanamycin)、YNB培養(yǎng)基(0.67%酵母基本氮源、2%瓊脂)、應(yīng)激培養(yǎng)基(YPD或YNB加入對(duì)應(yīng)的藥劑)、In-Fusion?HD Cloning Kit、High-Fidelity DNA Polymerase、標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿、鑷子、玻璃珠、試管、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、PBS等。

主要儀器和器材 實(shí)驗(yàn)中主要用到的儀器包括Bio-Rad 真空凍干機(jī)、Thermo高速離心機(jī)、Bio-Rad基因槍、超凈臺(tái)、30℃恒溫培養(yǎng)箱、37℃恒溫培養(yǎng)箱、39℃培養(yǎng)箱、天平、搖床、水浴鍋、電泳凝膠成像分析系統(tǒng)、Bio-Rad PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

菌株保存與培養(yǎng) 新生隱球菌菌株在含10%甘油YPD液體培養(yǎng)基中于-80℃冰箱中保藏，使用時(shí)劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2 d，取單克隆單克隆菌落在YPD液體培養(yǎng)基30℃搖菌過(guò)夜。

基因敲除與回復(fù) 以H99基因組為模版，合成基因編碼區(qū)兩端各1 000 bp左右的DNA片段，以pJL517為模版合成抗性篩選基因片段，使用overlap PCR的方法連接基因上游片段，抗性基因片段以及基因下游片段。取隱球菌單克隆菌落搖菌、清洗、重懸后加入YPD+1 mol/L山梨醇培養(yǎng)基，用玻璃珠涂勻，30℃孵育備用。純化和濃縮上述獲得的DNA片段，將金粉與DNA混勻，基因槍轟擊平鋪于YPD+1 mol/L山梨醇培養(yǎng)基的隱球菌。將樣品放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，加入刮板，將菌懸液轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基，30℃孵育3～5 d，選取10個(gè)單克隆轉(zhuǎn)移到Y(jié)PD培養(yǎng)基，重復(fù)2次，再將菌落轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基，確認(rèn)抗性穩(wěn)定，使用PCR驗(yàn)證。PCR構(gòu)建回復(fù)基因片段，包含基因編碼區(qū)，及其前后各1 000 bp的區(qū)域，同時(shí)將pCH233線性化，通過(guò)In-Fusion HD Cloning Kits合成質(zhì)粒，選取驗(yàn)證后敲除基因的菌株，按上述方法通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化，選擇培養(yǎng)基篩選回復(fù)株，選取陽(yáng)性克隆的驗(yàn)證。

體外應(yīng)激應(yīng)答檢測(cè) 挑取單克隆搖菌、清洗、重懸，將濃度最終調(diào)整為2.5×108cells/mL，將配好濃度的菌懸液加入到96孔板中，倍比稀釋成6個(gè)濃度，分別為2.5×108cells/mL、2.5×107cells/mL、2.5×106cells/mL、2.5×105cells/mL、2.5×104cells/mL、2.5×103cells/mL備用。依照配方制備新鮮培養(yǎng)基，所需配方見(jiàn)實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)基。使用排槍每孔取4 μL的菌液，平行點(diǎn)到培養(yǎng)基上。干燥后放入相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)3～5 d，將相應(yīng)的培養(yǎng)基生長(zhǎng)結(jié)果照相。

黑色素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) 配制菌懸液濃度到2.5×108cells/mL，取4 μL滴入DOPA培養(yǎng)板，分別置于30℃和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、5、7 d，并分別拍照。

隱球菌莢膜的誘導(dǎo) 將隱球菌在沙堡弱液體培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，離心洗滌后使用PBS稀釋10倍的沙堡弱液體培養(yǎng)基(加入MOPS緩沖液調(diào)整至50 mmol/L)配制濃度為5×106cells/mL于培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h拍照，使用ImageJ軟件每株測(cè)量80～100個(gè)內(nèi)外徑長(zhǎng)度。

隱球菌尿素酶檢測(cè) 配制2.5×108cells/mL菌懸液，取4 μL加入尿素培養(yǎng)板，分別放入30℃和37℃培養(yǎng)箱，24 h后拍照。

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 配制菌懸液濃度為1×106cells/mL、1×103cells/mL，將200 μL菌懸液加入96孔板中，37℃每隔6 h在OD600讀數(shù)，將讀數(shù)錄入GraphPad Prime5繪制生長(zhǎng)曲線。

酵母雙雜交實(shí)驗(yàn) 以SER5基因cDNA為誘餌構(gòu)建膜酵母雙雜交誘餌載體，篩選膜酵母雙雜交pPR3N-FW cDNA文庫(kù)，經(jīng)過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆的多重報(bào)告基因檢測(cè)、DNA測(cè)序和BLAST比對(duì)分析，確定與Ser5相互作用的蛋白基因。

