2’-巖藻糖基乳糖生物合成專利技術(shù)研究進展

李云飛，欒慶民，劉 峰，孫桂蓮，張 莉，李珍珍，李克文,

（1.保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城 251200；2.山東省功能糖提取與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，山東 禹城 251200；3.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240）

2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL，F(xiàn)ucα-1,2-Gal-β-1,4-Glc）由D-葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）和L-巖藻糖（L-fucose，F(xiàn)uc）構(gòu)成，是人乳寡糖中含量最豐富的低聚糖，在人乳中含量為2～5 g/L，約占已檢出人乳總寡糖的30%[1]。人乳寡糖是嬰兒發(fā)育不可或缺的成分，有助于嬰兒腸道中雙歧桿菌屬（Bifidobacteria）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）等益生菌的生長，有助于預(yù)防病原菌感染，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，促進嬰兒大腦早期發(fā)育等功能[1-2]。

2’-FL作為食品添加劑新品種，已在國外嬰兒配方乳粉、乳制品和特殊用途食品中使用[3]。有多家大型生產(chǎn)商推出產(chǎn)品，例如丹麥Glycom A/S公司、德國Jennewein Biotechnologie GmbH公司、美國GlycoSyn LLC公司、比利時Inbiose（杜邦營養(yǎng)）公司、韓國GeneChem公司等[4-5]， 這些公司主要是利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2’-FL。在發(fā)酵生產(chǎn)能力方面，發(fā)酵效價已達到180 g/L[6]，發(fā)酵罐容積已達200 m3以上[7]。在產(chǎn)品質(zhì)量與安全規(guī)范方面，先后有多家國外機構(gòu)頒布法規(guī)或更新條文，如美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Adiministration，F(xiàn)DA）的GRAS（generally recognized as safe）安全認定、歐盟委員會的系列法規(guī)（EU 2016/375、EU 2016/376、EU 2017/2201、EU 2017/2470、EU 2019/388）、澳大利亞/新西蘭食品標準局通告（2019/1190號、2019/1155號）等，從食品藥品質(zhì)量安全角度通過了產(chǎn)自大腸桿菌K-12和大腸桿菌BL-21（DE3）的2’-FL作為食品新資源的認證，明確了2’-FL純度和最大使用量，并要求在食品成分表中標明“2-O-FL”[8-10]。我國近幾年在2’-FL生物合成重組菌株構(gòu)建方面發(fā)展較快，有多家高校、科研機構(gòu)和企業(yè)投入其中，發(fā)表了大量研究論文，申請了多項發(fā)明專利。在規(guī)范制定方面，國家食品安全風險評估中心于2016年 8月15日公布關(guān)于2’-FL作為食品添加劑新品種的征求意見書，其中明確了2’-FL的功能、用量、生產(chǎn)工藝（大腸桿菌（Escherichia coli）BL-21（DE3）菌株作為加工助劑）、產(chǎn)品規(guī)格和質(zhì)量標準（感官要求、理化指標和微生物指標）等[11]。上述學術(shù)理論研究、專利技術(shù)和質(zhì)量安全規(guī)范制定等方面的成果為相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。本文重點關(guān)注我國近幾年關(guān)于2’-FL的相關(guān)專利技術(shù)，期望加快推動我國的2’-FL生物合成早日實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；?。

1 我國2’-FL相關(guān)專利技術(shù)概況

由圖1可知，根據(jù)萬方中外專利數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計[12]，以“巖藻糖基乳糖”為題目共檢索到申請我國專利38 條，其中多數(shù)集中在近2 年。從申請人或申請單位看，早期主要是國外公司或國外技術(shù)人員，如丹麥Glycom A/S公司、德國Jennewein Biotechnologie GmbH公司、德國巴斯夫（BASF）歐洲公司等。

圖1 申請我國巖藻糖基乳糖專利情況（統(tǒng)計至2021年4月）[12-15]Fig. 1 Number of fucosyllactose-related patents applied for in China during 2012-2021 (updated to April 2021)[12-15]

