乳酸菌作為生物保護(hù)菌的抑菌機(jī)理及其在食品中應(yīng)用的研究進(jìn)展

呂懿超，李香澳，王凱博，孔保華，陳 倩

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

由食品中有害微生物造成的食品腐敗和安全問題一直受到廣泛關(guān)注。為了有效抑制有害微生物的生長，延長食品保質(zhì)期，提高食品安全性，食品工業(yè)中常通過物理保鮮、添加化學(xué)防腐劑或使用新型包裝方式等來抑制有害微生物[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，雖然化學(xué)防腐劑按照規(guī)定添加量單一添加時不會對人體造成損害，但防腐劑與增味劑和色素等多種添加劑混合添加時，會影響人體代謝，增加發(fā)生慢性病的風(fēng)險[2]。另外，隨著生活水平的提高，消費(fèi)者希望食品行業(yè)減少塑料等包裝材料的使用[3]。因此尋找天然、安全的保鮮方法成為近年來的研究熱點(diǎn)。近年來“生物保護(hù)菌”的提出滿足了消費(fèi)者的這一需求。

生物保護(hù)菌是指可以添加到食品中的具有延長食品貨架期和（或者）抑制有害微生物生長的活的微生物[4]。乳酸菌因可以產(chǎn)生具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸、細(xì)菌素和環(huán)肽等）[5]，并可以通過微生物群體感應(yīng)[6]和競爭作用[7]來抑制腐敗菌生長，成為生物保護(hù)菌篩選的重點(diǎn)。2016年，明串珠菌4010（Leuconostoc carnosum4010）被加拿大政府批準(zhǔn)作為生物保護(hù)菌添加到真空包裝肉制品中[8]。隨著乳酸菌作為生物保護(hù)菌的合法化，將乳酸菌作為生物保護(hù)菌應(yīng)用在食品領(lǐng)域中成為研究熱點(diǎn)。因此，近年來越來越多的研究人員將乳酸菌應(yīng)用于不同食品的生物保護(hù)中。本文將主要從乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)、微生物群體感應(yīng)以及競爭作用等方面介紹乳酸菌的抑菌原理，同時綜述了近些年乳酸菌作為生物保護(hù)菌在乳制品、肉制品、水產(chǎn)品和果蔬產(chǎn)品中的應(yīng)用，并對生物保護(hù)菌未來的研究方向進(jìn)行了展望。

1 乳酸菌的抑菌機(jī)理

對于乳酸菌抑菌機(jī)理的研究，早期一直關(guān)注其代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，如有機(jī)酸、細(xì)菌素等，這些物質(zhì)主要通過增加微生物膜通透性來抑制有害微生物的生長[9]。隨著研究的進(jìn)一步深入，近些年發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過微生物群體感應(yīng)作用有效抑制有害微生物的生長和生物膜的形成[6]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生抑菌蛋白或通過與有害微生物競爭[7]等方式來抑制有害微生物生長。

1.1 乳酸菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸類

乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，如乙酸、乳酸、碳原子數(shù)較多的脂肪酸和苯乳酸等可通過競爭作用（圖1機(jī)制一）、增加細(xì)菌外膜通透性（圖1機(jī)制二）、改變胞內(nèi)滲透壓（圖1機(jī)制三），以及抑制大分子的合成（圖1機(jī)制四）等方式來抑制有害微生物生長[10]。

圖1 乳酸菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸的抑菌機(jī)制[10]Fig. 1 Antimicrobial mechanism of organic acids produced by lactic acid bacteria[10]

1.1.1 競爭作用

1.1.1.1 能量競爭

乳酸菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸屬于弱酸，這些弱酸在細(xì)胞外液中以解離和未解離兩種狀態(tài)存在，而未解離的有機(jī)酸分子可以通過自由擴(kuò)散進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[11]。由于細(xì)胞內(nèi)處于偏堿性環(huán)境，使得有機(jī)酸解離平衡向產(chǎn)生氫離子和酸根離子方向移動，進(jìn)而產(chǎn)生兩種離子。但是這兩種離子不能通過自由擴(kuò)散的方式擴(kuò)散到細(xì)胞外[12]，所以為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細(xì)胞需要消耗ATP，通過主動運(yùn)輸?shù)姆绞綄潆x子轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。然而這是一個額外耗能過程，需要同細(xì)菌正常代謝所需能量產(chǎn)生競爭[13]。與此同時，有機(jī)酸可以消除ATP和電子傳遞的偶聯(lián)作用，從而降低細(xì)菌的產(chǎn)能效率。乳酸菌通過這種能量競爭的方式可抑制微生物的生長。

1.1.1.2 營養(yǎng)競爭

除了對能量競爭外，有機(jī)酸還可以與微生物中營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生作用，造成同微生物的營養(yǎng)競爭。Mani-López等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸在細(xì)胞外形成的乳酸鹽可改變沙門氏菌周圍水分活度，通過對水分子的競爭降低水分活度達(dá)到抑菌的目的。此外，一些有機(jī)酸可螯合金屬離子，與微生物生長所需的金屬離子形成螯合物，從而抑制微生物的生長[15]。