2 結(jié) 果

2.1 基因敲除菌及回復(fù)株構(gòu)建成功

通過(guò)PCR擴(kuò)增Ser5編碼片段，敲除株Ser5編碼片段沒(méi)有出現(xiàn)，回復(fù)株Ser5編碼片段陽(yáng)性，說(shuō)明ser5Δ，ser5Δ+SER5構(gòu)建成功。鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 SER5基因敲除及回復(fù)驗(yàn)證PCR電泳結(jié)果Fig.1 Validation of SER5 gene knocking-out and reconstitution

2.2 體外應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

ser5Δ在不同溫度下、氧化應(yīng)激、高鹽高滲、細(xì)胞壁應(yīng)激培養(yǎng)基生長(zhǎng)與野生株和回復(fù)株相比無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖2)，提示絲氨酸蛋白酶Ser5對(duì)隱球菌溫度敏感性、氧化應(yīng)激、高鹽高滲耐受及細(xì)胞壁功能完整性沒(méi)有顯著影響。

圖2 體外應(yīng)激實(shí)驗(yàn)：A.溫度；B.硝化應(yīng)激和氧化應(yīng)激；C.高鹽高滲；D.細(xì)胞膜和細(xì)胞壁應(yīng)激ser5Δ無(wú)明顯變化Fig.2 The phenotypes of ser5Δ mutants in stress: A. Temperature sensitivity; B. Oxidative and nitrosative stress C. High salts and osmotic stress; D. Cell-wall and cell-membrane stress. ser5Δ didn’t show increased sensitivity to stress compared to WT and ser5Δ +SER5 reconstituted strains.

2.3 Ser5參與黑色素的誘導(dǎo)

ser5Δ在30℃培養(yǎng)表現(xiàn)為黑色素生成顯著減少，黑色素的缺失在37℃更加明顯(見(jiàn)圖3)。當(dāng)SER5基因回復(fù)時(shí)，ser5Δ+SER5恢復(fù)了黑色素產(chǎn)生能力，說(shuō)明SER5在黑色素誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖3 菌株在左旋多巴培養(yǎng)基黑色素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn) ser5Δ在30℃培養(yǎng)表現(xiàn)為黑色素生成顯著減少，黑色素的減少在37℃更加明顯；回復(fù)株ser 5Δ+SER5 恢復(fù)了黑色素生成能力。Fig.3 Growth of ser mutants on L-DOPA media. ser 5Δ exhibited melanin synthesis decreasing on DOPA medium 30℃,and this defect was exacerbated at 37℃, and the phenotype was recuperated in the ser 5Δ+SER5 reconstituted strains

2.4 Ser5對(duì)隱球菌莢膜無(wú)明顯影響

ser5Δ對(duì)隱球菌莢膜誘導(dǎo)無(wú)顯著影響，莢膜大小與野生株和回復(fù)株無(wú)明顯差異(P>0.05，見(jiàn)圖4),提示Ser5對(duì)莢膜合成無(wú)顯著影響。莢膜大小的比較取外徑與內(nèi)徑的比值，統(tǒng)計(jì)使用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 Ser5對(duì)尿素酶無(wú)明顯影響

在30℃和37℃下，ser5Δ分解尿素能力與野生株和回復(fù)株無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖5)，提示Ser5對(duì)隱球菌尿素酶無(wú)顯著影響。

圖4 莢膜誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：A.莢膜誘導(dǎo)后墨汁染色；B.莢膜厚度統(tǒng)計(jì). ser5Δ莢膜無(wú)明顯變化 圖5 尿素酶實(shí)驗(yàn)：ser5Δ對(duì)尿素分解能力無(wú)明顯變化Fig.4 Capsule growth on diluted Sabouraud's medium. A: Picture of a representative cell in an India Ink suspension. B: Measurement of the capsule size for the samples described above. The size of the capsule in ser5Δ showed no significant difference compared to WT and ser5Δ +SER5 reconstituted strains Fig.5 Growth of ser mutants on urea media. ser5Δ exhibited normal urease ability

2.6 Ser5不影響隱球菌的生長(zhǎng)速率

在37℃下，ser5Δ在低濃度和高濃度下生長(zhǎng)速率與野生株和回復(fù)株相比未見(jiàn)明顯差異(見(jiàn)圖6)，提示Ser5不影響隱球菌的生長(zhǎng)速率。

圖6 生長(zhǎng)速度實(shí)驗(yàn)：A.起始濃度103 /mL；B.起始濃度106 /mL. ser5Δ生長(zhǎng)無(wú)明顯變化Fig.6 The mutants grown rates at 37℃. A. Cell density at 103 cells/mL; B. Cell density at 106 cells/mL. ser5Δ showed normal grown rate

