牛初乳與牛常乳中游離氨基酸和不溶性蛋白質(zhì)氨基酸對比研究

宋婉瑩，李墨翰，張秀敏，楊 梅，岳喜慶,，鄭 艷,

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

母乳是嬰幼兒成長最天然、健康、完全的理想食物，營養(yǎng)豐富且均衡，比牛乳、羊乳等其他乳源更加利于消化吸收，適合于嬰幼兒胃腸道功能尚不成熟、所含消化酶不完全的特點(diǎn)[1]。世界衛(wèi)生組織提倡在嬰兒分娩后1 h即開始進(jìn)行并堅(jiān)持6 個月純母乳喂養(yǎng)，但據(jù)國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會的統(tǒng)計(jì)顯示，我國0～6 個月嬰兒的純母乳喂養(yǎng)率僅為27.8%[2]。因此，以母乳為“金標(biāo)準(zhǔn)”設(shè)計(jì)的嬰幼兒配方乳粉是替代母乳的最佳選擇。

牛乳作為使用最為廣泛的配方乳基料，物美價廉，營養(yǎng)豐富，同時含有人體所需的氨基酸、乳蛋白、乳脂肪、豐富的礦物質(zhì)和維生素等成分[3]。牛乳中天然存在有許多生物活性成分，包括具有抑菌效果的酪蛋白以及酪蛋白來源的生物活性肽，如可以緩解興奮、焦慮的阿片肽等，還包括各種生長因子、激素、核苷酸、溶菌酶、細(xì)胞因子等，是人類天然的保健食品[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)相關(guān)研究表明，牛乳有抗菌、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高記憶力等作用[5]。雖然牛乳所富含的蛋白質(zhì)不僅可為人類生理活動提供能量與必需氨基酸，還具有較高的營養(yǎng)價值和功能特性，但大量的研究結(jié)果顯示，由于牛乳和人乳蛋白及氨基酸成分上的差異性[6]，常會導(dǎo)致過敏性哮喘、鼻炎、皮膚濕疹、消化功能紊亂等疾病[7]，據(jù)報道，約3%的成年人經(jīng)歷過乳制品過敏[8]。因此，詳細(xì)表征不同泌乳期牛乳成分的差異，有助于以牛乳為基料的配方乳粉的精細(xì)化研發(fā)，并為乳制品的多樣化生產(chǎn)提供原料和技術(shù)基礎(chǔ)。

乳中的氨基酸不僅構(gòu)成蛋白質(zhì)，而且在人體中也起著重要作用。研究表明，乳中的氨基酸能夠調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動[9]、提高免疫力[10]，同時參與合成各種生物活性物質(zhì)[11]。氨基酸按照營養(yǎng)學(xué)分類可分為必需氨基酸和非必需氨基酸。必需氨基酸指人體（或其他脊椎動物）不能合成或合成速度遠(yuǎn)不能適應(yīng)機(jī)體需要，需由食物蛋白質(zhì)供給的氨基酸[12]。對成人而言，必需氨基酸有8 種，即賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸[13]。另外，組氨酸為嬰幼兒所必需，而精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、?；撬釣樵绠a(chǎn)兒所必需。上述必需氨基酸必須從食物中直接獲得，否則不能維持機(jī)體的氮平衡并影響健康[14]。非必需氨基酸指人體可以通過自身合成或從其他氨基酸轉(zhuǎn)化得到，不一定從食物中攝取[15]。這類氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸等。有些非必需氨基酸，如胱氨酸和酪氨酸如果供給充裕還可以減少必需氨基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量[15]。氨基酸按照其存在部位的不同又可以分為游離氨基酸和不溶性蛋白質(zhì)氨基酸。游離氨基酸指以游離態(tài)存在的單個氨基酸分子，可被直接吸收利用；而不溶性蛋白質(zhì)氨基酸則需要通過酸解，將待檢產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)、多肽等氨基酸鏈水解成單個氨基酸，因此，水解氨基酸反映的是產(chǎn)品中所有氨基酸單位（單個或多個）的組成[16]。由于游離氨基酸與蛋白質(zhì)中氨基酸的結(jié)構(gòu)相同，因此氨基酸又被認(rèn)為是連接代謝物和蛋白質(zhì)之間的重要橋梁[17]。