1.1.2 增加膜通透性

由于有機(jī)酸具有一定的脂溶性，可以作用于細(xì)胞膜，使得膜脂多糖和磷脂大量釋放造成細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低[16]。同時有機(jī)酸還可以通過膜表面的孔道蛋白，進(jìn)入細(xì)胞外膜和細(xì)胞內(nèi)膜之間的周質(zhì)，并導(dǎo)致脂多糖羧基和磷酸基團(tuán)質(zhì)子化，從而使得細(xì)胞外膜被破壞，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏[17]。參與競爭機(jī)制模式的氫離子在被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外的同時，鉀離子被泵入到細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)菌跨膜質(zhì)子動力勢能被破壞，胞內(nèi)滲透壓升高，從而破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，從而起到抑制微生物生長的作用[16]。

1.1.3 改變胞內(nèi)滲透壓

有機(jī)酸在胞內(nèi)解離，以氫離子和酸根陰離子形式存在于細(xì)胞內(nèi)。因此有機(jī)酸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，不僅會導(dǎo)致胞內(nèi)滲透壓升高，還會導(dǎo)致陰陽離子濃度升高。為了恢復(fù)胞內(nèi)滲透壓，保持內(nèi)外有機(jī)酸分子和陰陽離子濃度平衡，細(xì)胞需要釋放陰陽離子。但是釋放沒有選擇性，一些帶有負(fù)電的細(xì)菌生長所需前體物質(zhì)及輔助因子會同酸根離子一起被釋放到胞外，導(dǎo)致微生物生長受阻[18]。Roe等[19]研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌在乙酸作用下，胞內(nèi)乙酸根濃度升高，為了降低胞內(nèi)滲透壓，大腸埃希氏菌釋放谷氨酸根，最終導(dǎo)致大腸埃希氏菌生長速率減慢。

1.1.4 抑制大分子合成

有機(jī)酸可以通過影響微生物DNA的合成影響轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而影響合成相應(yīng)蛋白質(zhì)來抑制微生物生長。由于乳酸菌產(chǎn)生乳酸并在胞內(nèi)聚集，原本糖酵解的中間產(chǎn)物丙酮酸由于反饋抑制不能繼續(xù)轉(zhuǎn)化成乳酸，而使得丙酮酸在細(xì)胞中積累。為了減少丙酮酸在細(xì)胞中的積累，細(xì)胞通過增強(qiáng)磷酸戊糖途徑所需要酶的轉(zhuǎn)錄能力，提高酶的含量，減少丙酮酸的積累，同時降低了細(xì)胞產(chǎn)能，從而抑制細(xì)菌生長[20]。此外，有機(jī)酸可抑制胞內(nèi)酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝活動受阻。Roe等[21]研究指出乙酸可以抑制大腸埃希氏菌K-12（Escherichia coliK-12）中高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸時所需酶的活力，蛋氨酸的缺失影響了細(xì)菌的生長，同時高半胱氨酸由于不能及時轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞內(nèi)不斷積累，對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。

1.2 細(xì)菌素類

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)類抗菌物質(zhì)，具有抗細(xì)菌和真菌的作用[22]。并且大部分細(xì)菌素具有膜活性，可通過連接、嵌入作用在細(xì)胞膜上形成孔道，使得胞內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。細(xì)菌素可分類4 類：I類是羊毛硫抗生素，II類是熱穩(wěn)定、無修飾的小分子肽，III類為熱不穩(wěn)定的大分子肽，IV類為蛋白質(zhì)化合物[24]。

1.2.1 羊毛硫抗生素

I類細(xì)菌素由于結(jié)構(gòu)不同可以被分為兩類，分別為帶正電且具有疏水基團(tuán)，具有雙親性、螺旋狀肽鏈的A型和分子質(zhì)量較小、含有很多小型環(huán)狀結(jié)構(gòu)的B型[25]。乳酸菌產(chǎn)生的大多為A型羊毛硫抗生素。

A型羊毛硫抗生素對革蘭氏陽性菌具有較好的抑制作用，但對革蘭氏陰性菌、真菌和酵母基本沒有效果[26]。通過體外模擬A型羊毛硫抗生素對磷脂雙分子層的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜表面的孔道主要經(jīng)過4 步形成（圖2）：1）細(xì)菌素通過靜電相互作用與靶細(xì)菌的細(xì)胞膜相結(jié)合；2）細(xì)菌素氮端與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合；3）細(xì)菌素碳端跨過細(xì)菌細(xì)胞膜；4）在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成孔道，造成細(xì)胞膜通透性增加[27]。

