淫羊藿苷通過抑制NLRP3炎性小體和Caspase－1通路減輕骨關(guān)節(jié)炎

史紀(jì)元　姬樂　武世勛　劉時(shí)璋　易智　傅薔

摘要 目的：考察淫羊藿苷在治療骨關(guān)節(jié)炎中的潛在價(jià)值，以及淫羊藿苷對核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體和半胱天冬酶-1（Caspase-1）的調(diào)控作用。方法：本研究通過脂多糖（LPS）誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞建立體外骨關(guān)節(jié)炎模型，通過碘乙酸單鈉處理SD大鼠建立體內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎模型。通過乳酸脫氫酶漏出實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞毒性，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。通過qRT-PCR檢測NLRP3 mRNA的表達(dá)，通過Western Blotting檢測NLRP3、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、Collagen Ⅱ、Caspase-1、ASC和GSDMD的蛋白表達(dá)。用免疫熒光法和免疫組化法檢測軟骨細(xì)胞和大鼠軟骨中的NLRP3表達(dá);番紅O/固綠染色評價(jià)大鼠軟骨病變。結(jié)果：與LPS組比較，LPS+ICA組LDH的漏出率、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD的表達(dá)水平明顯降低，而Collagen Ⅱ明顯升高（P<0.05）。與LPS+ICA+pcDNA3.1-NC組比較，LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3組的乳酸脫氫酶漏出率及NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。與對照組比較，OA組大鼠軟骨組織中NLRP3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加，而OA+ICA組的NLRP3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯降低（P<0.05）。與OA組比較，OA+ICA組的NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、Caspase-1、ASC和GSDMD的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而Collagen的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。結(jié)論：淫羊藿苷通過抑制NLRP3和Caspase-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷和細(xì)胞焦亡，從而減輕大鼠骨關(guān)節(jié)炎。

關(guān)鍵詞 骨關(guān)節(jié)炎;淫羊藿苷;細(xì)胞焦亡;NLRP3炎性小體;半胱天冬酶-1;軟骨;脂多糖;乳酸脫氫酶

Abstract Objective：To investigate the potential value of icariin in the treatment of osteoarthritis and the regulatory effect of Icariin on nucleoside binding oligomerization domain like receptor protein 3（NLRP3） and caspase-1.Methods：In this study，lipopolysaccharide（LPS） was used to induce rat knee chondrocytes to establish an in vitro osteoarthritis model，and SD rats were treated with monosodium iodoacetate to establish an in vivo osteoarthritis model.The cytotoxicity was detected by the lactate dehydrogenase leakage test，and the cell viability was detected by the MTT test.The expression of NLRP3 mRNA was detected by qRT-PCR，and the protein expression of NLRP3，IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，collagen Ⅱ，Caspase-1，ASC and GSDMD was detected by Western Blotting.Immunofluorescence and immunohistochemical methods were used to detect the expression of NLRP3 in chondrocytes and rat cartilage.Safranin O/Fast Green staining evaluated cartilage lesions in rats.Results：Compared with LPS group，the LDH leakage rate and the expression levels of IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，NLRP3，Caspase-1，ASC，and GSDMD in LPS+ICA group were significantly reduced，while collagenⅡ was increased（P<0.05）.Compared with the LPS+ICA+pcDNA3.1-NC group，the lactate dehydrogenase leakage rate and the expression level of NLRP3 inflammasome-related protein in the LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3 group were significantly increased（P<0.05）.Compared with the control group，the number of NLRP3 positive cells in the cartilage tissue of the OA group increased significantly，while the number of NLRP3 positive cells in the OA+ICA group was significantly reduced（P<0.05）.Compared with the OA group，the protein expression levels of NRLP3，IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，Caspase-1，ASC and GSDMD in the OA+ICA group were significantly reduced，while the protein expression levels of collagen Ⅱ were significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Icariin inhibits lipopolysaccharide-induced chondrocyte damage and pyrolysis by inhibiting NLRP3 and Caspase-1 signaling，thereby reducing osteoarthritis in rats.

