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    貯藏時(shí)間及繅絲工藝對桑蠶蛹蛋白質(zhì)和脂肪酸組成及蛹油體外抗氧化活性的影響

    2021-10-31 11:18:20吳寶祥梁舒韻朱立宏江虹銳劉小玲
    食品科學(xué) 2021年19期
    關(guān)鍵詞:繅絲蠶蛹貯藏期

    吳寶祥,梁舒韻,朱立宏,江虹銳,劉小玲,姜 毅

    (廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧 530004)

    蠶發(fā)育包括卵、幼蟲、蠶蛹及蠶蛾4 個(gè)階段,桑蠶蛹是鱗翅目蠶蛾科家蠶(Bombyx moriL.)的蛹,當(dāng)五齡幼蟲進(jìn)入熟蠶階段后停止進(jìn)食,熟蠶吐絲結(jié)繭后變態(tài)成蛹,該過程中,蠶貯藏了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以供蛹期發(fā)育[1-2]。我國年產(chǎn)桑繭約65萬 t,占世界總產(chǎn)繭量的70%以上,鮮蠶蛹年產(chǎn)量約50萬 t,是蠶業(yè)加工主要副產(chǎn)品之一[3],通常被當(dāng)成廢棄物或作為價(jià)格低廉的飼料[4]。2004年,蠶蛹被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)列入“作為普通食品管理的食品新資源名單”,其在食品工業(yè)上的開發(fā)應(yīng)用逐漸受到人們的重視[5-6]。蠶蛹油脂中的α-亞麻酸和蛋白質(zhì)含量豐富,氨基酸評(píng)分符合聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)蛋白模式值。近年來,我國鮮繭繅絲的蠶蛹主要以食品級(jí)蠶蛹形式出口日本、韓國,僅少數(shù)研究報(bào)道了將蠶蛹開發(fā)為蠶蛹罐頭[7]、蠶蛹蛋白飲料[8],以及將蠶蛹粉添加至面食中提升面食的營養(yǎng)度[9]或作為高能量餅干的蛋白質(zhì)來源[10]。

    蛋白質(zhì)、脂肪酸的生物活性對于開發(fā)蠶蛹功能性食品的價(jià)值有重要影響。Long Xingyao等[11]發(fā)現(xiàn)蠶蛹油對于鹽酸/乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍小鼠具有一定的保護(hù)作用。Hu Bin等[12]發(fā)現(xiàn)桑蠶蛹油的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率與蛹油中的總酚含量有關(guān)。Felix等[13]通過鐵離子還原能力法分析發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白濃縮物在pH 8.0時(shí)具有較高的抗氧化活性。目前,為提高蠶絲的品質(zhì)和蠶蛹的附加值,工業(yè)化的繅絲工藝已逐漸由傳統(tǒng)的干繭繅絲改進(jìn)為鮮繭繅絲。由于收繭具有季節(jié)性和批量大的特點(diǎn),工廠將鮮繭收集后,需經(jīng)歷選繭、煮繭、繅絲等加工程序,而關(guān)于收繭繅絲過程中繭的貯藏時(shí)間、繅絲煮繭工藝對蛹蟲的營養(yǎng)價(jià)值及活性還鮮見報(bào)道。

    本研究通過采集不同貯藏時(shí)間的桑蠶蛹和鮮繭繅絲后桑蠶蛹,分析貯藏時(shí)間和繅絲工藝對蛹的基本化學(xué)成分、脂肪酸組成、蛋白質(zhì)組成等的影響;并探討桑蠶蛹油的體外抗氧化活性。通過對比貯藏期桑蠶蛹與繅絲鮮蛹之間的營養(yǎng)組成的變化、蛹油體外抗氧化活性的差異,為桑蠶蛹功能活性產(chǎn)品工業(yè)的樣品采集提供理論指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    ‘兩廣二號(hào)’桑蠶繭 廣西宜州茂源繭絲有限公司;繅絲蠶蛹 廣西壯歌絲綢有限公司。