南開大學王磊等[13]申請專利CN106190937A（2016-12-07），是我國較早、為數(shù)不多利用基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建產(chǎn)2’-FL菌株的單位之一。近2 年申請專利的單位或個人多數(shù)是我國的科研單位或科技人員，如江南大學劉龍等[14]。 從專利技術(shù)內(nèi)容看，我國申請的專利更多集中在生產(chǎn)2’-FL的重組菌株構(gòu)建方面，占比約80%以上，其次是巖藻糖基乳糖生物功能研究及配方產(chǎn)品開發(fā)方面；而國外申請的專利內(nèi)容涉及到巖藻糖基乳糖的化學合成法[15-17]或分離純化技術(shù)，如結(jié)晶法[18-19]、噴霧干燥法[20-21]等工程問題，也涉及到益生元產(chǎn)品開發(fā)等問題[22]。在 圖1統(tǒng)計的關(guān)于巖藻糖基乳糖的專利中，93%以上是關(guān)于 2’-FL，而關(guān)于3-FL的專利不足10%。

2 生物發(fā)酵法生產(chǎn)2’-FL

微生物（以大腸桿菌為例）全細胞合成生產(chǎn) 2’-FL，主要有2 條途徑，一條是從頭合成途徑（De novopathway），一條是補救途徑（Salvage pathway）（圖2）。 從頭合成途徑是指細胞利用胞外葡萄糖或甘油或蔗糖等材料作為碳源和能源，從胞內(nèi)糖酵解途徑中間產(chǎn)物果糖-6-磷酸開始分支進入5’-鳥苷二磷酸（5’-guanosinediphosphate，GDP）-L-巖藻糖途徑，其間在甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶（mannose 6-phosphate isomerase，manA）、磷酸甘露糖變位酶（phosphomannomutase，manB）、甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶（mannose-1-phosphate guanylyl transferase，manC）、GDP-D-甘露糖-6-脫氫酶（GDPD-mannose 6-dehydrogenase，gmd）和GDP-L-巖藻糖合成酶（GDP-L-fucose synthase，wcaG）的順序催化作用下，合成GDP-L-巖藻糖；之后以GDP-L-巖藻糖為供體，以底物乳糖為受體，在異源巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,2-fucosyltransferase，futC）催化下合成2’-FL，并輸出到胞外[23-25]。補救途徑是哺乳動物細胞或共生微生物細胞內(nèi)合成GDP-L-巖藻糖的途徑，只能以胞內(nèi)或胞外L-巖藻糖為底物，在L-巖藻糖激酶/L-巖藻糖焦磷酸化酶（L-fucokinase/L-fucose 1-phosphate guanylyltransferase，fkp） 雙酶作用下轉(zhuǎn)化成GDP-L-巖藻糖，并由futC進一步催化合成2’-FL[23-25]。2 條途徑所用合成底物和代謝途徑均有較大差異，從頭合成途徑是由葡萄糖或甘油或蔗糖等廉價材料合成2’-FL，工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)可行性高，但是由于合成路徑長、代謝支路多，代謝效率較低。補救途徑合成路徑短，但是以自然界稀少的L-巖藻糖為合成底物，工業(yè)化生產(chǎn)成本較高。針對上述問題，專利技術(shù)圍繞圖2所示的合成代謝途徑，采取敲除特定基因和/或過表達特定基因等方法，實現(xiàn)優(yōu)化代謝途徑的目的。重組菌合成代謝專利技術(shù)主要集中在以下方面。

圖2 2’-FL重組菌合成代謝途徑[23-25]Fig. 2 Metabolic pathway for 2’-FL biosynthesis by recombinant strain[23-25]