以典型的A型羊毛硫抗生素乳酸鏈球菌素（Nisin）為例：Nisin作用于細(xì)菌細(xì)胞膜時，其碳末端首先通過靜電相互作用與帶負(fù)電的磷脂結(jié)合。革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜含有大量的負(fù)電脂質(zhì)（磷脂酰甘油和心磷脂），而革蘭氏陰性菌和酵母菌的細(xì)胞膜通常是兩性脂質(zhì)，因此Nisin對革蘭氏陽性菌更為有效。由于Nisin的氮端與表面蛋白共享一個同源的氮環(huán)，因此Nisin的氮端可以與細(xì)胞膜通過肽聚糖前體脂質(zhì)II相互作用特異性結(jié)合，使得Nisin分子平行貼在細(xì)胞膜表面。此外，肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，但是由于肽聚糖前體物質(zhì)與Nisin結(jié)合，導(dǎo)致脂質(zhì)II不能正常合成肽聚糖，從而干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的正常合成和細(xì)胞正常分裂。Nisin在細(xì)胞膜表面通過兩種方式形成孔道，分別稱為“桶板”模型（圖2A）和“楔形”模型（圖2B）?！巴鞍濉蹦Ｐ椭赋鯪isin疏水殘基與脂質(zhì)的酯?；嗷プ饔?，其極性殘基位于膜-水界面，由于大量聚集使得膜局部移位變薄，Nisin碳端以電勢依賴方式插入雙層膜疏水中心，最后由多個Nisin分子一起形成孔道。而另一種“楔形”模型中，質(zhì)子能耗散，膜內(nèi)外存在高跨膜電勢，導(dǎo)致磷脂膜表面彎曲，膜平面方向改變產(chǎn)生楔形孔隙[28]。

圖2 Nisin抑菌機(jī)制[27]Fig. 2 Antimicrobial mechanism of nisin[27]

1.2.2 肽類細(xì)菌素

II類細(xì)菌素是一類熱穩(wěn)定、未修飾的小肽，分為4 類：IIa類（類乳酸片球菌素細(xì)菌素）是一類熱穩(wěn)定性小肽，是通過兩個甘氨酸殘基加工形成的前體合成的，對單核細(xì)胞增生李斯特菌有強(qiáng)烈的抑菌活性，氮端具有共有序列YGNGVX-C；IIb類（雙肽、未修飾細(xì)菌素）是由兩個不同的肽組成一個具有抗菌活性的絡(luò)合物；IIc類（環(huán)狀細(xì)菌素）和IId類（未修飾、線性、非類乳酸片球菌素細(xì)菌素）[24,29-30]。

植物乳桿菌TN635（Lactobacillus plantarumsp.TN635）產(chǎn)生的IIa類細(xì)菌素BacTN635可以通過碳端α-螺旋結(jié)構(gòu)吸附于細(xì)胞膜上，同樣通過在細(xì)胞膜形成孔道，使得細(xì)胞膜通透性增加，從而引起能量消耗，內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡（類似于圖1機(jī)制二）[31]。而IIb類細(xì)菌素一般需要兩個肽的相互作用，而IIb類細(xì)菌素也被分為兩類：一類是Lactococcin G，當(dāng)這類細(xì)菌素的兩個肽分開時，就不具備抑菌活性，而兩個肽相互作用時可以消耗質(zhì)子勢能，減少ATP的生成，同時抑制氨基酸的攝??；而另一類的代表則是由嗜熱鏈球菌產(chǎn)生的由兩個肽組成的Thermophilin13，其中一個是抗菌肽ThmA，而另一個肽是ThmB。這種嗜熱鏈球菌素可以抑制李斯特菌，并且ThmB可作為增強(qiáng)因子將ThmA的活性提高約40 倍[32]。IIc和IId細(xì)菌素都可以在細(xì)菌細(xì)胞膜表面形成孔道，從而增加細(xì)胞膜的通透性，且都對革蘭氏陽性菌敏感。格氏乳桿菌和腸球菌分別可以產(chǎn)生IIc細(xì)菌素Gassericin A、Enterocin AS-48，并且可以作用于膜表面ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而形成孔道[33-34]。而唾液乳桿菌和乳酸乳球菌分別產(chǎn)生的IId細(xì)菌素Bactofencin A和LsbB則是通過作用于金屬多肽酶來達(dá)到抑菌的目的[35-36]。

1.2.3 熱敏感大分子蛋白

III類細(xì)菌素是一種熱敏感大分子蛋白，分子質(zhì)量一般大于30 kDa。這類細(xì)菌素也是通過在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成孔道，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，達(dá)到抑菌目的。但是與A型羊毛硫抗生素相比，III類細(xì)菌素有較好的廣譜性，可以有效抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長。但這類細(xì)菌素由于研究信息較少，還沒有具體作用受體的相關(guān)報告[37]。卷曲乳桿菌（Lb.crispatus）[38]、瑞士乳桿菌CNRZ450（Lb. helveticusCNRZ450）和瑞士乳桿菌481（Lb. helveticus481）[39-40]均可以產(chǎn)生III類細(xì)菌素Helveticin M和Helveticin J。Helveticin M可以破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁和革蘭氏陰性菌外膜的穩(wěn)定性，因而對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用。