    DPPH、14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氟化硼-甲醇溶液上海麥克林生化科技有限公司;α-生育酚、磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L、pH 7.0)、Folin-Ciocalteu試劑 北京索萊寶公司;BCA試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司;2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、正己烷(色譜級(jí))、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司;正己烷、無水乙醇、甲醇、硫酸銨、無水碳酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、過硫酸鉀均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    7890B/5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)儀 美國安捷倫公司;CR21N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitach公司;Infinite M200 PRO光柵型多功能微孔板檢測儀 瑞士Tecan公司;UV1102II紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;PowerPac Basic電泳儀、Mini-Protean Tetra Cell電泳槽、CHEMIDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)美國伯樂公司;FD-1D-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司;SH220F石墨消解儀、K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器公司;SZF-06A粗脂肪測定儀上海新嘉電子有限公司;SX2-10-13箱式電阻爐 上海實(shí)研電爐有限公司;RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、N100氮吹儀上海精密儀器儀表有限公司;EMS-40數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋 常州愛華儀器制造有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 桑蠶蛹樣品的采集與形態(tài)觀察

    取結(jié)繭6 d的蠶繭置于通風(fēng)條件良好的貯藏室中,于(22±1)℃的條件下避光貯藏。每天定時(shí)隨機(jī)采集繭樣品20 只,記錄質(zhì)量后破繭取蛹,對蠶蛹樣品進(jìn)行形態(tài)觀察并記錄質(zhì)量及體長。樣品按照蠶蛹發(fā)育過程中歷經(jīng)復(fù)眼未著色、復(fù)眼著黑色、觸角著色以及體軟皮皺呈土色4 個(gè)主要形態(tài)變化[14]分為不同貯藏階段,并記錄為階段I、階段II、階段III和階段IV。為減少組內(nèi)樣品間差異,采集時(shí)剔除死蛹以及與同時(shí)期蛹發(fā)育有顯著差異的樣品。將采集到的鮮繭蠶蛹、繅絲后的蠶蛹樣品于-20 ℃冰箱保存,一周內(nèi)完成分析。

    1.3.2 基本化學(xué)成分分析

    蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)依據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[15]中凱氏定氮法進(jìn)行檢測;脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)依據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[16]中索氏抽提法進(jìn)行檢測;灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)依據(jù)GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》[17]中第一法食品中總灰分的測定進(jìn)行檢測。

    1.3.3 蠶蛹蛋白質(zhì)的提取

    將采集到的貯藏階段蠶蛹、繅絲蠶蛹經(jīng)蒸餾水沖洗3 遍后,參考Chen Jianqing等[18]的方法稍作修改提取蛋白。取適量蠶蛹按質(zhì)量體積比1∶1加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液于4 ℃下以10 000 r/min均質(zhì)至無明顯大顆粒。勻漿液經(jīng)8 層紗布過濾蛹?xì)?,濾液于4 ℃、12 000 r/min下離心30 min,棄去油脂層,收集上清液,重復(fù)離心兩次,將合并收集的上清液加入硫酸銨至硫酸銨飽和度為70%,4 ℃靜置2 h后,經(jīng)5 000 r/min離心20 min,收集蛋白質(zhì)沉淀。將硫酸銨沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)溶于磷酸鹽緩沖液,經(jīng)7 000 Da透析膜透析脫鹽,經(jīng)冷凍干燥后于4 ℃密封保存。樣品的蛋白質(zhì)量濃度使用BCA法[19]進(jìn)行測定。

    1.3.4 蠶蛹油的提取

    將1.3.1節(jié)中采集到的各貯藏階段蠶蛹及繅絲蠶蛹經(jīng)冷凍干燥后粉碎,經(jīng)100 目過篩后,于4 ℃下密封貯存?zhèn)溆?。蠶蛹油的提取參照魏兆軍等[20]的方法并稍作修改,將蠶蛹與正己烷以質(zhì)量體積比1∶8混合,經(jīng)38 ℃恒溫水浴攪拌2 h后,將混合液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min,收集上清;沉淀以相同條件再次提取上清液,合并兩次提取獲得的上清液。使用氮吹儀將上清液中有機(jī)溶劑去除,獲得蠶蛹油,于4 ℃密封貯存。

    1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

    將1.3.3節(jié)獲得的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠和12%分離膠檢測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布,電泳條件:樣品上樣量10 μL,樣品蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL,溴酚藍(lán)指示條帶位于濃縮膠時(shí)電壓為80 V,待指示條帶遷移至分離膠時(shí)電壓調(diào)整至120 V。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色30 min,使用脫色液脫色至背景清晰后使用凝膠成像儀拍照,使用Image Lab軟件分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。