2.7 Ser5可能與19種蛋白存在相互作用。

酵母雙雜交文庫(kù)中篩選到了32個(gè)酵母初始陽(yáng)性菌落，經(jīng)過(guò)初步鑒定，32個(gè)全部能激活A(yù)DE2、HIS3和LacZ報(bào)告基因，通過(guò)抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序和BLAST比對(duì)分析，去除多次測(cè)序無(wú)結(jié)果和查無(wú)結(jié)果克隆，篩選出28個(gè)陽(yáng)性克隆分別屬于19種不同的蛋白編碼基因(見(jiàn)表2)。

表2 回轉(zhuǎn)驗(yàn)證Ser 5的相互作用蛋白基因列表Tab.2 The list of interacting protein genes of Ser 5

3 討 論

蛋白酶一直被認(rèn)為是病原性真菌的毒力因子之一，很多病原性真菌在體外或感染時(shí)會(huì)分泌蛋白酶[6]，有研究表明，隱球菌蛋白酶可能與隱球菌從肺泡侵入肺組織以及通過(guò)血腦屏障過(guò)程中起重要作用[7-9]，而絲氨酸蛋白酶是最大的一類(lèi)蛋白酶家族。有研究表明，新生隱球菌Ser5編碼基因在體內(nèi)，體外CSF，YPD生長(zhǎng)時(shí)持續(xù)高表達(dá)且差異明顯[10]，為了進(jìn)一步研究SER5基因的功能，本研究構(gòu)建了SER5基因的缺失菌株，通過(guò)表型分析發(fā)現(xiàn)Ser5可影響新生隱球菌黑色素的生成。黑色素是保護(hù)真菌抵御氧化、化學(xué)和物理降解的重要物質(zhì)，可以保護(hù)菌體在體內(nèi)被免疫細(xì)胞氧化殺傷[11]。在新生隱球菌中，黑色素合成機(jī)制目前尚不清楚，黑色素的合成涉及到合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、聚集、沉積的過(guò)程，是在漆酶的作用下在小囊泡或者黑色素小體上進(jìn)行，然后含有黑色素的轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡將黑色素運(yùn)送到細(xì)胞壁上形成黑色素環(huán)，被黑色素環(huán)覆蓋的隱球菌對(duì)氧化刺激、酸性環(huán)境、冷熱壓力及抗生素有更強(qiáng)的抵抗性[12]。黑色素合成的影響因素很多，其關(guān)鍵酶是漆酶(Lac1)，其他因素包括溫度、多價(jià)陽(yáng)離子、泛素、轉(zhuǎn)錄因子等[13]，但目前尚無(wú)絲氨酸蛋白酶影響黑色素生成的報(bào)道。

為了進(jìn)一步研究Ser5影響黑色素合成的可能機(jī)制，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選了與Ser5相互作用的蛋白。在與Ser5相互作用的蛋白中，包含囊泡相關(guān)膜蛋白VAMP7(XM_012190826.1，CNAG_07029)、甾醇還原酶ERG4(XM_012192772.1，CNAG_02830)[14]、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(XM_012192724.1，CNAG_02761)[15]、GDP-甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GMT1(XM_012195163.1，CNAG_05817)[16]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定蛋白YOP1(XM_012195364.1，CNAG_06646)[17]、乙醇胺磷酸轉(zhuǎn)移酶(XM_012195294.1，CNAG_06543)、膜泡運(yùn)輸t-SNAREs同源物Vti1a(XM_012195775.1, CNAG_03306)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白(XM_012190932.1，CNAG_00469)、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(XM_012197702.1, CNAG_06026)等。上述與Ser5相互作用蛋白中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定蛋白可能與黑色素合成相關(guān)，VAMP7、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Gmt1、Vti1a可能與黑色素膜泡運(yùn)輸相關(guān)，提示Ser5可能參與黑色素的合成或轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

綜上，本研究成功構(gòu)建了SER5基因的缺失菌株, 通過(guò)體外應(yīng)激應(yīng)答、黑色素誘導(dǎo)、莢膜誘導(dǎo)、尿素酶測(cè)定、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)探究SER5基因在新生隱球菌中的功能，結(jié)果SER5基因敲除后，新生隱球菌對(duì)外界應(yīng)激反應(yīng)、莢膜、生長(zhǎng)、尿素酶無(wú)明顯變化，黑色素合成顯著減少，提示Ser5在新生隱球菌黑色素合成中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，篩選了部分與Ser5相互作用的蛋白，為進(jìn)一步研究Ser5的功能提供了研究基礎(chǔ)，相關(guān)蛋白的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的分子研究來(lái)證實(shí)。