本研究以不同泌乳期的牛乳樣品為原料，對牛初乳和牛常乳中游離氨基酸和不溶性蛋白質(zhì)氨基酸的種類及含量進(jìn)行表征，并且對比分析其中的差異，進(jìn)一步完善對于不同泌乳期牛乳氨基酸組成及含量的差異研究，為配方乳粉的研制及嬰幼兒營養(yǎng)調(diào)配提供更為精確的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品（牛初乳和牛常乳），采樣地點(diǎn)為遼寧省沈陽市某奶牛養(yǎng)殖場，隨機(jī)選取1～6 月齡的健康荷斯坦奶牛60 頭，由該奶牛場的專業(yè)養(yǎng)殖人員于每天12—14時人工采樣，均為混合乳樣，每份混合乳樣包含同等比例的3 頭奶牛乳樣，分別在產(chǎn)后0～7 d內(nèi)每天采集4 份、共32 份牛初乳，15 d～6 個月每5 d采集1 份，共33 份牛常乳，分別記為牛初乳組和牛常乳組。采集后的樣品保存于消毒完畢的50 mL離心管中，四周用干冰覆蓋，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，貯藏于超低溫冰箱中（-80 ℃）備用。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司；濃鹽酸 深圳市恒利化工有限公司；磺基水楊酸上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900高效氨基酸分析儀 日本日立高新技術(shù)公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 深圳瑞德儀器設(shè)備有限公司；H1650臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游離氨基酸的提取

取待測的牛初乳（或牛常乳）樣品2 mL于離心管中，按照體積比1∶1加入2 mL 5%磺基水楊酸溶液沉淀蛋白質(zhì)，用振蕩器振蕩混勻，1 500 r/min條件下離心20 min，取上清液于新的離心管中，4 ℃冰箱內(nèi)靜置1 h，用0.22 μm水系濾膜過濾，然后裝入上樣瓶，備用。

1.3.2 水解氨基酸的提取

分別準(zhǔn)確吸取牛初乳（或牛常乳）樣品2 mL，置于35 mL玻璃水解管內(nèi)，并加入2 mL濃鹽酸，使用真空泵對水解管進(jìn)行抽真空處理，用酒精噴燈對其封口，在110 ℃條件下水解23 h。待水解管冷卻后開管，將水解后得到的溶液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，將樣品蒸干，除去濃鹽酸后，使用0.02 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容至100 mL，最后再將通過一系列處理得到的溶液通過0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.3.3 樣品中氨基酸的測定

取樣品溶液與0.1%磺基水楊酸溶液以體積比4∶1混勻，置于4 ℃冰箱靜置60 min后，10 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后經(jīng)氨基酸自動分析儀測定。色譜條件：分析柱（4.6 mm×60 mm），柱溫57 ℃，反應(yīng)柱溫度135 ℃，泵1流速0.45 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量20 μL[18-19]。紫外檢測器：脯氨酸在440 nm波長處測定吸光度，其他氨基酸在570 nm波長處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所測得的結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選擇t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，依據(jù)P值判斷差異性，P＜0.05時表示結(jié)果差異顯著，P＞0.05時表示結(jié)果無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛初乳與牛常乳中游離必需氨基酸的對比分析