    1.3.6 蠶蛹油脂肪酸含量的測定

    1.3.6.1 蠶蛹油的甲酯化

    蠶蛹油的甲酯化參照路萍等[21]的方法。將3 mL 0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液加入0.10 g的蠶蛹油,于60 ℃水浴30 min后冷卻。將冷卻后的溶液加入14%三氟化硼-甲醇溶液2 mL,60 ℃水浴5 min,流動(dòng)水冷卻后再加入正己烷2 mL、飽和NaCl溶液2 mL,取上層溶劑層,加入無水Na2SO4脫水后,使用0.22 μm有機(jī)相針頭過濾器過濾甲酯化蠶蛹油至樣品瓶中,待測。

    1.3.6.2 GC-MS分析條件

    GC條件:使用DB-Wax毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃、載氣He、載氣流速1 mL/min、進(jìn)樣量1 μL、分流比50∶1;升溫程序:170 ℃保持1 min,以25 ℃/min升至195 ℃,再以3 ℃/min升至230 ℃并保持3 min。

    MS條件:電離方式為電子電離,質(zhì)譜傳輸線溫度260 ℃、離子源溫度230 ℃、MS四極桿溫度150 ℃、質(zhì)量掃描范圍m/z40~500、溶劑延遲時(shí)間2 min,監(jiān)測模式為全掃描模式。

    1.3.6.3 GC-MS定性及定量分析

    采用GC-MS全掃描模式分析得到蠶蛹油脂肪酸總離子流圖;使用安捷倫化學(xué)工作站的增強(qiáng)型數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)NIST 14.L質(zhì)譜庫對總離子流色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析,根據(jù)質(zhì)譜庫中質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配度及脂肪酸甲酯質(zhì)譜斷裂規(guī)律進(jìn)行定性分析,飽和脂肪酸特征離子質(zhì)荷比m/z74,單不飽和脂肪酸m/z55,雙不飽和脂肪酸m/z67,多不飽和脂肪酸m/z79;通過安捷倫化學(xué)工作站的增強(qiáng)型數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算蠶蛹油中各脂肪酸組分的特征離子響應(yīng)值,通過面積歸一化法計(jì)算脂肪酸組分的相對含量。

    1.3.7 油脂中總酚含量的測定

    蠶蛹油中總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu比色法[22]。將2.5 mL正己烷加入0.120 g蠶蛹油中,漩渦振蕩溶解1 min,油相加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液后超聲萃取10 min,混合液經(jīng)10 000 r/min離心10 min。取2 mL甲醇溶液萃取相至10 mL容量瓶中,加入500 μL的Folin-Ciocalteul試劑,混勻1 min后加入2 mL 10% Na2CO3溶液,使用蒸餾水定容,于室溫下避光反應(yīng)1 h,于765 nm波長處測定吸光度。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Na2CO3溶液為對照組。配制100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,以0、100、200、300、400、500、600 μL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(蒸餾水定溶至10 mL)對應(yīng)的吸光度得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程y=0.009 2x+0.034 6(R2=0.994 5),蠶蛹油總酚含量以每千克蠶蛹油中所含沒食子酸質(zhì)量表示,單位為mg/kg。

    1.3.8 DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的測定

    使用無水乙醇將蠶蛹油分別配制成質(zhì)量濃度為10、20、30、50 mg/mL和70 mg/mL溶液。DPPH自由基清除率的測定參考Peixoto等[23]的方法。取2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH工作液與2 mL的樣品溶液混合,室溫下避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長處測定吸光度,DPPH自由基清除率按式(1)計(jì)算。以α-生育酚為陽性對照組,無水乙醇為空白對照組。

    式中:A1為蠶蛹油或α-生育酚組的吸光度;A0為空白對照組的吸光度。

    ABTS陽離子自由基清除率測定參考Zhao Ling等[24]的方法并稍作修改。取50 μL樣品溶液與150 μL的ABTS工作液混合,25 ℃避光反應(yīng)20 min,在734 nm波長處測定吸光度,ABTS陽離子自由基清除率按式(2)計(jì)算。以α-生育酚為陽性對照組,無水乙醇為空白對照組。

