基于三維熒光與BLLS/RBL同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中3種喹諾酮類抗生素

趙興濤，車先閣，王書濤，劉詩瑜，苑媛媛

(燕山大學(xué) 電氣工程學(xué)院 河北省測(cè)試計(jì)量技術(shù)及儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004)

1 引 言

我國(guó)每年蜂蜜的出口可占全球蜂蜜總出口量的20%[1]，蜂蜜質(zhì)量問題越來越受到廣泛關(guān)注。2019年8月的國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管部門在發(fā)布食品不合格情況通告中，曾有多批次蜂產(chǎn)品檢出喹諾酮類抗生素，因此,建立一種快速有效的蜂蜜中抗生素檢測(cè)體系是尤為重要的。喹諾酮類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)學(xué)中[2]。在蜂蜜實(shí)際生產(chǎn)過程中,喹諾酮類藥物可以防治蜂病如美洲幼蟲腐臭病、麻痹病等，并且能夠提高蜂蜜產(chǎn)能[3]。但是，喹諾酮類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，容易產(chǎn)生蓄積和殘留,人體長(zhǎng)期服用抗生素殘留過量的蜂蜜會(huì)造成潛在的危害，特別是機(jī)體對(duì)抗生素的耐藥性[4]。

目前，針對(duì)蜂蜜中喹諾酮類抗生素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。夏環(huán)等[5]采用分子印跡固相萃取-高效液相色譜法對(duì)蜂蜜中3種喹諾酮類抗生素殘留進(jìn)行了檢測(cè)，3種抗生素的加標(biāo)回收率范圍為96.5%～104.1%；徐宜宏等[6]采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中多種抗生素進(jìn)行了殘留檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的平均回收率范圍為68.0%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%～15.5%。但是這些方法對(duì)操作人員的要求較高，樣本預(yù)處理比較復(fù)雜，提取過程也不易操作[7]。而三維熒光光譜法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、不需要大量樣本的特點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用到食品有害物質(zhì)殘留檢測(cè)及環(huán)境污染檢測(cè)中[8]。尹春玲等[9]采用三維熒光光譜結(jié)合交替不對(duì)稱三線性分解法(AATLD)對(duì)牛奶中弗洛沙星、培氟沙星和伊諾沙星進(jìn)行了檢測(cè)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意，定量解析出的弗洛沙星、培氟沙星和伊諾沙星的平均回收率分別為97.87±4.91%，97.55±5.45%，102.13±5.75%；Osorio等[10]采用熒光光譜結(jié)合多元校正的方法對(duì)養(yǎng)殖水體中的氟喹諾酮類藥物進(jìn)行了殘留測(cè)定，實(shí)驗(yàn)基于二階和三階校準(zhǔn)共建立了兩種校正模型，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比后證明，三階校正模型U-PLS-RTL擁有更好地?cái)M合度和性能指標(biāo)，得到的樣品回收率范圍在93%～112%之間。但是目前采用三維熒光光譜法對(duì)蜂蜜中喹諾酮類抗生素的檢測(cè)研究的類似報(bào)導(dǎo)很少。

本文采用三維熒光光譜法對(duì)蜂蜜可能存在的3種喹諾酮類抗生素殘留，氟甲喹(FLU)、恩諾沙星(ENR)和左氧氟沙星(LVFX)的混合組分溶液進(jìn)行熒光測(cè)量，將二級(jí)瑞利散射區(qū)置零和空白溶劑扣除法消除了光譜中的二級(jí)瑞利散射和拉曼散射干擾，采用小波優(yōu)化集合經(jīng)驗(yàn)?zāi)B(tài)分解(ensemble empirical mode decomposition, EEMD)的方法對(duì)光譜進(jìn)行去噪，完成光譜預(yù)處理過程。結(jié)合雙線性最小二乘/殘差雙線性(BLLS/RBL)方法，對(duì)預(yù)處理前后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，該檢測(cè)手段有效地解決了混合組分中出現(xiàn)的光譜重疊問題，實(shí)現(xiàn)了利用“數(shù)學(xué)分離”代替“化學(xué)分離”。預(yù)處理前后的定量結(jié)果對(duì)比表明：樣本經(jīng)過預(yù)處理后，其定性、定量結(jié)果更為準(zhǔn)確。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：荊花蜂蜜，京東汪氏蜂蜜官方旗艦店購買；喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)LU標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)、ENR標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，LVFX標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)均購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉SDS(化學(xué)純)購買于國(guó)藥試劑網(wǎng)；超純水，由優(yōu)普純水儀(成都優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司)制備。