游離氨基酸能夠被人體直接吸收，其含量和成分能夠部分反映食品的營養(yǎng)價值[20]。由表1可知，牛常乳和牛初乳中均含有9 種人體必需氨基酸。牛初乳中游離賴氨酸含量顯著高于牛常乳（P＜0.05），牛初乳中其他8 種必需氨基酸含量均極顯著高于牛常乳（P＜0.01），特別是游離纈氨酸在牛初乳中含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他8 種氨基酸。纈氨酸具有較強(qiáng)的免疫活性，能夠促進(jìn)組織修復(fù)，調(diào)節(jié)機(jī)體血糖水平，提供機(jī)體所需能量[21]。牛初乳中異亮氨酸含量約是牛常乳的114 倍，異亮氨酸和亮氨酸及纈氨酸混合使用能起到修復(fù)肌肉組織、調(diào)控血糖、提高體內(nèi)生產(chǎn)激素產(chǎn)量的作用，是嬰兒正常發(fā)育所必需的氨基酸[22]。牛初乳中苯丙氨酸含量極顯著高于牛常乳（P＜0.01），約為牛常乳的10 倍，苯丙氨酸是典型的生酮生糖氨基酸，是人體必需的芳香族氨基酸，通過羥化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成酪氨酸進(jìn)行分解利用，因此苯丙氨酸可以在賴氨酸攝入不足時有效補(bǔ)償，同時避免苯丙氨酸含量過高造成中毒[23]。 賴氨酸在機(jī)體內(nèi)的代謝產(chǎn)物有黑色素、多巴胺、去甲腎上腺素等。苯丙氨酸還是體內(nèi)合成腎上腺素、甲狀腺激素等的前體物質(zhì)[24-25]。牛初乳中甲硫氨酸含量顯著高于牛常乳，甲硫氨酸在體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化成中間產(chǎn)物同型半胱氨酸形成胱氨酸，促進(jìn)機(jī)體正常生長。甲硫氨酸可提供甲基，參與蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等的合成以及影響基因的表達(dá)過程[26]。色氨酸是維持幼齡動物生長及成人體內(nèi)氮平衡絕對必需的氨基酸，并且關(guān)系到哺乳動物泌乳、繁殖等功能。色氨酸可轉(zhuǎn)變生成煙酸，一旦缺乏就會造成生長停滯、體質(zhì)量減輕、食欲減退，嚴(yán)重時會導(dǎo)致無法繼續(xù)維持生命。色氨酸是合成褪黑素及5-羥色胺的前體，這2 種物質(zhì)可以有效調(diào)節(jié)睡眠節(jié)律，研究顯示，添加色氨酸哺育的嬰兒在睡眠模式上更加接近母乳喂養(yǎng)的新生兒[27]。亮氨酸在營養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)方面，可扮演營養(yǎng)信號的角色，激活翻譯過程的起始因子，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[28]。在母乳中異亮氨酸、纈氨酸與亮氨酸含量比為1.0∶1.2∶1.8，不合適的含量比將會致使蛋白質(zhì)合成受到影響，出現(xiàn)生長障礙。牛初乳中游離組氨酸的含量是牛常乳中的8.58 倍，差異極顯著。組氨酸與機(jī)體組織修復(fù)密切相關(guān)，在體內(nèi)代謝產(chǎn)生組胺，調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張收縮及過敏反應(yīng)等[29]。

表1 牛初乳和牛常乳中游離必需氨基酸的定量分析結(jié)果Table1 Quantitative analysis of free essential amino acids in bovine colostrum and mature milk

