液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留的不確定度評定

李德恒, 陸晶芳, 曾金林, 尹丹韓, 李高天

(1. 海南西部中心醫(yī)院,海南 儋州 571700； 2. 杭州市食品藥品檢驗研究院,浙江 杭州 310022)

1 引 言

測量不確定度是表征測量結(jié)果可用性的重要指標,不確定度值的大小決定了測量結(jié)果的可用性[1]。因此,一份完整的測量結(jié)果必須附有不確定度說明才有意義。利巴韋林是一種嘌呤核苷類似物,能抑制多種核酸病毒引起的疾病。該類藥物曾廣泛應用于治療動物病毒性傳染病,如雞痘、雞傳染性喉氣管炎等[2]。但利巴韋林具有一定的遺傳、生殖毒性和致癌性,禽畜濫用可能會導致藥物殘留,使其通過食物鏈進入人體從而影響人體健康[3,4]。

雞蛋是人類經(jīng)常食用的一種動物源食品,其含有最適宜人體吸收的蛋白質(zhì),價格相對較親民,是補充優(yōu)質(zhì)蛋白的第一選擇,市場需求量極大[5]?，F(xiàn)代蛋雞養(yǎng)殖方式多為大規(guī)模、集中性養(yǎng)殖,因其飼養(yǎng)周期長、養(yǎng)殖密度大, 且飼養(yǎng)環(huán)境不易通風， 導致蛋雞在養(yǎng)殖過程中極易發(fā)生各種疾病,而一只雞發(fā)病,會迅速傳染給其他雞,造成養(yǎng)殖場巨大損失。因此,養(yǎng)殖場會大量使用抗生素,來預防及治療疾病,有時抗微生物藥還以促生長的目的被違規(guī)使用,這些都極易造成雞體內(nèi)的藥物殘留[6],而這些殘留也會轉(zhuǎn)移至雞蛋、雞肉等相關產(chǎn)品中。雞蛋中的藥物殘留比之其他動物源性產(chǎn)品引發(fā)的問題要更嚴重,因為雞蛋在雞體內(nèi)形成要經(jīng)歷數(shù)天時間,形成雞蛋的一些成分在雞體內(nèi)或許已存在數(shù)月之久; 因此,雞蛋內(nèi)的藥物殘留往往最難消除[7]。

雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留檢測一般先用酸性磷酸酶水解,將生物體內(nèi)利巴韋林代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為利巴韋林再進行檢測。目前主要的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)等[8～11],國家也制定了相應的檢驗標準；但對其測量不確定度尚未作明確規(guī)定[12],國內(nèi)也無相關研究報道。本研究參考相關文獻[13～16],以已添加利巴韋林的陽性雞蛋樣品為例,依據(jù)標準對雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量的測量不確定度進行分析評定,計算各不確定度分量在整體不確定度中的貢獻,為實際樣品檢測過程進行指導；以此保證測定結(jié)果的準確度和可信度,同時也為其他獸藥殘留測定結(jié)果的不確定度評定提供參考。

2 實驗部分

2.1 試劑、儀器及材料

乙酸銨、三氯乙酸、氨水：分析純,華東醫(yī)藥股份有限公司；甲酸、甲醇、乙腈：色譜純,美國天地(TEDIA)試劑公司；酸性磷酸酯酶：活力≥0.4 unit/mg,美國SIGMA公司；超高效液相色譜-串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用：AB SCIEX Qtrap 4000,美國AB公司,配島津LC-30AD超高效液相色譜儀；超聲波清洗機：型號KQ3200V,昆山超聲儀器有限公司；電子分析天平：ME204E及MS105型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Mill-Q純水儀：美國Milipore公司；苯硼酸基弱陽離子(PBA)固相萃取小柱：美國Agilent公司；雞蛋：市售抽檢樣品；利巴韋林(批號:G154277),含量：99.3%,德國DR公司；13C5利巴韋林(批號：10-MRS-156-1): 含量99.4%,加拿大TRC公司。

2.2 檢測方法

2.2.1 標準溶液配制

分別準確稱取利巴韋林和13C5利巴韋林內(nèi)標10 mg(精確至0.1 mg),用甲醇溶解定容至100 mL容量瓶中, 配制成100 μg/mL的標準儲備液和內(nèi)標標準儲備液; 準確吸取利巴韋林標準儲備液0.5 mL置100 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,配成0.5 μg/mL標準中間液；準確吸取13C5利巴韋林內(nèi)標標準儲備液0.1 mL置100 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,配成0.1 μg/mL內(nèi)標工作液。

標準工作液：準確吸取利巴韋林標準中間液0.1，0.2，1.0，5.0，10.0 mL,13C5利巴韋林內(nèi)標工作液2.0 mL,用乙腈定容至100 mL,得到利巴韋林濃度為1.0, 2.0, 10.0, 50.0, 100.0 μg/L的系列標準工作液,內(nèi)標濃度為2.0 μg/L。