Keywords Osteoarthritis; Icariin; Pyroptosis; NLRP3 inflammatory corpuscle; Caspase-1; Cartilage; Lipopolysaccharide; Lactate dehydrogenase

中圖分類號：R284;R684文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.009

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性退行性關(guān)節(jié)骨疾病，主要特征是關(guān)節(jié)僵硬和軟骨退化。隨著人口老齡化的加劇，OA的發(fā)病率逐年升高。目前，OA的藥物治療效果并不理想，因此需要開發(fā)更安全、耐受性更好的OA治療藥物[1]。軟骨病變在OA的發(fā)展過程中扮演重要角色，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、軟骨基質(zhì)損失和自噬。動(dòng)物模型的研究表明，生長因子（如TGF-β和Wnt3a）以及信號分子（如β-catenin、Smad3和HIF-2α）均參與OA的發(fā)展[2-4]。此外，炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的丟失被認(rèn)為是OA軟骨損傷的重要驅(qū)動(dòng)因素[5]。了解這些因素的變化規(guī)律可能為OA提供有效的治療方法。

細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）是抑制依賴于半胱天冬酶-1（Caspase-1）且伴有炎癥介質(zhì)釋放的程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞焦亡可以導(dǎo)致IL-1β和IL-18的產(chǎn)生以及巨噬細(xì)胞的裂解[6-7]。與細(xì)胞凋亡和簡單細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞焦亡過程是促炎性的，并由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體和Caspase-1信號通路介導(dǎo)。最近的研究表明，NLRP炎性小體NLRP1和NLRP3參與介導(dǎo)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡[8]。抑制這2種NLRP炎性小體導(dǎo)致凋亡相關(guān)細(xì)胞因子顯著減少，表明NLRP1和NLRP3炎性小體可能在OA的發(fā)病中起重要作用。另一項(xiàng)研究表明，兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中NLRP3的水平升高，表明炎性小體參與了OA的發(fā)病過程[9]。但是，NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在OA中的作用和潛在機(jī)制仍然未知。

淫羊藿是一種傳統(tǒng)中草藥，已被用于OA的治療中。據(jù)報(bào)道，淫羊藿可以顯著緩解OA并降低兔OA模型中尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）、uPA受體（uPAR）和尿激酶型纖溶酶原激活物抑制劑的表達(dá)水平[10]。淫羊藿提取物淫羊藿苷（Icariin，ICA）具有抗骨質(zhì)疏松和抗炎作用[11]。研究表明，淫羊藿苷通過抑制核因子κB信號通路的自噬而抑制OA炎癥和軟骨細(xì)胞凋亡[12-13]。此外，淫羊藿苷通過抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨肉瘤細(xì)胞中MAPK信號通路相關(guān)分子發(fā)揮軟骨保護(hù)作用[14]。但是，淫羊藿苷緩解OA的分子機(jī)制及其與NLRP3炎性小體的關(guān)系尚未完全了解。本研究旨在考察淫羊藿苷在治療OA方面的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠來自陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（陜）2016-006]，7周齡，體質(zhì)量為221～254 g。將大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下：室溫22～26 ℃、濕度45%～55%、光照12 h光暗循環(huán)，不限制飲食。本研究經(jīng)過陜西省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核（倫理審批號：2019-0836），符合動(dòng)物倫理原則。