實(shí)驗(yàn)儀器：FA1004精密電子秤(鄭州寶晶電子科技有限公司)；FS920穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國(guó)愛丁堡公司)；HY-5A回旋振蕩器(國(guó)華電器有限公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣本制備

實(shí)驗(yàn)溶劑制備：精確稱量10 g SDS標(biāo)準(zhǔn)品，適量超純水溶解至燒杯中，水浴加熱10 min，待冷卻至室溫后，用超純水定容至100 mL棕色容量瓶中，得到濃度為100 g·L-1的SDS儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。移液槍量取5.5 mL SDS儲(chǔ)備液，用超純水定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為5.5 g·L-1的SDS實(shí)驗(yàn)溶液。

蜂蜜溶液制備：精確稱量2.733 39 g蜂蜜溶于100 mL,、濃度為5.5 g·L-1的SDS溶劑中，得到蜂蜜濃度為27.333 9 g·L-1的蜂蜜實(shí)驗(yàn)溶液。

抗生素單組分對(duì)照樣本制備：精確稱量FLU、ENR、LVFX標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g，用SDS實(shí)驗(yàn)溶液定容至100 mL容量瓶中，回旋振蕩20 min后，得到濃度為0.1 g·L-1的3種物質(zhì)的儲(chǔ)備液，于4 ℃避光保存。移液槍量取0.4 mL FLU儲(chǔ)備液、0.04 mL的ENR和0.02 mL的LVFX儲(chǔ)備液，用SDS工作溶液定容至100 mL容量瓶中，得到40 μg·L-1的FLU實(shí)驗(yàn)溶液、4 μg·L-1的ENR實(shí)驗(yàn)溶液和2 μg·L-1的LVFX實(shí)驗(yàn)溶液。

蜂蜜抗生素殘留溶液制備：分別取適量抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次添加進(jìn)蜂蜜溶液中，共配制了16組不同濃度的抗生素殘留溶液樣本，各樣本蜂蜜的濃度均為27.333 9 g·L-1，其中C1-C10設(shè)定為校正集，T1-T6設(shè)定為預(yù)測(cè)集，如表1所示。

表1 校正樣本及預(yù)測(cè)樣本濃度Tab.1 Concentration of calibration and prediction samples μg/L

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 光譜預(yù)處理

3.1.1 去散射處理研究

將FS920光譜儀進(jìn)行參數(shù)設(shè)置： 激發(fā)波長(zhǎng)范圍設(shè)置為250～450 nm，步長(zhǎng)為 5 nm; 發(fā) 射 波 長(zhǎng) 范 圍設(shè)置為290～550 nm，步長(zhǎng)為2 nm; 并設(shè)置發(fā)射波長(zhǎng)滯后激發(fā)波長(zhǎng)10 nm，以消除一級(jí)瑞利散射干擾[11]。入射狹縫和出射狹縫設(shè)置為2 mm，樣品室溫度設(shè)置為恒定20 ℃。

設(shè)置完畢后，對(duì)實(shí)驗(yàn)配制樣本進(jìn)行三維熒光光譜掃描，得到16組131×41的數(shù)據(jù)矩陣。其中測(cè)得純蜂蜜樣本C3的三維熒光投影圖和等高線圖如圖1所示。

從圖1中可以看出，光譜圖存在二級(jí)瑞利散射(1)和拉曼散射(2)的干擾。二級(jí)瑞利散射的特點(diǎn)是散射波長(zhǎng)約為激發(fā)波長(zhǎng)的2倍，而拉曼散射的散射波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)略大，隨著激發(fā)波長(zhǎng)的變化而相應(yīng)變化，且與激發(fā)波長(zhǎng)保持恒定的頻率差。這兩種散射均無法通過儀器參數(shù)設(shè)置來消除，且散射的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于被測(cè)物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，使得被測(cè)物質(zhì)的光譜被掩蓋，無法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行精確分析。