2.1 提高宿主細胞內(nèi)GDP-L-巖藻糖和乳糖的積累量

GDP-L-巖藻糖和乳糖是生產(chǎn)2’-FL的供體和受體。GDP-L-巖藻糖是某些微生物（如大腸桿菌）合成細胞莢膜異多糖酸的中間產(chǎn)物。野生型菌株合成GDP-L-巖藻糖的量非常少，作為合成2’-FL的供體無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，被認為是生產(chǎn)2’-FL合成途徑中一個瓶頸。外加L-巖藻糖（如補救途徑）雖有效果，但是成本問題限制了工業(yè)化生產(chǎn)。因此，專利技術(shù)都集中在從頭合成途徑中相關(guān)合成酶的過表達方面，強化陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，敲除或弱化分解GDP-L-巖藻糖的相關(guān)酶基因。乳糖作為合成2’-FL的受體材料，主要通過外加的方式供給，相關(guān)專利技術(shù)主要集中在提高重組菌株細胞膜的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白酶（lactose permease，lacY）活性方面，以及阻斷或降低乳糖胞內(nèi)分解和轉(zhuǎn)化問題。提高胞內(nèi)GDP-L-巖藻糖和乳糖含量的策略可謂“開源節(jié)流”。張濤等[26]以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主，通過不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒組合過表達2’-FL從頭合成途徑中的相關(guān)酶（manB、manC、gmd、wcaG、lacY、futC），并利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除lacZ和5’-尿苷-二磷酸-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶wcaJ的基因，阻止乳糖和GDP-L-巖藻糖的轉(zhuǎn)化分解；采用補料分批發(fā)酵，在3 L發(fā)酵罐內(nèi)2’-FL的產(chǎn)量達52 g/L。帥玉英等[27]同樣以大腸桿菌BL21（DE3）為生產(chǎn)宿主，除了過表達2’-FL合成途徑中相關(guān)酶（manB、manC、gmd、wcaG、futC）的基因外，還過表達蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（scrB和scrY），敲除lacZ基因，并利用大腸桿菌同源整合系統(tǒng)，將構(gòu)建的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白基因lacY高效表達閱讀框整合到重組菌株中，突出強化了蔗糖和乳糖轉(zhuǎn)運蛋白酶基因的表達；在3L發(fā)酵罐中流加蔗糖發(fā)酵，發(fā)酵液2’-FL含量達100 g/L。倪志堅等[28]以大腸桿菌為宿主，除過表達GDP-L-巖藻糖合成途徑中所必需的酶manA、manB、manC、gmd、wcaG和外源futC外，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和傳統(tǒng)λ-Red同源重組系統(tǒng)，敲除或突變大腸桿菌的甘露糖水解酶、lacZ或半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶（β-galactoside-transacetylase，lacA）、wcaJ、mtlD和lon的編碼序列，過表達大腸桿菌的陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子rcsA和rcsB基因；在相同條件下，該專利技術(shù)逐一比較敲除上述每個蛋白酶（lacZ、lacA、wcaJ、lon、mtlD）基因?qū)铣蒅DP-L-巖藻糖和2’-FL的影響，結(jié)果顯示，敲除上述每個蛋白酶基因?qū)铣蒅DP-L-巖藻糖和2’-FL都有較明顯的效果；經(jīng)過5 L罐發(fā)酵（以甘油為底物），GDP-L-巖藻糖最高產(chǎn)量約400 mg/L，2’-FL為50 g/L。