    式中:A1為樣品或α-生育酚與ABTS工作液的吸光度;A0為空白對照組的吸光度。

    抗氧化活性結(jié)果以清除50%自由基所需的樣品質(zhì)量濃度——半抑制質(zhì)量濃度(median inhibition concentration,IC50)表示。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件進(jìn)行處理,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3 次重復(fù)。采用Image Lab軟件處理電泳圖像,Origin 2019軟件繪圖。通過SPSS 25.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方程分析-最小顯著性差異(least significant difference,LSD)檢驗(yàn),分析數(shù)據(jù)差異顯著性(以P<0.05表示差異顯著)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 貯藏期桑蠶蛹的形態(tài)變化

    從結(jié)繭第6天起對蠶繭取樣,根據(jù)蠶蛹形態(tài)的變化,于結(jié)繭第8、11、12、13天收集蠶蛹,樣品采集時(shí)間分別記錄為貯藏期階段I、II、III和IV,各階段蠶蛹形態(tài)變化如圖1所示。

    圖1 貯藏期中各階段蠶蛹形態(tài)變化Fig. 1 Change in morphology of silkworm pupa during storage

    在貯藏階段I,蠶蛹表皮呈金黃色,復(fù)眼呈淡褐色(圖1A2)。階段II的蠶蛹復(fù)眼由淡褐色變?yōu)楹谏?,除?fù)眼外的其余形態(tài)特征與階段I無明顯差異(圖1B2)。階段III蠶蛹復(fù)眼著黑色,觸角呈現(xiàn)褐色,且肛門部位變?yōu)樯詈稚▓D1C2)。階段IV蠶蛹觸角的顏色變?yōu)樯詈稚?,表皮呈現(xiàn)出深土褐色(圖1D2)。階段IV的蠶繭繼續(xù)貯藏1~2 d,蠶蛹變態(tài)成蛾。蠶蛹在發(fā)育期間表皮逐漸變硬且顏色變深,與其體內(nèi)的漆酶和酪氨酸有關(guān)。蛹表皮中的酪氨酸是蠶蛹表皮鞣化過程中的色素前體物質(zhì)[25],蠶結(jié)繭后蛹的皮膚會(huì)分泌酪氨酸的酚類衍生物,經(jīng)由漆酶作用后形成醌類物質(zhì),表皮中的蛋白質(zhì)發(fā)生鞣化,使得蠶蛹的外表皮逐漸變硬、顏色變深,酪氨酸含量會(huì)隨著表皮顏色的變深急劇降低[26]。

    本實(shí)驗(yàn)通過對不同階段蠶繭、蠶蛹的質(zhì)量以及蠶蛹的體長進(jìn)行記錄,發(fā)現(xiàn)在蠶蛹發(fā)育的過程中,蠶蛹以及蠶繭的質(zhì)量呈下降的趨勢(表1)。與階段III相比,階段IV蠶繭和蛹的質(zhì)量顯著降低了10.22%(P<0.05),而各階段蛹的體長無顯著變化。從階段I~I(xiàn)V(羽化前),蛹體質(zhì)量下降,蛹體的顏色變深,這與其變態(tài)過程中機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān)。

    表1 蠶蛹貯藏期間蠶繭質(zhì)量、蠶蛹質(zhì)量及蠶蛹體長(n=20)Table1 Silkworm cocoon mass, silkworm pupa mass and silkworm pupa body length during storage (n = 20)