圖1 蜂蜜原始光譜圖Fig.1 Original spectrum of honey

為此，采用將二級(jí)瑞利散射區(qū)置零和空白溶劑扣除的方法來消除光譜中的二級(jí)瑞利散射和拉曼散射，蜂蜜去散射后的熒光光譜圖如圖2所示。

從圖2中可以看出，去除光譜中的二級(jí)瑞利散射后，蜂蜜的光譜得以部分顯現(xiàn)出來，但是由于拉曼散射的存在，不能反映出光譜的全部信息。當(dāng)去除拉曼散射后，蜂蜜的光譜得以完整地顯現(xiàn)出來，可以看出蜂蜜存在兩個(gè)熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為285/326 nm和345/436 nm處。但是光譜圖存在很明顯的噪聲干擾，不利于后續(xù)的定性、定量研究。

圖2 蜂蜜去散射后的熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectrum of honey after de scattering

3.1.2 小波優(yōu)化EEMD算法原理與評(píng)價(jià)指標(biāo)

EEMD工作原理的實(shí)質(zhì)是，通過EEMD分解被測(cè)光譜數(shù)據(jù)， 得到若干個(gè)本征模態(tài)分量(intrinsic mode function, IMF)，按頻率從高到低排列，通過將噪聲集中的IMF分量舍去，剩余分量疊加重構(gòu)，完成對(duì)光譜的去噪過程[12]。

但是該方法同樣存在缺陷，即保留的IMF分量中，也有少量噪聲存在，相應(yīng)地，舍棄的IMF分量也有非噪聲信號(hào)存在，舍棄過多分量會(huì)造成過度去噪，相反，則會(huì)造成去噪不完全。

為此提出采用小波閾值法對(duì)選取的IMF分量進(jìn)行二次去噪，再進(jìn)行重構(gòu)的思想完成光譜去噪過程。具體過程如下:

(1) EEMD分解：運(yùn)用EEMD方法分解給定的含噪光譜數(shù)據(jù)，得到若干個(gè)IMF分量。

(2) 選取IMF分量：求取原始光譜與其IMF分量的相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)較大的IMF保留不作處理，相關(guān)系數(shù)小的IMF分量，利用小波閾值法進(jìn)行二次去噪處理。

(3) 重構(gòu)光譜：將保留的IMF分量與經(jīng)過小波處理后的IMF分量疊加，得到去噪后的光譜。

3.1.3 去噪結(jié)果評(píng)價(jià)指標(biāo)

引入信噪比(SNR)、波形相似系數(shù)(NCC)、均方根誤差(RMSE)來衡量不同去噪算法的結(jié)果[13]。SNR是指信號(hào)與噪聲的比例，信噪比越高，代表去噪效果越良好。NCC是計(jì)算降噪前后信號(hào)的波形的差異，其值越接近于1，說明過度去噪的程度越小。RMSE表示降噪前后數(shù)據(jù)差值的平方均值。計(jì)算公式分別為

(1)

(2)

(3)

3.1.4 去噪結(jié)果分析

采用小波優(yōu)化EEMD算法對(duì)光譜進(jìn)行去噪處理，去噪后的蜂蜜等高線圖如圖3所示。將去噪結(jié)果分別與小波和EEMD的方法進(jìn)行比較，不同方法去噪結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo)如表2所示。

圖3 小波優(yōu)化EEMD去噪后的蜂蜜等高線圖Fig.3 Contour map of honey after denoising by wavelet optimization EEMD

從圖3和表2可以看出，小波優(yōu)化EEMD算法對(duì)光譜的去噪效果良好，在保持原有光譜特征的基礎(chǔ)上更加平滑、清晰，有利于后續(xù)的定性、定量研究。而且該方法的去噪結(jié)果評(píng)價(jià)指標(biāo)均優(yōu)于小波和EEMD算法。將其余樣本數(shù)據(jù)均進(jìn)行去散射、去噪處理。

表2 不同方法去噪結(jié)果評(píng)價(jià)指標(biāo)Tab.2 Evaluation indexes of different noise removal methods