1.2.4 大分子復(fù)合物

IV類細(xì)菌素是由碳水化合物、蛋白質(zhì)和類脂基團(tuán)組成的大分子復(fù)合物，可以有效抑制真菌和革蘭氏陰性菌的生長[9]。趙娜等[41]發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌AJT（Lb. helveticusAJT）可以產(chǎn)生對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和青霉有抑制作用抗菌物質(zhì)。排除酸性物質(zhì)和過氧化氫的影響后，抗菌物質(zhì)經(jīng)蛋白酶處理，發(fā)現(xiàn)抗菌活性下降但依然具有抗菌活性，從而表明抗菌物質(zhì)是由蛋白和非蛋白物質(zhì)復(fù)合而成，屬于IV類細(xì)菌素。同時，一些研究人員發(fā)現(xiàn)從埃及鹽腌發(fā)酵魚制品中分離出的糞腸球菌F4-9（Enterococcus faecalisF4-9）可以產(chǎn)生一種對蛋白酶敏感、pH值活性范圍較寬、耐熱性較好的細(xì)菌素，稱為Enterocin F4-9。該細(xì)菌素作用范圍較窄，對革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌JM109（E. coliJM109）有抑制作用[42]。此外，乳酸乳球菌L9（Lactococcus lactisL9）也可以產(chǎn)生此類細(xì)菌素Lactococcin GJ-9[43]。目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌素Pediocin SJ-1[44]、Leuconocin S和Lactocin 27也屬于IV類細(xì)菌素[36]。

1.3 群體感應(yīng)抑制劑

微生物群體感應(yīng)是指微生物可以產(chǎn)生一類被稱為自誘導(dǎo)物的信號分子，信號分子濃度與微生物密度成正比，當(dāng)信號分子積累到一定閾值時，開始通過激活并結(jié)合其受體蛋白來啟動相關(guān)基因的表達(dá)[45]。一些腐敗菌和致病菌的腐敗能力、遺傳能力、毒力以及生物膜的形成都與群體感應(yīng)有關(guān)[46]。并且研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致乳制品、肉制品、水產(chǎn)品和蔬菜等變質(zhì)的微生物的腐敗能力都受到群體感應(yīng)的調(diào)控[47-48]。因此抑制或阻斷細(xì)菌群體感應(yīng)可以有效抑制腐敗菌或致病菌的生長和毒性，從而有效延長食品保質(zhì)期，提高安全性。

群體感應(yīng)抑制劑就是一類通過調(diào)控微生物群體感應(yīng)系統(tǒng)來抑制腐敗菌的生長或者降低其對環(huán)境耐受性的物質(zhì)[48]。群體感應(yīng)抑制劑一般通過阻斷信號分子的合成（圖3A）、降解群體感應(yīng)信號分子（圖3B）和降低或抑制信號分子受體蛋白的活性（圖3C）來抑制群體感應(yīng)的進(jìn)行，從而對腐敗菌或致病菌產(chǎn)生抑制作用。

圖3 群體感應(yīng)抑菌機(jī)制[49]Fig. 3 Antimicrobial mechanism of quorum sensing[49]

1.3.1 細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑

銅綠假單胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosaPAO1）毒力因子的產(chǎn)生和生物膜的形成依賴于細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，植物乳桿菌產(chǎn)生的3-苯基乳酸可以作為細(xì)菌群體感應(yīng)抑制劑抑制該菌的生長[49]。此外，水楊酸是一種乳酸菌代謝產(chǎn)物，可以通過抑制高絲氨酸內(nèi)脂合成酶的活性，阻斷信號分子的合成，抑制腐敗菌的生長（圖3A）[48]。除了抑制信號分子的合成可以有效抑制細(xì)菌群體感應(yīng)，降解信號分子也可以抑制細(xì)菌群體感應(yīng)。林洋等[50]發(fā)現(xiàn)乳酸菌培養(yǎng)液的粗提取物可以通過降解細(xì)菌群體感應(yīng)信號分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)脂抑制嗜水氣單胞菌屬生物膜的形成（圖3B），由于粗提物經(jīng)蛋白酶處理失去降解作用，猜測粗提物是一種酶類。Park等[51]從泡菜中篩選出一株清酒乳桿菌NR28（Lb. sakeiNR28），這種乳酸菌雖然不能抑制大腸埃希氏菌的生長，但是可以通過抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌共同利用的呋喃酮酰硼酸二酯類信號分子（autoinducer-2，AI-2）轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對大腸埃希氏菌ATCC-43894（E. coliATCC-43894）菌株的致病性有一定的抑制作用（圖3C）。此外，乳酸乳球菌LY3-1（L. lactisLY3-1）可以產(chǎn)生由10 個氨基酸（序列為：ALSLVKIHGR）組成的群體感應(yīng)抑制劑，有效抑制哈維氏弧菌胞外多糖、生物膜和鞭毛的合成[48]。