2.2 futC表達

futC是催化GDP-L-巖藻糖與乳糖形成α-1,2-糖苷鍵的關(guān)鍵酶，其活性影響2’-FL的產(chǎn)量。在原核生物中，最早在病原菌幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）中克隆出futC，是大腸桿菌等工程菌中合成2’-FL的主要外源蛋白酶（使用該蛋白酶的專利占本文統(tǒng)計專利數(shù)的85%以上）。隨著對futC構(gòu)效關(guān)系的認識，部分專利技術(shù)采用人工合成或經(jīng)過修飾的futC序列。孫俊松等[29]在大腸桿菌重組菌中表達人工合成的futC序列，并證明該合成序列為功能完全的α-1,2-futC。帥玉英等[27]基于幽門螺旋桿菌futC序列和大腸桿菌密碼子的偏好性重新合成futC序列。徐鎮(zhèn)浩等[30]基于谷氨酸棒狀桿菌生化特性，對源于幽門螺旋桿菌的futC序列進行優(yōu)化，獲得較好的效果。劉龍等[31]將幽門螺旋桿菌的futC N端與4 種蛋白融合標簽柔性連接，提高了futC的可溶性和生物活性。吳志剛等[32]以大腸桿菌JM109（DE3）作為原始菌株，通過表達含有柔性多肽串聯(lián)連接的2 個futC基因，增強了GDP-巖藻糖與乳糖的合成。除了基于幽門螺旋桿菌的futC外，專利技術(shù)中也出現(xiàn)異源表達其他微生物的futC。申哲壽等[33]比較2 種微生物的futC，在相同條件下，表達源自舞蹈擬土地桿菌（Pseudopedobater saltans）futC基因的重組菌，其2’-FL產(chǎn)量是表達幽門螺旋桿菌的futC重組菌產(chǎn)量的2 倍。孟祥鋒等[34]比較6 種不同微生物來源的futC對2’-FL產(chǎn)量的影響，在相同條件下，幽門螺旋桿菌、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、均勻擬桿菌（Bacteroides unifomis）、蛋狀擬桿菌（Bacteroideseggerthii）、Neocallimastix californiae6 種微生物中，源于蠟樣芽孢桿菌的重組菌2’-FL產(chǎn)量最高。

2.3 重組菌的生物安全性

作為重組菌的宿主微生物，大腸桿菌無疑是優(yōu)選的，其具有遺傳背景清楚、基因操作方便、生長繁殖快、易于放大等特性，作為生產(chǎn)2’-FL宿主菌有明顯的優(yōu)勢。美國FDA、歐盟食品安全條例和我國相關(guān)征求意見稿中均明確大腸桿菌為生產(chǎn)菌，國外廠商也有成功的案例，例如，丹麥Glycom A/S公司（生產(chǎn)2’-FL、乳糖-N-新四糖、雙巖藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖）、美國GlycoSyn LLC公司（生產(chǎn)2’-FL）、比利時Inbiose公司（生產(chǎn)2’-FL）均使用大腸桿菌K-12作為生產(chǎn)菌種，而德國Jennewein Biotechnologie GmbH公司（生產(chǎn) 2’-FL）使用大腸桿菌BL21作為生產(chǎn)菌種[6]。大腸桿菌作為工業(yè)化生產(chǎn)菌株的優(yōu)勢毋庸置疑，在本文統(tǒng)計的專利文獻中也占有較高比例（73%）。但是，大腸桿菌細胞外膜的脂多糖層有產(chǎn)內(nèi)毒素活性，用于生產(chǎn)食品藥品的原材料，其潛在風險也不可忽視。在專利技術(shù)中有2 種解決方法：1）提高大腸桿菌發(fā)酵液的分離純化技術(shù)，將發(fā)酵菌體及其代謝副產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)、氨基酸、脂多糖、核酸和其他生物分子）分離出去，提高產(chǎn)品純度[18-21]；2）選育更安全、高效的重組菌。谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、乳酸乳球菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等微生物是食品工業(yè)中生產(chǎn)氨基酸、核酸、酶制劑、營養(yǎng)化學品等原材料或酒飲料的生產(chǎn)菌，其生物安全性優(yōu)于大腸桿菌。劉龍等[35-36]為了解決枯草芽孢桿菌對乳糖利用率低的問題，構(gòu)建由P43啟動子和lacY基因序列構(gòu)成的替換框，通過同源重組技術(shù)替換枯草芽孢桿菌168的α-淀粉酶基因amyE位點，提高了枯草芽孢桿菌重組菌對乳糖的利用率。徐鎮(zhèn)浩[30]、 申哲壽[33]等利用谷氨酸棒狀桿菌作為生產(chǎn)宿主菌，在過表達內(nèi)源manB和manC基因基礎(chǔ)上，異源表達源自大腸桿菌K-12MG1655的gmd、wcaG、lacY基因和源自舞蹈擬土地桿菌的futC基因。通過補料分批培養(yǎng)持續(xù)供給葡萄糖或乳糖，菌株生長活躍，提高了2’-FL產(chǎn)量。孟祥鋒[34]、 劉巍峰[37]等利用釀酒酵母W303-1a為宿主菌，通過同源重組或定點誘變等技術(shù)將來源于蠟樣芽孢桿菌的futC基因、來源于乳酸克魯維斯酵母菌的乳糖轉(zhuǎn)運蛋白酶lac12基因、來源于大腸桿菌K12的gmd和wcaG基因整合入釀酒酵母中。重組菌株不但具有乳糖利用功能，而且具有一個或多個拷貝的重組基因或DNA序列，從而高效表達了異源蛋白酶。