圖4分別給出經(jīng)光譜預(yù)處理后的3種抗生素對(duì)照樣本和T5樣本的等高線圖，可以看出，LVFX有兩個(gè)熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為300/484 nm和330/484 nm處；ENR有兩個(gè)熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為280/440 nm和330/440 nm處；FLU有一個(gè)熒光峰，分別位于最佳激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為325/364 nm處。3種抗生素物質(zhì)熒光峰位置相似，其混合組分存在著嚴(yán)重的光譜重疊現(xiàn)象，而且抗生素混合組分的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于蜂蜜，掩蓋了蜂蜜的熒光光譜，只憑觀測(cè)光譜圖難以定性區(qū)分溶液各物質(zhì)組分。

圖4 C1、C2、C3和T1樣本預(yù)處理后的等高線圖Fig.4 Contour map after pretreatment of C1, C2, C3 and T1 samples

3.2 蜂蜜抗生素殘留混合溶液的定性定量分析

3.2.1 BLLS/RBL算法

BLLS/RBL是二階校正算法之一，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物分析的二階優(yōu)勢(shì)[14]。

該算法分為校正和預(yù)測(cè)兩個(gè)步驟，將被測(cè)物質(zhì)的光譜數(shù)據(jù)分為校正集和預(yù)測(cè)集兩個(gè)部分，具體實(shí)現(xiàn)步驟如下[15]：首先將校正數(shù)據(jù)矩陣X(大小為J×K)矢量化，將Ic個(gè)校正樣本集分組為JK×Ic的矩陣，記作Vx：

Vx=[vec(X1)|vec(X2)|…|vec(XIc)]

(4)

式中vec為展開操作。

采用直接最小二乘，獲取單位濃度Vs下的單組分物質(zhì)矩陣信息，該過程用公式表示為

Vs=VXY+

(5)

式中：Y+表示大小為I×Nc的校正濃度矩陣，Nc為校正分析物的數(shù)量。

Vs大小為JK×Nc，包含了矢量化的Sn矩陣：

Vs=[vec(S1)|vec(S2)|…|vec(SNc)]

(6)

如果每種分析物只含有一種光譜組分，Sn的秩將為1。因此可以通過每個(gè)大小為J×K的Sn矩陣的單組分奇異值分解(SVD1)來獲取組分輪廓圖,

(bn,gn,cn)=SVD1(Sn)

(7)

式中：bn是第一個(gè)奇異值；gn(J×1)和cn(K×1)分別為第一個(gè)左和右特征向量。

gn和cn分別是第n個(gè)分析物在J和K方向上的歸一化純輪廓。每個(gè)vec(Sn)根據(jù)bn，gn，cn重建，完成校準(zhǔn)步驟。

Srn=bn[gn?cn]

(8)

式中?表示克羅內(nèi)克乘積。

校準(zhǔn)后，如果未知樣品不包含干擾物質(zhì)，則可直接采用最小二乘法來估計(jì)測(cè)試樣品中的濃度。

(9)

式中：Xu為測(cè)試樣品數(shù)據(jù)；yu包含校準(zhǔn)分析物Nc的估計(jì)濃度；Scal可以表示為

Scal=[b1(g1?c1)…bNc(gNc?cNc)]

(10)

3.2.2 定量結(jié)果評(píng)價(jià)指標(biāo)

回收率(RH)表示樣本濃度真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的接近程度，計(jì)算公式分別為

(11)

靈敏度(SL)表示單位濃度的凈分析信號(hào),計(jì)算公式為

(12)

式中：hn是比例系數(shù);||||F是矩陣的Frobenius范數(shù)。

檢出下限(Lout)表示在一定置信度下，可檢測(cè)的最低分析物濃度，計(jì)算公式為

Lout=3.3Sd(0)

(13)

式中：Sd(0)為低濃度樣本預(yù)測(cè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.2.3 定性鑒別

采用核一致值診斷法(core consistency diagonosis, CORCONDIA)[16]分別對(duì)光譜預(yù)處理前后的樣本進(jìn)行組分?jǐn)?shù)估計(jì)，一般認(rèn)為當(dāng)核一致值不低于60%時(shí)，結(jié)果最接近實(shí)際樣本組分?jǐn)?shù)。經(jīng)計(jì)算，未經(jīng)預(yù)處理的樣本，當(dāng)因子數(shù)設(shè)定小于6時(shí)，核一致值高于60%，但是樣本實(shí)際組分?jǐn)?shù)為4，其原因是樣本存在的散射和噪聲被認(rèn)定為了一個(gè)組分。而經(jīng)預(yù)處理后的樣本，因子數(shù)設(shè)定為小于5時(shí)，核一致值高于60%，與實(shí)際組分?jǐn)?shù)相同。由此可知采用預(yù)處理后的樣本的組分?jǐn)?shù)估計(jì)更準(zhǔn)確，而未經(jīng)預(yù)處理的樣本不能正確估計(jì)組分?jǐn)?shù)。