1.3.2 真菌群體感應(yīng)抑制劑

白念珠菌是一種常見的人類條件致病菌，通常以無治病作用的酵母相和具有治病作用的菌絲相兩種形式存在。白念珠菌可以通過群體感應(yīng)在這兩種形式之間轉(zhuǎn)換，隨著數(shù)量的增長，白念珠菌會由菌絲相向酵母相轉(zhuǎn)移[52]。Okkers等[53]鑒定出一種戊糖乳桿菌中的長肽TV35b，這種肽可以通過群體感應(yīng)系統(tǒng)使白念珠菌轉(zhuǎn)化為酵母相，誘導(dǎo)假菌絲的形成，從而降低白念珠菌致病性并抑制其生長。

1.4 蛋白類物質(zhì)

乳酸菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類化合物一般分為兩類：一類是由核糖體合成的抑菌肽，上述提到的細(xì)菌素類就屬于此類；另一類是通過蛋白酶酶解產(chǎn)生的肽類，而非核糖體合成，以下提及的蛋白類物質(zhì)就是通過細(xì)菌蛋白酶酶解作用產(chǎn)生的。

Niku-Paavola等[54]在植物乳桿菌VTT E-78076（Lb.plantarumVTT E-78076）培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)了具有抑制革蘭氏陰性菌成團(tuán)泛生菌（Pantoea agglomeransVTT E-90396）和燕麥鐮刀菌VTT D-80147（Fusarium avenaceumVTT D-80147）生長的抗菌物質(zhì)，其中包括細(xì)菌蛋白酶酶解產(chǎn)物甘氨酸-L-亮氨酸環(huán)肽。除了對細(xì)菌的抑制作用，一些報道中也提到植物乳桿菌MiLAB 393可以通過酶解作用產(chǎn)生一種具有抑制真菌生長的環(huán)肽（L-Phe-L-Pro），同時清酒乳桿菌、冠狀乳桿菌和戊糖片球菌酶解產(chǎn)生的環(huán)肽（L-Phe-trans-4-OH-L-Pro）也具有抑制真菌生長的作用[55]。而Magnusson等[56]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，棒狀乳桿菌Si3（Lb. coryniformisSi3）通過酶解作用產(chǎn)生的抑菌環(huán)肽，可以通過其疏水性基團(tuán)迅速吸附到真菌細(xì)胞上，或者形成自聚體從而對霉菌和酵母菌有一定抑制作用。乳鐵蛋白是一種具有抗炎、抗氧化和抗菌等活性的蛋白質(zhì)，同時也是抗菌肽的重要來源[57]。而近期的研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以酶解乳鐵蛋白，可以產(chǎn)生一種抗真菌肽——乳鐵素[58]，這種物質(zhì)是帶有1 個二硫鍵、多個正離子、具有疏水性和18 個殘基環(huán)的多肽，可以通過破壞真菌細(xì)胞膜和膜上質(zhì)子梯度達(dá)到抑制真菌的作用[59]。而另一種乳鐵蛋白肽是由乳鐵蛋白氮端酶解掉的前11 個氨基酸殘基組成，在結(jié)構(gòu)上具有高度的陽離子性質(zhì)并包含疏水性的纈氨酸和色氨酸，因此也可通過破壞細(xì)胞膜來抑制白念珠菌和煙曲霉的生長[60]。此外，從阿爾及利亞傳統(tǒng)發(fā)酵食品中發(fā)現(xiàn)一種抗菌肽SSSEESII，這種物質(zhì)是通過乳球菌BR16菌株胞外絲氨酸金屬蛋白酶水解牛酪蛋白得到的。經(jīng)鑒定，該肽是酪蛋白αs2亞基的24～31片段，并且經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)該肽對兩種革蘭氏陽性細(xì)菌（李斯特菌ATCC 33090和黃體微球菌ATCC 4698）和兩株革蘭氏陰性菌（大腸埃希氏菌ATCC 25922和腸化沙門氏菌ATCC 13076）均具有抗菌活性[61]。

1.5 其他物質(zhì)

1.5.1 胞外多糖

胞外多糖是乳酸菌的一種代謝產(chǎn)物，可分為只含單一類型單糖單體的同聚多糖和含多種不同類型單糖單體的雜聚多糖[62]。近些年的研究中發(fā)現(xiàn)胞外多糖具有抑菌活性，Bajpai等[63]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌8513和BT8513產(chǎn)生的胞外多糖可以有效抑制金黃色葡萄球菌的生長。同時Trabelsi等[64]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌Ca6產(chǎn)生的胞外多糖可以有效抑制常見致病菌的生長。此外，植物乳桿菌YW32胞外多糖可以有效抑制腐敗菌和致病菌生物膜的形成，從而提高食品安全性[65]。