1.1.2 試劑 淫羊藿苷（北京索萊寶科技有限公司，貨號：I8760），胰蛋白酶（Invitrogen公司，美國，貨號：90305），Ⅱ型膠原酶（Invitrogen公司，美國，貨號：17101015），Dulbecco′s改良的Eagle培養(yǎng)基中（DMEM）（Invitrogen公司，美國，貨號：A4192101），Lipofectamine 2000試劑盒（Invitrogen公司，美國，貨號：11668019），Trizol試劑（Invitrogen公司，美國，貨號：15596018），無血清Opti-MEM（Gibco公司，美國，貨號：31985062），脂多糖（Sigma公司，美國，貨號：Sigma-L2630），MTT試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：ST316），乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0016），雙辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0010S），Caspase-1活性檢測試劑盒（ImmunoChemistry公司，美國，貨號：19D40），多聚甲醛溶液（Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-281692），番紅O/固綠染色試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJ-0276），Triton購自（Sigma Aldrich公司，德國，貨號：303135），NLRP3（Abcam公司，英國，貨號：ab263899），IL-1β（Abcam公司，英國，貨號：ab234437），IL-18（Abcam公司，英國，貨號：ab207323），MMP-1（Abcam公司，英國，貨號：ab134184），MMP-13（Abcam公司，英國，貨號：ab51072），collagend（Abcam公司，英國，貨號：ab188570），Caspase-1（Abcam公司，英國，貨號：ab207802），ASC（Abcam公司，英國，貨號：ab151700），GSDMD（Abcam公司，英國，貨號：ab219800），GAPDH（Abcam公司，英國，貨號：ab8245），HRP標(biāo)記的二抗IgG（Abcam公司，英國，貨號：ab205719），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（武漢艾美捷科技有限公司，貨號：4800-30-07），RIPA緩沖液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號：C1053-100），牛血清白蛋白（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，貨號：GNM-15270），高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：E412-01），RT Master Mix（Takara公司，日本，貨號：RR036A），SYBR Select Master Mix（賽默飛世爾科技有限公司，美國，貨號：4472913）。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 處死各組大鼠后分離膝關(guān)節(jié)并切取關(guān)節(jié)表面軟骨。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，將軟骨用2.0 g/L的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min。然后加入含有0.2%后型膠原酶的培養(yǎng)皿中在37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h取上清通過篩網(wǎng)過濾軟骨細(xì)胞，將得到的單細(xì)胞懸液以3 000×g離心10 min。然后將細(xì)胞置于完整的Dulbecco′s改良的Eagle培養(yǎng)基中（DMEM）在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。每隔2 d更換培養(yǎng)液，達(dá)到80%融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將全長NLRP3序列構(gòu)建到pcDNA3.1中，并將重組的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-NLRP3。將空載質(zhì)粒用作陰性對照（pcDNA3.1-NC）。將細(xì)胞以3×105/孔的密度接種在6孔板中。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，使用Lipofectamine 2000試劑盒用不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將4 μg質(zhì)粒和10 μL Lipofectamine 2 000分別用200 μL無血清Opti-MEM稀釋。將2種稀釋液在室溫下靜置5 min并均勻混合?；旌衔锓胖?0 min后添加到培養(yǎng)孔中，然后在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換完全培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 軟骨細(xì)胞分組及脂多糖（LPS）誘導(dǎo) 將軟骨細(xì)胞分為對照組、LPS組和LPS+淫羊藿苷組（LPS+ICA組）。對照組細(xì)胞不進(jìn)行LPS處理，LPS組和LPS+ICA組細(xì)胞應(yīng)用LPS處理。將LPS加入PBS緩沖液中配成10 μg/mL的LPS母液。然后將LPS加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，濃度為20 ng/mL。將第1代大鼠軟骨細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液，然后按照以1×105/mL接種于含有10%胎牛血清培養(yǎng)基（2 mL）的6孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基并用PBS洗滌，加入LPS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。LPS+ICA組細(xì)胞在LPS處理的基礎(chǔ)上加用淫羊藿苷處理（100 μmol/L），用于后續(xù)研究。

1.2.4 細(xì)胞活力 將大鼠軟骨細(xì)胞接種在96孔板中（1×104個(gè)細(xì)胞/孔），并用不同濃度的淫羊藿苷（0、1、10、20、50、100和200 μmol/L，純度>98%）處理細(xì)胞24 h。然后，將20 μL MTT（5 mg/mL）添加到每個(gè)孔中，并在37 ℃下孵育4 h。除去上清液后，向每個(gè)孔中加入150 μL二甲基亞砜。然后搖動(dòng)10 min，使用酶標(biāo)儀檢測570 nm處光密度（OD）值。

1.2.5 乳酸脫氫酶漏出率檢測 通過細(xì)胞上清中的乳酸脫氫酶（LDH）漏出率來評價(jià)細(xì)胞毒性，LDH采用比色法通過乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒測定。

1.2.6 免疫熒光 在蓋玻片上培養(yǎng)軟骨細(xì)胞48 h，用4%多聚甲醛溶液固定，然后用含5%驢血清和0.1% Triton的PBS封閉溶液處理。隨后，將樣品與多克隆抗大鼠NLRP3抗體（1∶500）在4 ℃孵育過夜，然后用PBS洗滌3次并與抗大鼠IgG二抗（1∶200）和DAPI在室溫下孵育1 h。通過共聚焦顯微鏡觀察圖像。

1.2.7 動(dòng)物分組及OA大鼠模型 雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為3組，對照組、OA組（OA組）和淫羊藿苷組（OA+ICA組），每組10只。通過注射碘乙酸鈉（MIA）誘導(dǎo)大鼠OA模型。將MIA溶于0.9%氯化鈉溶液中，終濃度為60 mg/mL。分別將50 μL MIA溶液注入OA組和淫羊藿苷組大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。對照組大鼠注射50 μL 0.9%氯化鈉溶液。建模2周后，淫羊藿苷組大鼠每天按照50 mg/kg的劑量（0.5 mL）灌胃淫羊藿苷溶液，其他組灌胃等體積生理鹽水。共治療2周。然后處死大鼠，分離軟骨組織。