因此，采用BLLS/RBL算法分別對(duì)預(yù)處理前后的實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行定性鑒別，并將各單組份抗生素實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)同樣輸入進(jìn)算法模型中，生成各組分抗生素的真實(shí)光譜曲線，與混合組分解析出的光譜形成對(duì)比，其定性結(jié)果分別如圖5和圖6所示?？梢钥闯觯簲?shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后，解析的溶液中3種抗生素組分的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜與各自的真實(shí)光譜匹配程度十分良好，蜂蜜組分由于在混合溶液中的熒光強(qiáng)度較低，其解析光譜與真實(shí)光譜會(huì)有略微差異，但是綜合解析得到的蜂蜜的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，可以確定溶液中含有蜂蜜組分。

圖5 未經(jīng)預(yù)處理樣本的解析光譜與原光譜Fig.5 Analytical and original spectra of untreated samples

圖6 經(jīng)預(yù)處理后樣本的解析光譜與原光譜Fig.6 Analytical and original spectra of samples after pretreatment

為了更直觀地顯示出定性結(jié)果的準(zhǔn)確性，表3給出了解析光譜與原光譜的相似度，可以看出經(jīng)預(yù)處理后各組分解析光譜與原光譜的波形相似度較高。而未經(jīng)預(yù)處理的定性結(jié)果，解析出的光譜包含散射和噪聲干擾，與原光譜的吻合程度明顯不如經(jīng)預(yù)處理后的結(jié)果，且無法準(zhǔn)確解析出蜂蜜組分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)預(yù)處理后的樣本采用三維熒光光譜結(jié)合BLLS/RBL算法可以完成蜂蜜中喹諾酮類混合物質(zhì)的定性鑒別。

表3 BLLS/RBL解析光譜與原光譜的相似度Tab.3 similarity between BLLS/RBL analytical spectrum and original spectrum

3.2.4 定量檢測(cè)

采用BLLS/RBL分別對(duì)預(yù)處理前后的樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，其結(jié)果如表4所示?？梢钥闯鯞LLS/RBL方法定量經(jīng)過預(yù)處理后的樣本得到的FLU的RH在86.92%～101.38%之間，平均回收率RA達(dá)到94.99±0.63%，Lout為2.08 μg/L；ENR的RH在93.25%～104.20%之間，RA達(dá)到100.20%，Lout為0.18 μg/L；LVFX的RH在95.38%～118.00%之間，RA達(dá)到103.20%，Lout為0.19 μg/L，均優(yōu)于未經(jīng)預(yù)處理樣本的定量結(jié)果。此外，經(jīng)預(yù)處理后的樣本的定量結(jié)果的均方根誤差(RMSE)與靈敏度SL同樣優(yōu)于未經(jīng)預(yù)處理的樣本。由此表明：采用BLLS/RBL算法可以實(shí)現(xiàn)蜂蜜中喹諾酮類抗生素混合組分的定量分析，而且樣本經(jīng)過預(yù)處理后，其定量結(jié)果的精度得到了顯著提高。

表4 濃度預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.4 Concentration prediction results

4 結(jié) 論

針對(duì)蜂蜜中喹諾酮類抗生素的殘留問題，提出了采用三維熒光光譜技術(shù)結(jié)合BLLS/RBL算法實(shí)現(xiàn)蜂蜜中抗生素混合組分殘留的定性、定量檢測(cè)，該方法具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，無需復(fù)雜的樣品前處理過程等特點(diǎn)。研究了光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理對(duì)定性、定量結(jié)果的影響，樣本經(jīng)過預(yù)處理后，定性分析中樣本組分?jǐn)?shù)的確定更加精準(zhǔn)，定量分析中，各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)相比未經(jīng)預(yù)處理的檢測(cè)結(jié)果都有了提高。結(jié)果表明：對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理可以有效提升定性、定量結(jié)果的精度。