2.2 牛初乳與牛常乳中游離非必需氨基酸的對比分析

由表2可知，牛常乳中測得7 種非必需氨基酸，牛初乳測得8 種非必需氨基酸，牛初乳中的游離非必需氨基酸種類更加齊全。其中，牛初乳和牛常乳中游離絲氨酸和 酪氨酸含量差異不顯著，其他6 種氨基酸的含量在牛初乳和牛常乳中均存在極顯著差異（P＜0.01）。在牛初乳中，游離非必需氨基酸中含量最高的是丙氨酸，可以抑制葡萄糖激酶，調(diào)節(jié)糖異生和糖酵解途徑，改善機(jī)體能量代謝。在牛常乳中，游離谷氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他游離非必需氨基酸，有研究表明，谷氨酸除了可以調(diào)節(jié)食欲，還會在體內(nèi)與血氨結(jié)合，對于氨的毒害有解除作用，因此能夠保護(hù)肝臟，預(yù)防和治療肝昏迷。近年來，有證據(jù)顯示，谷氨酸在抑郁障礙這種慢性精神疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。牛常乳中谷氨酰胺的含量極顯著高于牛初乳，通過攝食獲取外源谷氨酰胺是保證人體對谷氨酰胺正常需求的有效途徑。谷氨酰胺作為一種中性、無毒的物質(zhì)，容易通過細(xì)胞膜，為細(xì)胞增殖過程供能，同時不會抑制葡萄糖的利用。谷氨酰胺增加了對腸細(xì)胞的屏障作用，有效阻止腸毒素等侵入，保護(hù)腸道黏膜。腎臟通過增加攝入谷氨酰胺、排泄尿氨，緩解酸中毒，維持酸堿平衡。谷氨酰胺參與了γ-氨基丁酸和谷氨酸的代謝，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮、抑制狀態(tài)有關(guān)。對于嬰幼兒而言，母乳中豐富的游離谷氨酰胺足以提供生長所需要的量[30]。

表2 牛初乳和牛常乳中游離非必需氨基酸的定量分析結(jié)果Table2 Quantitative analysis of free non-essential amino acids in bovine colostrum and mature milk

牛初乳中甘氨酸含量約是牛常乳的3 倍，含量差異顯著。甘氨酸是結(jié)構(gòu)最為簡單的蛋白質(zhì)氨基酸，作為一種神經(jīng)遞質(zhì)在體內(nèi)與膽汁酸結(jié)合，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與信號傳遞過程，同時參與合成谷胱甘肽、嘌呤堿等含氮物質(zhì)。研究表明，早產(chǎn)兒對甘氨酸的需求量較高，母乳無法供給充足甘氨酸供生長發(fā)育所需[31]。牛初乳相較于牛常乳所獨(dú)有的游離氨基酸是脯氨酸，脯氨酸參與傷口愈合、細(xì)胞內(nèi)自由基清除等許多反應(yīng)，對DNA的甲基化和轉(zhuǎn)錄過程會有影響。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳期婦女乳腺中的精氨酸可以合成脯氨酸，通過母乳喂養(yǎng)滿足新生嬰幼兒對脯氨酸的需求[32]。

2.3 牛初乳與牛常乳中不溶性蛋白質(zhì)必需氨基酸的對比分析

由表3可知，牛初乳和牛常乳中均含有7 種水解必需氨基酸，其中，賴氨酸和蘇氨酸的含量存在極顯著差異（P＜0.01），其余5 種氨基酸含量差異不顯著。牛常乳中賴氨酸含量約為牛初乳的2 倍。賴氨酸是谷物類食品的主要限制性氨基酸，牛乳中總賴氨酸在總氨基酸（包括游離氨基酸和不溶性蛋白質(zhì)氨基酸）含量中占比較高[10]。賴氨酸與人體中樞神經(jīng)、免疫、發(fā)育密切相關(guān)[11]，缺乏會引起機(jī)體造血功能障礙、食欲減退、代謝紊亂，出現(xiàn)體質(zhì)量下降、貧血、兒童發(fā)育不良、智力低下等癥狀[33]。研究表明，補(bǔ)充一定劑量的賴氨酸可提高鈣的吸收及其在體內(nèi)的積累，加速骨骼生長、增強(qiáng)免疫力、提高智力、促進(jìn)發(fā)育[34]，同時賴氨酸可直接進(jìn)入腦組織，影響呼吸鏈，為神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和進(jìn)行正常生理活動提供必要的能量來源[35]。牛初乳中蘇氨酸含量接近牛常乳的1.5 倍，有研究顯示，新生兒對氨基酸液提供的蘇氨酸吸收量多于來自母乳的蘇氨酸[36]。蘇氨酸在胃腸道內(nèi)起到促進(jìn)黏蛋白形成的作用，缺乏時會引起腹瀉。另外，在牛初乳與牛常乳不溶性蛋白質(zhì)必需氨基酸中，組氨酸含量均較高且兩組之間無顯著差異。組氨酸具有促進(jìn)鐵吸收[37]、修復(fù)腦損傷等生理功能[38]，對嬰兒而言是必需氨基酸。