1.5.2 二氧化碳

乳酸菌異型發(fā)酵可產(chǎn)生二氧化碳，二氧化碳可以有效抑制革蘭氏陰性需氧菌和霉菌。二氧化碳的抑菌機(jī)制通過以下途徑：二氧化碳的產(chǎn)生可以形成厭氧環(huán)境，從而使得需氧型微生物受到抑制；并且二氧化碳可以溶于細(xì)胞液中，導(dǎo)致pH值下降從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一些酶活性下降，不僅影響了細(xì)胞代謝，還降低了細(xì)胞膜的傳遞能力[40]。

1.5.3 過氧化氫

過氧化氫是由乳酸菌中黃素氧化酶在有氧條件下產(chǎn)生的，并且因為大多數(shù)乳酸菌中沒有過氧化氫酶，使得過氧化氫在環(huán)境中積累，而過氧化氫可以通過氧化作用破壞羥自由基，從而抑制微生物生長[66]。

1.5.4 羅氏菌素

3-羥基丙醛又稱羅氏菌素，是羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）等在厭氧條件下分解甘油產(chǎn)生的一種廣譜抑菌物質(zhì)，可以有效抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌、霉菌和酵母[67]。羅氏菌素可以抑制核糖核酸還原酶活性，而這種酶是DNA合成所必需的，因此羅氏菌素可以通過干擾細(xì)菌DNA復(fù)制，來抑制細(xì)菌增殖[68]（機(jī)制類似于圖1機(jī)制四中抑制DNA復(fù)制過程）。除此之外，一些研究也發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝產(chǎn)物2-丙烯基酯具有抑制真菌的活性[69]。同時，乳酸菌在檸檬酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雙乙酰，在低pH值條件下也具有抑菌作用[70]。

1.6 競爭作用

雖然乳酸菌可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，但是生成量一般低于它們各自的抑菌濃度，所以除了產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，推測還存在其他的抑菌途徑。營養(yǎng)競爭是一種重要的競爭方式，通常是指乳酸菌同腐敗菌對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行競爭，其可通過較快的速度利用營養(yǎng)物質(zhì)，造成腐敗菌失去營養(yǎng)，進(jìn)而生長受到抑制。這種營養(yǎng)競爭既可以單獨(dú)作為一種作用機(jī)制，也可以與乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)協(xié)同作用[7]。Honoré等[71]監(jiān)測3 種副乳桿菌對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗與生長抑制的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)這些乳桿菌對葡萄糖和谷氨酰胺的消耗與腐敗霉菌的生長呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)而證明了乳桿菌可以競爭利用營養(yǎng)物質(zhì)從而導(dǎo)致腐敗菌缺少營養(yǎng)而生長受到抑制。

2 乳酸菌作為生物保護(hù)菌在食品中的應(yīng)用

2.1 乳及乳制品

乳制品因其具有較低pH值、中等水分活度和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)極易被微生物污染而腐敗變質(zhì)，其中霉菌和酵母菌是造成乳制品變質(zhì)的主要微生物[72]。霉菌屬中的青霉菌屬（Penicillium）、毛霉菌屬（Mucor）和枝孢菌屬（Cladosporium），酵母菌屬中的假絲酵母屬（Candida）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）和亞羅酵母屬（Yarrowia）都是乳制品中常見有害微生物[73]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)多種乳酸菌不僅可以作為生物保護(hù)菌抑制乳制品中真菌的生長，還能作為一種發(fā)酵劑賦予乳制品特殊風(fēng)味。

解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）被認(rèn)為是一種乳制品中很難抑制的致腐微生物，而Mieszkin等[74]發(fā)現(xiàn)哈爾濱乳桿菌K.V9.3.1Np（Lb. harbinensisK.V9.3.1Np）產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物尤其是有機(jī)酸如乙酸、乳酸、2-吡咯烷酮-5-羧酸、己酸和2-羥基苯甲酸，雖然不會改變酵母細(xì)胞膜通透性，但可通過誘導(dǎo)酵母細(xì)胞膜去極化的方式阻止解脂亞羅酵母的生長。而且哈爾濱乳桿菌K.V9.3.1Np在對酵母有良好的抑制作用的同時不會破壞發(fā)酵乳的感官特性，因此十分適合作為一種生物保護(hù)菌應(yīng)用于發(fā)酵乳的生產(chǎn)[75]。而Garnier等[76]從發(fā)酵乳制品中分離出的3 株乳酸菌——詹氏丙酸桿菌CIRM-BIA1774（Propionibacterium jenseniiCIRM-BIA1774）、鼠李糖乳桿菌CIRM-BIA1952（Lb. rhamnosusCIRM-BIA1952）和Mucor lanceolatusUBOCC-A-109193也被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性。通過對這3 株乳酸菌上清液的分離和鑒定，一共發(fā)現(xiàn)56 種具有抗真菌活性的物質(zhì)，其中含量最多的抗真菌物質(zhì)是詹氏丙酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸和乙酸，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸和乙酸以及M. lanceolatus發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸。除了通過產(chǎn)生有機(jī)酸抑制有害微生物的生長，最新的研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌還可以發(fā)酵酪蛋白αs2產(chǎn)生含有9 個氨基酸且具有抗菌活性的多肽。通過體外實驗證實了這種抗真菌肽可以有效抑制葡萄狀白霉（Mucor racemosus）和膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的生長[76]。此外，植物乳桿菌L244、哈爾濱乳桿菌L172、短乳桿菌L128和鼠李糖乳桿菌CIRM-BIA113被應(yīng)用于乳制品中抑制青霉菌和毛霉菌的生長，這些乳酸菌可以通過代謝產(chǎn)生乙酸、羥基苯乳酸、苯乳酸、3-苯基丙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸和5-氧吡啶-2-羧酸、二乙?；?、乙酰乙酸等達(dá)到抑制真菌的目的[77]。