2.2.2 樣品前處理

取樣品雞蛋,將蛋清與蛋黃攪拌均勻,稱取約5 g(精確至0.01 g)均勻試樣,置于50 mL離心管中,添加0.1 mL內(nèi)標工作液,加入12 mL三氯乙酸溶液(20 g/L, pH4.8)和2.5 mL乙腈,振蕩混勻后超聲10 min,10000 r/min離心5 min,取出上清液；再加入10 mL三氯乙酸溶液重復提取一次,離心后合并上清液定容至25 mL的容量瓶中。準確移取5 mL提取液,加入1.0 mL乙酸銨溶液(2.0 mol/L,pH4.8),混勻；加入0.1 mL酸性磷酸酯酶(100 μg/mL),旋渦1 min,于37 ℃培養(yǎng)2 h,取出后用氨水調(diào)pH至8.5(±0.1),混勻,離心；取上清液凈化,嚴格按照PBA固相萃取小柱活化柱子,上樣,依次用5 mL含有10%乙腈-乙酸銨(0.25 mol/L,pH8.5)緩沖液和2.0 mL 5%氨化甲醇淋洗；然后真空抽干5 min,以4.0 mL洗脫液(甲酸-水-甲醇體積比為2:8:90溶液)洗脫至10 mL玻璃管中,氮吹干；準確加入1.0 mL乙腈-水(體積比90:10)溶液溶解殘渣,過0.22 μm濾膜,待LC-MS/MS測定。

2.2.3 色譜質(zhì)譜條件

流動相：A為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%甲酸)，B為乙腈；洗脫梯度：0～2 min (5%A)，2～4 min (5%A～30%A)，4～5 min (30%A～60%A)，5～5.1 min (60%A～5%A)，5.1～10 min (5%A～5%A)；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；電離電壓：5.5 kV；源溫：500 ℃；霧化氣壓(GS1)：55 PSI(1 PSI=6.895 kPa)；輔助氣壓(GS2)：55 PSI(1 PSI=6.895 kPa),利巴韋林和內(nèi)標的質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 利巴韋林的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Parameters for multi-reaction monitoring of ribavirin

2.2.4 數(shù)學模型

雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量按下式計算：

式中：X為樣品中利巴韋林及其代謝物總殘留量,μg/kg；C為樣品溶液中利巴韋林的含量,μg/L；V為樣品定容體積,mL；m為樣品的取樣量,g；f為稀釋倍數(shù)。

注：*為定量離子。

3 結(jié)果與分析qqq

3.1 不確定度來源分析

從測量過程和數(shù)學模型分析,雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量不確定度的因素有：測量的重復性引入的不確定度、回收率產(chǎn)生的不確定度、樣品稱量引入的不確定度、樣品前處理稀釋和定容引入的不確定度、標準溶液配制引入的不確定度、標準曲線擬合引入的不確定度及儀器測定等引入的不確定度。將模型中各不確定度分量按照JJF1059.1—2012測量不確定度評定與表示要求展開[17],雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量的不確定度因果分析如圖1所示。

圖1 雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量的不確定度來源Fig.1 A graphical representation of the source of uncertainty in determination the total residues of ribavirin and its metabolites in eggs

3.2 不確定度分量的評定

3.2.1 測量重復性引入的不確定度

表2 雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量重復測定結(jié)果Tab.2 Repeatability test results of total residues of ribavirin and its metabolites in eggs

3.2.2 回收率產(chǎn)生的不確定度

稱取陰性樣品6份,分別為5.013,5.011,5.010,5.006,5.009,5.011 g(平均質(zhì)量為5.010 g),貝塞爾公式得出S(RmW)=0.002 37 g。按照10.00 μg/kg的添加水品進行加標回收試驗,回收率R的測定結(jié)果分別為98.31%,97.86%,96.95%,97.40%,97.86%,96.49%(平均回收率為97.48%),應用貝塞爾公式得出回收率標準偏差S(Rr)=0.006 70。因此由各分量引入的不確定度及回收率的相對不確定度計算如下：

=0.000 193

=10.4×10-3

urel(RmW),urel(RV),urel(Rr)是回收率不確定度的3個分量。urel(RmW)是回收率測定時稱量樣品引入的相對不確定度，包括了樣品重復性引入的不確定度和天平引入的不確定度urel(mT1) ，其中urel(mT1)的計算如表3所示；urel(RV)是回收率測定時6個平行樣品最終上機定容引入的相對不確定度，定容使用了1 mL移液管吸取定溶液溶解氮吹后的殘渣，其計算引用了表4中1 mL移液管的數(shù)值；urel(Rr)是回收率測定時重復次數(shù)引入的不確定度，其計算引用了回收率標準偏差。