1.2.8 番紅O/固綠染色 將大鼠軟骨下骨的軟骨切塊（1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm）并用中性甲醛溶液固定3 d，然后在30%的甲酸溶液中脫鈣14 d，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋在并切成5 μm厚的切片。按照生產(chǎn)商說明，將切片用Weigert鐵蘇木素染色，然后用水漂洗并置于0.2%固綠溶液中1 min，在1%乙酸乙酯溶液中放置30 s，0.1%的番紅O溶液孵育15 min。然后將樣品脫水，透明，中性樹膠封片。正常的軟骨呈紅色，背景呈綠色。

1.2.9 免疫組織化學(xué) 將大鼠軟骨下骨的石蠟包埋組織切片在二甲苯中脫蠟并用梯度乙醇脫水。在檸檬酸鈉緩沖液中回收抗原后，將切片與抗大鼠NLRP3抗體（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。用PBS洗滌3次后，將切片與生物素化的IgG（1∶500）在37 ℃下孵育30 min，然后用PBS洗滌3次。將切片用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行著色3 min。從每個(gè)切片中隨機(jī)選擇5個(gè)典型視野進(jìn)行觀察并在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞。

1.2.10 Western Blotting分析 使用含蛋白酶抑制劑的冰RIPA緩沖液裂解細(xì)胞。使用雙辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒（BCA試劑盒）對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。用10% SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)（20 μg），并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，將膜在5%牛血清白蛋白中室溫封閉2 h。然后將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。一抗如下：NLRP3（1∶1 000）、IL-1β（1∶3 000）、IL-18（1∶3 000）、MMP-1（1∶1 000）、MMP-13（1∶1 000）、collagen如（1∶3 000）、Caspase-1（1∶2 000）、ASC（1∶2 000）、GSDMD（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）。用TBST洗滌3次后，將膜與HRP標(biāo)記的相應(yīng)山羊抗兔二抗IgG（1∶3 000）室溫下孵育1 h。TBST洗滌3次后，用高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒觀察免疫反應(yīng)蛋白。使用ImageJ軟件量化每個(gè)條帶的密度。

1.2.11 qRT-PCR 使用Trizol試劑從軟骨細(xì)胞和軟骨組織中提取總RNA，并用RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Select Master Mix在ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)程序如下：95 ℃變性30 s，60退火1 min，95 ℃延伸5 s。引物序列如下：NLRP3正向（5′-GTTGTGGGGAGAGGCAAACT-3′）和反向（5′-CACTGGACCTCGGACTGGAGTTA-3′），GAPDH正向（5′-CAACGACGGAGTGTTCAAACG-3′）和反向（5′-CCGACTCCAGACAGTACAT-3′）。使用GAPDH作為內(nèi)部對照，通過2-△△Ct法計(jì)算基因相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次重復(fù)。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。通過單因素方差分析及Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂多糖對軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)和膠原蛋白的影響 與對照組細(xì)胞比較，LSP組大鼠軟骨細(xì)胞中NRLP3的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。脂多糖孵育24 h后，與對照組比較，LPS組大鼠軟骨細(xì)胞中NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1和MMP-13蛋白表達(dá)水平顯著升高，而CollagenⅡ的表達(dá)明顯降低（P<0.05）。見圖1。

2.2 淫羊藿苷抑制脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷 結(jié)果顯示，淫羊藿苷以濃度依賴性的方式降低了大鼠軟骨細(xì)胞活力（P<0.05）。乳酸脫氫酶（LDH）的漏出為細(xì)胞焦亡的主要指標(biāo)。與對照組比較，LPS組的LDH漏出率明顯升高;與LPS組比較，LPS+ICA組LDH的漏出率明顯降低（P<0.05）。與LPS組比較，LPS+ICA組的IL-1β、IL-18、MMP-1和MMP-13的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而CollagenⅡ明顯升高（P<0.05）。見圖2。

2.3 淫羊藿苷抑制脂多糖誘導(dǎo)的NLRP3和Caspase-1信號通路 與對照組比較，LPS組大鼠軟骨細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。與LPS組比較，LPS+ICA組的NLRP3的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。與對照組比較，LPS組中Caspase-1、ASC和GSDMD的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。與LPS組比較，LPS+ICA組的Caspase-1、ASC和GSDMD的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。見圖3。

2.4 淫羊藿苷通過抑制NLRP3信號抑制大鼠軟骨細(xì)胞焦亡 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-NLRP3的大鼠軟骨細(xì)胞中的NLPR3 mRNA表達(dá)水平顯著高于陰性對照組（pcDNA3.1-NC）（P<0.05）。與LPS+ICA+pcDNA3.1-NC組比較，LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3組的乳酸脫氫酶漏出率明顯升高（P<0.05），焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。見圖4。