2.2 肉及肉制品

肉及肉制品含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及大量的水分，因此在加工、貯藏和銷售環(huán)節(jié)很容易受到假單胞菌、大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等有害微生物的污染[78]。腸桿菌科、假單胞菌和熱殺索絲菌是真空包裝生牛肉切片在4 ℃貯藏過程中的主要腐敗菌，其中假單胞菌隨著貯藏時間的延長逐漸成為優(yōu)勢腐敗菌，而Zhang Yimin等[79]發(fā)現(xiàn)在真空包裝牛肉切片中接種清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌可以顯著抑制腸桿菌科、假單胞菌和熱殺索絲菌3 種腐敗菌的生長，并且能夠有效降低生牛肉切片微生物的多樣性及貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮類物質(zhì)的產(chǎn)生。Orihuel等[80]發(fā)現(xiàn)腸球菌CRL35（Enterococcus mundtiiCRL35）因產(chǎn)生一種蛋白類物質(zhì)，可以抑制大腸埃希氏菌O157:H7 NCTC12900（E. coliO157:H7 NCTC12900）氨基酸和核苷酸的代謝和運(yùn)輸，從而導(dǎo)致大腸埃希氏菌生長受阻，同時添加腸球菌也可以有效降低大腸埃希氏菌胞外基質(zhì)蛋白的黏附能力，使大腸埃希氏菌致病性降低。此外，Li Peijun等[81]將發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）接種到灌腸原料中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌不僅可以有效抑制其中肉桿菌屬、熱殺索絲菌屬和糞腸球菌屬等腐敗菌的生長，還可以將高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化為紅色的亞硝基亞鐵肌紅蛋白，使肉色得到改善。正是因為發(fā)酵乳桿菌在灌腸原料中的抑菌作用和護(hù)色作用，其被認(rèn)為是一種亞硝酸鹽的替代物在肉制品生產(chǎn)中具有潛在應(yīng)用價值。乳酸菌作為生物保護(hù)菌除了可以應(yīng)用于冷鮮肉和原料肉中還可以應(yīng)用于熟肉制品中，徐梅[82]將生物保護(hù)菌清酒乳桿菌B2（Lactobacillus sakeiB2）和植物乳桿菌R2（Lactobacillus plantarumR2）噴涂于切片低鹽香腸表面，結(jié)果表明在貯藏期間兩種生物保護(hù)菌能明顯改善香腸的菌群結(jié)構(gòu)，顯著抑制假單胞菌和熱殺索絲菌的生長，有效延長香腸的貨架期；同時，能有效緩解香腸貯藏過程中的脂肪氧化和蛋白氧化，提高了產(chǎn)品的感官品質(zhì)。此外，Danielski等[83]在研究熟火腿保鮮時，發(fā)現(xiàn)將乳酸菌麥芽香肉桿菌作為生物保護(hù)菌添加到產(chǎn)品中，可以有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長，提高食品安全性。