    2.2 貯藏期桑蠶蛹和繅絲蠶蛹的基本化學(xué)成分變化

    4 個(gè)貯藏階段的蠶蛹以及繅絲蠶蛹的蛋白質(zhì)、脂肪和灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析結(jié)果如表2所示。階段II的蠶蛹蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于階段I(P<0.05),貯藏階段III、IV蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有顯著差異(P>0.05)。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)比值(protein/ glyceride,P/G)≥2的昆蟲為高蛋白昆蟲,而P/G<2的昆蟲為高脂肪昆蟲[27]。本實(shí)驗(yàn)中,蠶蛹P/G在1~2之間,說明蠶蛹是一種高脂肪的食用昆蟲。隨著貯藏的時(shí)間延長,蠶蛹脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化呈現(xiàn)下降的趨勢,這可能是由于貯藏期蠶蛹的發(fā)育消耗體內(nèi)貯藏的脂肪??壗z蠶蛹的蛋白質(zhì)和脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)介于階段I和階段II的鮮蛹之間,說明繅絲工藝對蠶蛹的蛋白質(zhì)和脂肪含量無顯著影響。蠶蛹屬于高脂肪昆蟲,可作為食品級(jí)昆蟲油脂的提取原料,貯藏時(shí)間會(huì)影響其基本化學(xué)成分含量。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對貯藏期桑蠶蛹、繅絲后蠶蛹進(jìn)行蛋白質(zhì)組成和油脂組成進(jìn)行分析,研究貯藏時(shí)間及繅絲工藝是否會(huì)對蠶蛹蛋白質(zhì)以及脂肪的組成有影響。

    表2 不同貯藏階段的蠶蛹基本化學(xué)成分(n= 3)Table2 Proximate composition of silkworm pupa during storage (n = 3)

    2.3 貯藏期桑蠶蛹和繅絲蠶蛹的蛋白質(zhì)變化

    蠶蛹體內(nèi)蛋白質(zhì)在分子質(zhì)量30、70 kDa附近含量高,隨著貯藏時(shí)間延長呈下降趨勢,180 kDa附近的蛋白含量隨著貯藏時(shí)間延長不斷增加(圖2)。與階段I和II相比,階段III在70 kDa附近的蠶蛹蛋白含量顯著降低,40~50 kDa范圍出現(xiàn)了新的蛋白質(zhì)條帶。階段IV在70 kDa和30 kDa附近的蠶蛹蛋白含量均明顯下降。與貯藏期蠶蛹相比,繅絲蠶蛹30 kDa附近的蛋白質(zhì)含量相對較低,70 kDa附近的蛋白質(zhì)含量高,且在245 kDa附近出現(xiàn)新條帶。

    圖2 貯藏期中不同貯藏階段蠶蛹蛋白的分子質(zhì)量分布Fig. 2 Molecular mass distribution of silkworm pupa proteins during storage

    蠶蛹的蛋白質(zhì)表達(dá)與其生長發(fā)育有密切關(guān)系。桑蠶中30 kDa附近的蛋白質(zhì)主要存在于血淋巴中,屬于鱗翅目低密度脂蛋白家族,被稱為30K蛋白。30K蛋白由桑蠶幼蟲的外周脂肪體合成并以階段性依賴的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到血淋巴,最終以顆粒的形式貯藏在內(nèi)臟脂肪體中,為非進(jìn)食的蛹提供生長發(fā)育必要的營養(yǎng)物質(zhì)[28-30]。30K蛋白的抗細(xì)胞凋亡活性是目前的研究重點(diǎn),于威等[31]利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶卵巢培養(yǎng)細(xì)胞(BmN)中表達(dá)3 種30K蛋白,發(fā)現(xiàn)30Kc6、30Kc12p和30Kc19G1 3 種30K蛋白對H2O2誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中,‘兩廣二號(hào)’桑蠶蛹30K蛋白含量隨著蠶繭貯藏時(shí)間的延長呈下降趨勢,可能與其基因表達(dá)的時(shí)間特異性有關(guān)。Hou Yong[30]和Sun Quan[32]等均發(fā)現(xiàn)‘p50’品系的桑蠶中30K蛋白水平在化蛹前增加,化蛹后表達(dá)量下降;李擎等[33]發(fā)現(xiàn)在‘菁松’ב皓月’品系桑蠶中30K蛋白基因在5齡期幼蟲中表達(dá)量最高,在蛹期表達(dá)量次之,到蛾期表達(dá)量下降,與本實(shí)驗(yàn)中30K蛋白含量變化趨勢一致。說明蠶蛹30K蛋白表達(dá)與蠶蛹發(fā)育有關(guān),而與蠶蛹品系無關(guān)。