2.4 重組菌的遺傳穩(wěn)定性

為了過表達2’-FL合成途徑中相關(guān)酶，在重組菌株構(gòu)建過程中往往采用多拷貝數(shù)的表達質(zhì)粒。這些質(zhì)粒在細胞生長繁殖過程中丟失與否是重組菌遺傳穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一，也是影響工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量和效益的重要因素。在專利技術(shù)中，劉龍等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在大腸桿菌MG1655鞭毛驅(qū)動蛋白基因fliR位點上整合外源futC基因，在L-墨角藻糖激酶基因fuck位點上整合外源fkp基因，獲得了高效合成2’-FL的無質(zhì)粒工程菌株。張濤等[26]經(jīng)過搖瓶發(fā)酵實驗，從36 株重組菌 （BL21(DE3)，ΔlacZ、ΔwcaJ）BZW 1～36中挑選出含有不同質(zhì)粒的5 株菌株（BZW 1～5），且經(jīng)過6 代培養(yǎng)，2’-FL產(chǎn)量均保持穩(wěn)定，表明實驗菌株遺傳穩(wěn)定性良好。

續(xù)表1

2’-FL生物合成重組菌株構(gòu)建部分相關(guān)專利如表1所示。

表1 2’-FL生物合成重組菌株構(gòu)建部分相關(guān)專利Table1 Patents on the construction of recombinant strain for 2’-FL biosynthesis

3 結(jié) 語

從上述專利內(nèi)容和數(shù)量看，我國專利技術(shù)更多集中在高效、安全重組菌株的構(gòu)建方面。采用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和/或傳統(tǒng)的λ-Red同源重組系統(tǒng)，優(yōu)化2’-FL合成代謝途徑。利用不同拷貝數(shù)的表達質(zhì)?；驈妴幼舆^表達相關(guān)酶的基因，提高了部分關(guān)鍵酶的表達量。在生物安全性方面，多項專利選擇了安全性更高的谷氨酸棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等微生物作為宿主菌，內(nèi)源基因與外源基因得到互補。

構(gòu)建安全、高效的重組菌株是2’-FL工業(yè)化生產(chǎn)的第1步，雖然微生物合成2’-FL的路徑已經(jīng)明確，但是不同菌株在不同環(huán)境下代謝效率差異很大，優(yōu)化代謝途徑和代謝條件還有很大空間。其次，中試放大過程及發(fā)酵液分離純化技術(shù)與成本是產(chǎn)品走向市場成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在上述申報專利技術(shù)中，重組菌發(fā)酵實驗仍局限在實驗室搖瓶或小型實驗發(fā)酵罐內(nèi)（5 L以下），在中試條件下甚至生產(chǎn)條件下菌株的代謝特性和遺傳特性有待研究。雖然目前工業(yè)上已有較多的分離純化技術(shù)供選擇（如膜分離、離子交換、活性炭吸附、色譜分離、結(jié)晶和干燥等），但是發(fā)酵液的組成和流動特性均影響產(chǎn)品的分離純度和成本，產(chǎn)品純度、分離純化技術(shù)選擇和分離純化效率有待優(yōu)化。