2.5 淫羊藿苷通過抑制NLRP3減輕大鼠OA損傷番紅O/固綠染色結(jié)果表明，與對照組比較，OA組中大鼠軟骨破壞嚴(yán)重，番紅O明顯失染，OA+ICA組大鼠的軟骨破壞程度較小。免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組比較，OA組大鼠軟骨組織中NLRP3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加;與OA組比較，OA+ICA組大鼠軟骨組織中NLRP3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）。見圖5～6。

2.6 淫羊藿苷減輕OA大鼠中NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡并增加膠原蛋白的形成 結(jié)果表明，與OA組比較，OA+ICA組大鼠軟骨中NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、Caspase-1、ASC和GSDMD的蛋白表達(dá)水平明顯降低，而CollagenⅡ的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），與體外軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。見圖7。

3 討論

OA是一種進(jìn)行性和惡化性的關(guān)節(jié)疾病，目前臨床中所應(yīng)用的藥物如對乙酰氨基酚、非甾體抗炎藥等只能緩解疼痛，而無法治愈該病。炎癥和細(xì)胞凋亡與OA的發(fā)展有關(guān)[15-16]。淫羊藿提取物淫羊藿苷（Icariin，ICA）具有抗氧化、抗神經(jīng)炎和抗凋亡作用，在治療如腫瘤、阿爾茨海默病、腦缺血、抑郁、糖尿病和帕金森病等多種疾病中療效顯著[17]。對于OA，研究顯示，淫羊藿苷通過多種機(jī)制發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松和抗OA作用，包括抑制核因子κB信號通路及抑制MMP1、MMP3和MMP13的表達(dá)[18-21]。

NLRP3炎性小體已被證明通過刺激炎癥介質(zhì)和降解酶與各種關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[22]。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道了NLRP1和NLRP3炎小體在成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥和凋亡中發(fā)揮重要作用，這表明NLRP1和NLPR3炎性小體可能參與OA的進(jìn)展[8]。另外，NLRP3可能作為OA的潛在生物標(biāo)志物，據(jù)報(bào)道，姜黃素或雌二醇抑制NLRP3炎性小體可下調(diào)炎癥介質(zhì)并阻止OA進(jìn)展[23]。在本研究中，淫羊藿苷通過抑制NLRP3炎性小體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱了脂多糖誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞焦亡，而NLRP3的過表達(dá)降低了淫羊藿苷的保護(hù)作用。這些結(jié)果充分證實(shí)了NLRP3炎性小體在OA中的病理學(xué)作用，并且抑制NLRP3的表達(dá)可實(shí)現(xiàn)對OA的治療作用。

細(xì)胞焦亡是一種炎癥激活引起的Caspase-1依賴性程序性細(xì)胞死亡，可導(dǎo)致細(xì)胞溶解和胞質(zhì)內(nèi)含物釋放到細(xì)胞外環(huán)境[24]。Gasdermin D（GSDMD）是Gasdermin（GSDM）家族的成員，可被Caspase-1裂解并釋放N末端結(jié)構(gòu)域，其在質(zhì)膜上寡聚形成用于釋放如IL-1β和IL-18等底物的孔道[25]。Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在多種疾病的調(diào)節(jié)中起作用，例如多發(fā)性硬化、視網(wǎng)膜炎、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。此外，Caspase-1的缺乏可降低慢性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)病理改變[26]。與細(xì)胞凋亡和簡單細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞焦亡過程是促炎性的，并由NLRP3炎性小體介導(dǎo)。最近的研究表明，NLRP炎性小體NLRP1和NLRP3參與介導(dǎo)脂多糖誘導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞的凋亡[8]。抑制這2種NLRP炎性小體導(dǎo)致凋亡相關(guān)細(xì)胞因子顯著減少，表明NLRP1和NLRP3炎性小體可能在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[27]。另一項(xiàng)研究表明，兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中NLRP3的水平升高，表明炎性小體參與了OA的發(fā)病過程[9]。本研究進(jìn)一步證明，脂多糖誘導(dǎo)了軟骨細(xì)胞中NLRP3的表達(dá)，并促進(jìn)了Caspase-1的激活。因此，淫羊藿苷可能通過干擾脂多糖介導(dǎo)的NLRP3和Caspase-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來緩解OA。

總之，NLRP3炎性小體在OA的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。本研究表明，淫羊藿苷通過抑制NLRP3和Caspase-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制脂多糖誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷和細(xì)胞焦亡，從而減輕大鼠OA。表明淫羊藿苷在OA治療中具有較好的保護(hù)作用，有望成為新的OA治療藥物。

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（2020-07-09收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）