    目前對蠶蛹的研究發(fā)現(xiàn)70 kDa附近蛋白主要是家蠶貯藏蛋白(storage protein,SP)和酚氧化酶。SP分為SP 1(分子質(zhì)量82 kDa)、SP 2(分子質(zhì)量72~76 kDa)和SP 3(分子質(zhì)量82.1 kDa)[34-36]。SP1屬于昆蟲血藍(lán)蛋白家族中的一種六聚體蛋白,是一種雌性家蠶特有蛋白,富含蛋氨酸[37]。蛋氨酸殘基能夠與機(jī)體內(nèi)氧化酶、過氧化氫等多種氧化劑反應(yīng)形成蛋氨酸亞砜,可降低氧化應(yīng)激損傷和抗哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的活性[38]。SP2蛋白不僅為家蠶的生長發(fā)育提供能量,而且對于細(xì)胞凋亡具有抑制作用[39]。SP2和SP3具有高度的序列相似性,在家蠶體內(nèi)形成穩(wěn)定復(fù)合物,該復(fù)合物降解后為蠶蛹的發(fā)育提供氨基酸來源[40]。昆蟲的酚氧化酶根據(jù)作用底物的不同可分為酪氨酸酶類型酚氧化酶和漆酶類型酚氧化酶,Yatsu[41]和Yamazaki[42]等在蠶蛹中分離到的漆酶分子質(zhì)量為70 kDa,韓宏巖等[43]從家蠶表皮分離純化得到的酪氨酸酶分子質(zhì)量約為80 kDa。酚氧化酶是黑化反應(yīng)過程中黑色素合成的關(guān)鍵因素,本實(shí)驗(yàn)中階段IV蠶蛹的黑化與70 kDa蛋白的表達(dá)相關(guān),但該階段70 kDa附近蛋白質(zhì)表達(dá)量降低的原因未知。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,繅絲蠶蛹中70 kDa蛋白質(zhì)含量豐富,可作為70 kDa蛋白質(zhì)的提取來源。目前,關(guān)于桑蠶蛹蛋白質(zhì)組成及活性的研究較少,其組成變化與生理活性之間的聯(lián)系有待于進(jìn)一步研究。

    2.4 貯藏期桑蠶蛹油及繅絲蠶蛹油脂肪酸組成的變化

    貯藏期蠶蛹油中含有16 種脂肪酸,繅絲蠶蛹油含有15 種脂肪酸(表3)。在各貯藏階段,樣品含飽和脂肪酸8 種,含量最高的是棕櫚酸(30.70%~32.47%);單不飽和脂肪酸3 種,含量最高的是油酸(15.08%~16.86%);多不飽和脂肪酸5 種,含量最高的是α-亞麻酸(26.03%~28.49%)。階段I、階段II蛹油中ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸的含量比(ω-6/ω-3)沒有顯著變化,階段IIIω-6/ω-3顯著上升(P<0.05),蛹油中ω-3脂肪酸含量的動(dòng)態(tài)變化可能與蠶蛹體內(nèi)的脂肪酸脫氫酶的調(diào)節(jié)有關(guān)[44]。于海彥等[45]研究發(fā)現(xiàn)在蠶蛹發(fā)育的過程中初期ω-3脂肪酸脫氫酶表達(dá)量降低,在發(fā)育后期脫氫酶表達(dá)量上升,使蛹體內(nèi)ω-6/ω-3比例上升。與貯藏期蛹油相比,繅絲蛹油未檢出二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA),但α-亞麻酸含量顯著較高(P<0.05),這可能與繅絲工藝中熱處理及脂肪酸的不飽和程度有關(guān)。鮮繭繅絲工藝中的加熱溫度低于100 ℃,能夠防止多不飽和脂肪酸的熱裂解或降低蠶蛹油脂的氧化速率,但高溫加速了EPA的氧化分解。

    表3 貯藏期各階段蠶蛹油的脂肪酸組成(n=3)Table3 Fatty acid composition of silkworm pupa oil during storage (n = 3)

    目前的研究表明,富含ω-3系α-亞麻酸的蠶蛹油具有抗氧化、降血糖、降血脂和改善記憶的功效[46-47],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著貯藏時(shí)間的延長,蠶蛹油中ω-3脂肪酸相對含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,而繅絲蛹油中的ω-3脂肪酸相對含量高于貯藏期蠶蛹。

    2.5 貯藏時(shí)間對桑蠶蛹油DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除率和總酚含量的影響