3.2.3 樣品稱量引入的不確定度

由天平引入的不確定度：根據(jù)檢定證書,影響其不確定度的主要因素有于重復性、示值誤差、分辨力、偏載誤差。按均勻分布處理,其數(shù)值具體見表3。

表3 天平1(d=0.1 mg)稱量引入的不確定度Tab.3 Standard uncertainty of balance

其合成標準不確定度及相對標準不確定度分別為：

=0.501 mg

稱取10份樣品,平均值為5.013 g,由重復性引入的標準不確定度及相對標準不確定度分別為：

綜上,樣品稱量引入的相對標準不確定度：

=0.221×10-3

3.2.4 樣品前處理稀釋和定容過程引入的不確定度

樣品前處理稀釋和定容過程使用玻璃量器其準確度等級為A級,依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》規(guī)定的偏差要求[18],玻璃量器引入的相對標準不確定度如表4所示。樣品稀釋和定容過程影響定量的步驟有添加內(nèi)標,上清液定容,提取液的移取以及上機定溶液的加入,玻璃量器使用情況統(tǒng)計如下：25 mL容量瓶一次,5 mL移液管一次,1 mL移液管兩次,設實驗時溫差為±5 ℃,按均勻分布處理,其相對標準不確定度為：

表4 玻璃量器引入的不確定度Tab.4 Uncertainty of glass conainer

=6.12×10-3。

3.2.5 標準溶液配制引入的不確定度

標準物質(zhì)工作溶液配制的不確定度主要來源于標準品的純度、標準品的稱量、標準溶液的稀釋定容等3個方面。

(1)標準品純度

依據(jù)標準品證書,可知利巴韋林純度誤差為±0.2%,按均勻分布處理,則其相對標準不確定度為：

(2)標準品稱量

采用十萬分之一天平,根據(jù)檢定證書,影響其不確定度的主要因素有重復性、示值誤差、分辨力、偏載誤差。按均勻分布處理,其數(shù)值具體如表5所示。

表5 天平2(d=0.01 mg)稱量引入的不確定度Tab.5 Standard uncertainty of balance

天平稱量引入的不確定度為：

=0.067 8 mg

標準品稱量采用減量法,利巴韋林2次稱取數(shù)值分別為38.12, 28.09 mg,按均勻分布處理,則利巴韋林的相對不確定度為：

=0.003

(3)標準溶液稀釋和定容

標準溶液稀釋和定容過程使用玻璃量器其準確度等級為A級,依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》規(guī)定的偏差要求[18],玻璃量器引入的相對標準不確定度如表4所示。標準溶液稀釋和定容過程使用100 mL容量瓶9次,10 mL移液管1次,5 mL移液管1次,1 mL移液管5次,設實驗時溫差為±5 ℃,按均勻分布處理,其相對標準不確定度為：

urel(STD3)

=9.73×10-3

綜上,標準物質(zhì)工作溶液配制過程引入的相對標準不確定度為：

=10.2×10-3

3.2.6 標準工作曲線擬合導致的不確定度

取5個不同濃度級別的含有內(nèi)標混合標準溶液上機測定,擬合而成的線性回歸方程為Y=AX+B(B為截距,A為斜率),測定數(shù)據(jù)及計算結(jié)果如表6 所示。則由標準工作曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度為：

表6 標準曲線結(jié)果Tab.6 Results of standard curve

式中：SR為標準溶液峰面積殘差的標準差,

=0.339 781 μg/kg,

計算得

3.2.7 儀器測定引入的不確定度

查詢校準證書可知,AB SCIEX Qtrap 4000液質(zhì)聯(lián)用儀的峰面積重復性為0.7%,則其相對擴展不確定度為0.7%,按均勻分布計算,其相對標準不確定度為：

3.3 不確定度各分量匯總

對以上分析各不確定度分量進行匯總,具體見表7。

表7 不確定度各分量匯總Tab.7 Summary of uncertainty components

3.4 合成標準不確定度及擴展不確定度

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留的合成相對標準不確定度計算如下：

urel(V)2+urel(STD)2+urel(S)2+

4 結(jié) 論

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留的含量,參照CNAS-GL06-2019《化學分析中不確定度的評估指南》[19],對整個實驗過程中各分量不確定度進行分析。根據(jù)各分量不確定度的計算結(jié)果可知,影響測量結(jié)果不確定度的主要因素有測量的重復性、回收率、樣品的稱量、樣品前處理稀釋和定容、標準溶液配制、標準曲線擬合及儀器測定引入。其中標準曲線擬合和標準溶液配置引入的不確定度分量占分別比為55.87%,14.04%。因此在今后實際樣品檢測工作中要尤其關注標準溶液的相關操作過程,通過增加標準物質(zhì)的稱樣量、使用準確度更高的量器、增加標準系列儲備液的測定次數(shù)、合理確定標準溶液的區(qū)間范圍等措施來降低檢測結(jié)果的不確定度。其次是針對樣品前處理過程引入的不確定度問題,應該加強操作人員的熟練度,確保人員操作得規(guī)范性和一致性,盡量提高測量回收率等措施,以此減少測量不確定度,從而保證測量結(jié)果的準確性和可靠性。另外本研究檢測的是蛋黃和蛋清混勻后的試樣檢測,后續(xù)還可以分別探討蛋白和蛋清中各自的利巴韋林殘留量,為進一步研究雞蛋中利巴韋林代謝殘留過程提供依據(jù)。