2.3 水產(chǎn)品

與肉制品類似，水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，易受到微生物污染發(fā)生腐敗變質(zhì)[84]。為了防止因水產(chǎn)品的腐敗而造成的浪費(fèi)和安全問題，乳酸菌作為生物保護(hù)菌近幾年被廣泛用于水產(chǎn)品中。其中乳酸乳球菌是一種良好的生物保護(hù)菌，Ibrahim等[85]將乳酸乳球菌添加到真空包裝生三文魚中后發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌不僅可以顯著延長產(chǎn)品貨架期，而且不會改變產(chǎn)品原有感官特性。除此之外，一株可以產(chǎn)生細(xì)菌素的戊糖乳桿菌也被應(yīng)用于生鮮三文魚片保鮮，其可以控制魚肉中嗜水氣單胞菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長，并且即使冷鏈遭到破壞也可以起到保護(hù)作用[86]。除了應(yīng)用于生鮮水產(chǎn)品中，乳酸菌作為生物保護(hù)菌還被應(yīng)用于加工后的水產(chǎn)品中。Saraoui等[87]將魚乳球菌CNCM I-4031（L. pisciumCNCM I-4031）和廣布肉桿菌V41（Carnobacterium divergensV41）應(yīng)用于氣調(diào)包裝去皮熟蝦的8 ℃貯藏過程中，研究發(fā)現(xiàn)兩株乳酸菌作為生物保護(hù)菌可以有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌、希瓦氏菌和腸桿菌的生長。并且魚乳球菌CNCM I-4031除了可以抑制微生物的生長，還可以有效消除不良風(fēng)味物質(zhì)，減緩去皮熟蝦貯藏過程中的品質(zhì)劣變。此外，Aymerich等[88]研究表明清酒乳桿菌CTC494（Lb. sakeiCTC494）、彎曲乳桿菌CTC1742（Lb. curvatusCTC1742）和麥芽香肉桿菌CTC1741（Carnobacterium maltaromaticumCTC1741）在熏魚貯藏過程中可作為生物保護(hù)菌延長其貨架期。其中，雖然彎曲乳桿菌和麥芽香肉桿菌可以利用肉中蛋白產(chǎn)生類細(xì)菌素物質(zhì)來增強(qiáng)抑菌能力，但這3 種乳酸菌中清酒乳桿菌保護(hù)作用最強(qiáng)，在貯藏期間可以有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長，而彎曲乳桿菌則只能減緩單核細(xì)胞增生李斯特菌的增長速度，相對以上兩種乳酸菌麥芽香肉桿菌作為生物保護(hù)菌應(yīng)用范圍較窄，雖然在體外實驗中表現(xiàn)出了抗菌活性，但僅在熏魚產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)其抑菌性能，而在其他實際產(chǎn)品中還沒有呈現(xiàn)出顯著抑菌效果。

2.4 水果及蔬菜

新鮮果蔬由于富含有益于人體健康的物質(zhì)（例如維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等）深受消費(fèi)者喜愛。但新鮮果蔬容易受到微生物污染，貨架期相對較短。而常用的熱加工處理和添加化學(xué)防腐的殺菌方法會破壞果蔬的感官和營養(yǎng)特性89]。相比之下，將生物保護(hù)菌——乳酸菌噴涂在果蔬表面因既不會破壞果蔬品質(zhì)和營養(yǎng)，又可以起到抑制有害微生物的作用，而深受研究者青睞。Ma Jiahong等[90]將棲樹汁乳桿菌JT03（Lb. sucicolaJT03）和乳酸片球菌JY03（Pediococcus acidilacticiJY03）應(yīng)用于防治柑橘霉菌病中，研究發(fā)現(xiàn)這兩種乳酸菌可以利用產(chǎn)生的蛋白類抑菌物質(zhì)來抑制指狀青霉的生長。除了霉菌之外，單核細(xì)胞增生李斯特菌也是果蔬中常見的有害細(xì)菌。Trias等[91]在對10 株腸系膜明串珠菌（Ln.mesenteroides）和1 株檸檬明串珠菌（Ln. citreum）對抗單核細(xì)胞增李斯特菌的實驗中發(fā)現(xiàn)，這11 株明串珠菌一般通過產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫和細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)來抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長。而這11 株明串珠菌中的2 株腸系膜明串珠菌CM135和CM160因其可以產(chǎn)生IIa類細(xì)菌素而對單核細(xì)胞增生李斯特菌有更好的抑制作用。同時在模擬金冠蘋果和生菜葉被單核細(xì)胞增生李斯特菌污染的實驗中，這兩株腸系明串珠菌同樣表現(xiàn)出對單核細(xì)胞增生李斯特菌明顯的抑制作用。

3 結(jié) 語

乳酸菌作為生物保護(hù)菌可以通過多種機(jī)制抑制食品中細(xì)菌和真菌生長，降低食源性微生物腐敗和致病風(fēng)險，可以有效延長食品保質(zhì)期。并且大量的研究已經(jīng)證實乳酸菌在食品中除了具有抑菌活性，還具有降解真菌毒素、降低不良風(fēng)味、改良食品顏色和賦予食品特殊風(fēng)味等作用。因此乳酸菌作為生物保護(hù)菌應(yīng)用于食品中日益受到研究者青睞。

然而由于乳酸菌種類較多，代謝方式多樣，代謝物種類豐富，目前研究多集中在小分子代謝物及其抑菌機(jī)制，而對蛋白類物質(zhì)研究較少，因此針對乳酸菌產(chǎn)生的蛋白類抑菌物質(zhì)及其抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步的探究。與此同時，乳酸菌已被證實對很多細(xì)菌和真菌有抑制作用，但是很少有研究關(guān)注乳酸菌作為生物保護(hù)菌添加到食品中后，乳酸菌自身對食品感官、風(fēng)味和營養(yǎng)等性質(zhì)的影響，而這一問題將會成為乳酸菌作為商用生物保護(hù)菌必須考慮的問題。此外，乳酸菌作為生物保護(hù)菌通常被應(yīng)用于發(fā)酵制品和原料食品保鮮中，擴(kuò)展生物保護(hù)菌的應(yīng)用范圍也是未來研究和應(yīng)用中的重點(diǎn)。