    蠶蛹油DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50在貯藏期呈減小的趨勢(52.00~20.93 mg/mL和156.81~33.32 mg/mL),總酚含量在貯藏期呈現(xiàn)上升趨勢(15.95~77.50 mg/kg)(表4),各階段蠶蛹油及繅絲蠶蛹油對自由基的清除力與蠶蛹油質(zhì)量濃度成正比。各貯藏階段的蠶蛹油DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50及油脂總酚含量有顯著性差異(P<0.05)階段IV蠶蛹油的總酚含量最高(77.50 mg/kg),其DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率也達(dá)到最高。這一現(xiàn)象可能與蠶蛹貯藏的過程中蛹體內(nèi)的生理變化有關(guān)[43],實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明蠶蛹油體外抗氧化能力可能與蠶蛹體內(nèi)酚含量呈正相關(guān)??壗z蠶蛹油的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率的IC50分別為37.63 mg/mL和92.42 mg/mL,其DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率顯著高于貯藏期I和II階段(P<0.05),但顯著低于貯藏期III和IV階段的蠶蛹油(P<0.05)。Hu Bin等[12]采用微波輔助聯(lián)合乙醇-正己烷混合提取四川雅安地區(qū)桑蠶蛹油,并測定其DPPH自由基清除能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法所提蛹油DPPH自由基清除能力(IC50=26.47 mg/mL)高于索氏抽提法得到的蠶蛹油(IC50=34.53 mg/mL)。Manosroi等[48]使用石油醚冷浸提得到的泰國本地蠶蛹油IC50為10.08 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)采用正己烷浸提蠶蛹油,階段IV的蠶蛹油DPPH自由基清除能力高于Hu Bin等[12]提取的蠶蛹油,但低于Manosroi等[48]提取的蠶蛹油。階段IV蠶蛹油的總酚含量與Hu Bin等[12]微波輔助聯(lián)合乙醇-正己烷法提取的蠶蛹油(78.36 mg/kg)接近,而繅絲蠶蛹油總酚含量低于Hu Bin等[12]索氏抽提法提取的蠶蛹油(42.76 mg/kg),說明蠶蛹的品種、蛹的發(fā)育、提取工藝均會(huì)影響蛹油的總酚含量及其體外DPPH自由基清除能力。葛雙雙等[49]發(fā)現(xiàn)油脂的體外抗氧化活性與其含有的α-亞麻酸共軛雙鍵自由基引起的分子重排有關(guān),該過程包括了單分子加成、碳碳雙鍵氧化及環(huán)氧化的復(fù)雜過程。本實(shí)驗(yàn)中,階段II的蠶蛹油α-亞麻酸相對含量最高(28.49%),但其DPPH自由基清除能力(IC50=51.04 mg/mL)低于階段IV蠶蛹油的DPPH自由基清除能力(IC50=20.93 mg/mL)。此外,本實(shí)驗(yàn)中蛹油DPPH自由基清除率的IC50遠(yuǎn)低于其ABTS陽離子自由基清除率的IC50。這可能是由于DPPH自由基與脂溶性的物質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,更適用于評(píng)價(jià)脂溶性的物質(zhì)的抗氧化活性[50]。綜上,α-亞麻酸含量與蠶蛹油的體外抗氧化活性沒有相關(guān)性,蠶蛹油的自由基清除能力可能與蠶蛹油中的酚類物質(zhì)含量有關(guān)。

    表4 貯藏階段蠶蛹油自由基清除率和總酚含量Table4 Free radical scavenging capacity and total phenol content of silkworm pupa oil during storage

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)所用的‘兩廣二號(hào)’桑蠶蛹屬于高脂肪昆蟲,含有豐富的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸。貯藏時(shí)間顯著影響蠶蛹營養(yǎng)品質(zhì)及蛹油的抗氧化活性,這可能與貯藏過程中蠶蛹的發(fā)育有關(guān)。蛹油中的總酚含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)。蠶蛹是蠶繭繅絲的副產(chǎn)品,目前工業(yè)生產(chǎn)收集蠶繭有季節(jié)性,蠶繭貯藏條件不穩(wěn)定且貯藏時(shí)間較長,這些會(huì)影響繅絲蠶蛹的營養(yǎng)品質(zhì)和生理活性。因此,繅絲蠶蛹綜合利用可根據(jù)不同貯藏時(shí)期蠶蛹樣品的營養(yǎng)價(jià)值來選擇原料對象,提高繅絲副產(chǎn)物的品質(zhì)和利用率。

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