表3 牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白質(zhì)必需氨基酸的定量分析結(jié)果Table3 Quantitative analysis of essential amino acids of insoluble proteins in bovine colostrum and mature milk

2.4 牛初乳與牛常乳中不溶性蛋白質(zhì)非必需氨基酸的 對比分析

由表4可知，牛初乳和牛常乳中均測得10 種不溶性蛋白質(zhì)非必需氨基酸，其中甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸含量差異不顯著，牛初乳中其他4 種氨基酸，即精氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、丙氨酸的含量顯著高于牛常乳（P＜0.05）。精氨酸是尿素循環(huán)中的關(guān)鍵一環(huán)，對氨解毒起重要作用，且在體內(nèi)一氧化氮合成酶的作用下可生成內(nèi)源性一氧化氮，是血管擴(kuò)張過程中的信號分子[39]。此外，精氨酸可以促進(jìn)氧化磷酸化過程，由于嬰兒體內(nèi)精氨酸的更新速率很高，精氨酸攝入不足易引發(fā)小腸結(jié)腸炎、持續(xù)肺動脈高壓等新生兒疾病[40]。半胱氨酸是結(jié)構(gòu)中含有巰基的含硫氨基酸，硫作為細(xì)胞所需的重要元素，有增加膜穩(wěn)定性的作用。半胱氨酸在體內(nèi)不穩(wěn)定，極易轉(zhuǎn)化生成不溶性的胱氨酸[41]。半胱氨酸是合成牛磺酸、谷胱甘肽等生物活性物質(zhì)的前體分子，其中，由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽谷胱甘肽是存在于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)[42]。牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白質(zhì)氨基酸的差異將為不同日齡嬰幼兒配方乳粉的研發(fā)提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

表4 牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白質(zhì)非必需氨基酸的定量分析結(jié)果Table4 Quantitative analysis of non-essential amino acids of insoluble proteins in bovine colostrum and mature milk

3 結(jié) 論

牛初乳和牛常乳中9 種游離必需氨基酸中，含量最高的均為纈氨酸。牛初乳中賴氨酸含量顯著低于牛常乳，其他8 種氨基酸在牛初乳中的含量均顯著高于牛常乳。牛初乳中有2 種非必需氨基酸未檢出，分別是天冬氨酸和半胱氨酸，牛常乳中除了天冬氨酸、半胱氨酸外，脯氨酸也未檢出，因此牛初乳中游離狀態(tài)的非必需氨基酸種類更齊全。在檢出的游離非必需氨基酸中，含量最高的是谷氨酸。牛初乳中精氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量顯著高于牛常乳，而牛常乳谷氨酸、谷氨酰胺含量顯著高于牛初乳。牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白質(zhì)氨基酸中均含有7 種必需氨基酸，亮氨酸未檢出，其中，纈氨酸含量最高。牛初乳中賴氨酸含量顯著低于牛常乳，蘇氨酸含量顯著高于牛常乳，其余6 種氨基酸含量差異不顯著。牛初乳和牛常乳中均含有10 種不溶性蛋白質(zhì)非必需氨基酸，天冬酰胺未檢出，其中，谷氨酸含量最高。牛初乳中所含精氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、丙氨酸含量顯著高于牛常乳，其他6 種含量差異均不顯著。

本研究對牛初乳和牛常乳中的游離必需氨基酸、游離非必需氨基酸、不溶性蛋白質(zhì)必需氨基酸、不溶性蛋白質(zhì)非必需氨基酸進(jìn)行定性和定量測定分析，比較不同泌乳期牛乳中氨基酸的含量差異。研究結(jié)果可以進(jìn)一步幫助理解泌乳期對牛乳中氨基酸的影響，完善對于牛初乳和牛常乳中氨基酸成分及含量的差異研究，為配方乳粉的研制及嬰幼兒營養(yǎng)調(diào)配提供更為精確的理論依據(jù)。