宰后N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽處理對藏羊肉品質(zhì)的影響

張攀高，師希雄，田 鑄，陳 騁，韓 玲，李雪茹

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

藏羊又稱藏系綿羊，是我國三大粗毛羊品種之一，原產(chǎn)于青藏高原，主要分布于我國西藏、青海和甘肅等海拔3 000 m以上的高寒缺氧地區(qū)[1]。甘肅省的藏羊主要分布在甘南藏族自治州以及張掖市肅南裕固族自治縣等地區(qū)[2]。甘南藏族自治州的藏羊有甘加、歐拉、喬科3 種類型，其中，歐拉藏羊作為藏系綿羊的一種，其羊肉具有高蛋白、低脂肪、礦物質(zhì)含量豐富、維生素和氨基酸含量高的特點(diǎn)[3]，但其嫩度較低，口感較差，生鮮肉的品質(zhì)不穩(wěn)定，從而影響了歐拉藏羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，有必要研究生鮮肉品質(zhì)形成的影響因素，以便為改善肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。影響生鮮肉品質(zhì)的因素包括宰前因素和宰后因素，其中，宰后因素主要包括成熟和宰后處理。肉成熟的本質(zhì)是宰后肌肉中發(fā)生一系列生理生化代謝的總和，宰后肌細(xì)胞重要的生化代謝可一定程度上解釋生鮮肉品質(zhì)變化的差異性[4]。然而，目前對于宰后肌細(xì)胞的生化代謝有待深入研究，肉的成熟機(jī)理尚不明確。

宰后肌肉細(xì)胞中由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）催化精氨酸向瓜氨酸代謝產(chǎn)生NO，NO與蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基的共價結(jié)合會使蛋白質(zhì)發(fā)生亞硝基化，蛋白質(zhì)的亞硝基化可改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[5]。此外，NO還可與超氧化物產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽，該物質(zhì)是蛋白質(zhì)的強(qiáng)氧化劑。因此，NO可影響宰后肉品質(zhì)的形成[6]。目前，國內(nèi)外已有學(xué)者研究了NOS抑制劑對宰后肉品質(zhì)的影響。Cottrell等[7]研究發(fā)現(xiàn)，宰前注射NOS抑制劑可顯著降低綿羊腰大肌的剪切力與pH值，對肉色無顯著影響。劉瑞[4]也報道，宰后豬肉經(jīng)NOS抑制劑（N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽（N-nitro-Larginine methyl ester hydrochloride，L-NAME））浸泡后pH值降低。Hou Qin等[8]發(fā)現(xiàn)NOS抑制劑處理可提高牛肉半膜肌嫩度。Zhang Chaoyang等[9]的研究表明，NO可調(diào)節(jié)宰后成熟過程中肌肉蛋白酶水解活性，NOS抑制劑（L-NAME）處理可促進(jìn)牛肉肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T的降解，有利于牛肉的嫩化。然而，Cottrell等[10]報道，山羊宰前注射L-NAME抑制了半膜肌中的蛋白水解，降低了嫩度。Liu Rui等[11]也發(fā)現(xiàn)，NO被認(rèn)為是鈣蛋白酶1的調(diào)節(jié)因子，可抑制豬骨骼肌中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的蛋白水解，不利于肉的嫩化。Zhang Wangang等[12]的研究表明，宰后初期NOS抑制劑組的肉樣中羰基含量顯著低于對照組和NO增強(qiáng)劑組，在冷藏過程中，NOS抑制劑組的雞胸肉具有更高的L*值和更低的a*值，但b*值在宰后成熟過程中無顯著變化。Li Yupin等[13]也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NO供體處理后的豬肉，羰基含量顯著上升，蛋白氧化水平明顯升高。

綜上所述，關(guān)于NOS抑制劑對宰后肉品質(zhì)的研究主要以雞肉、豬肉、牛肉、山羊肉為主，而且結(jié)論不一致。目前，關(guān)于NOS抑制劑如何影響宰后藏羊肉品質(zhì)鮮見文獻(xiàn)報道。因此，本實(shí)驗(yàn)以甘南歐拉藏羊后腿肉為實(shí)驗(yàn)材料，分別采用30、60、90 mmol/L的L-NAME處理肉樣（以去離子水浸泡作為對照）。在4 ℃條件進(jìn)行成熟，測定成熟期間（0、1、3、5、7 d）NOS活力、NO含量并分析總巰基含量、羰基含量、肌原纖維小片化指數(shù)（myoifbril fragmentation index，MFI）以及pH值、肉色等指標(biāo)的變化，研究NOS抑制劑對宰后藏羊肉品質(zhì)的影響，為宰后藏羊肉品質(zhì)改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4～5 歲的歐拉藏羊6 只，體質(zhì)量相近，生理成熟度等指標(biāo)基本相似，選自甘肅安多清真綠色食品有限公司。宰前保證藏羊健康狀況良好，跟腱吊掛，從半胴體上取下后腿肉作為實(shí)驗(yàn)材料。

L-NAME 美國Sigma公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl-hydrazin，DNPH） 天津市光復(fù)科科技發(fā)展有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid，EGTA） 上海中秦化學(xué)試劑有限公司；天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB） 北京拜爾迪生物公司；鹽酸胍、尿素 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；NOS、NO檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機(jī) 江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；HH-2型電熱恒溫水浴鍋 西安科昊生物工程有限責(zé)任公司；雷磁PHS-25型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TGL-16MC型臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀集團(tuán)；CR-10型色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；DW-86L828型海爾超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；SP-756P型紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；HX202T型電子天平 慈溪市天東衡器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

選取4～5 歲藏羊后腿肉，剔去筋膜、脂肪等后，切成大小均勻的薄片（8 cm×8 cm×0.5 cm），用20 G穿刺針均勻穿刺，分別用去離子水（對照組）和30、60、90 mmol/L的L-NAME（處理組）溶液將肉樣以料液比1∶1進(jìn)行浸泡，在4 ℃下浸泡1 d后，用濾紙輕輕按壓吸干肉塊表面水分，在4 ℃條件下進(jìn)行成熟，在不同成熟時間點(diǎn)（0、1、3、5、7 d）分別采樣?，F(xiàn)場測定pH值和色澤，其余樣品在－80 ℃條件下貯存，用于測定NO含量、NOS活力、總巰基含量、羰基含量及MFI。

1.3.2 NOS活力和NO含量測定

NOS活力和NO含量使用NOS活力和NO含量試劑盒進(jìn)行測定，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計。

1.3.3 pH值的測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[14]的方法進(jìn)行測定。

1.3.4 色澤測定

采用CR-10型色差儀測定樣品的L*、a*、b*值，先將儀器預(yù)熱30 min后用校正板校準(zhǔn)，光源為D65，視角為2°，樣品測定3 個平行[15]。

1.3.5 MFI的測定

參考Wang Linlin等[16]的方法并略作修改。稱取2 g肉樣（剔除筋膜），加入20 mL的MFI緩沖液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L Na3PO4、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH 7.1），肉樣冰浴勻漿30 s后，于4 ℃、1 000×g下離心15 min，棄去上清液，再次加入20 mL MFI緩沖液使沉淀重新處于懸濁態(tài)，再于4 ℃、1 000×g下離心15 min，棄去上清液。再用5 倍體積的MFI緩沖液重懸沉淀，并通過200 目尼龍過濾器過濾懸浮液。再用上述沉淀5 倍體積的MFI緩沖液沖洗過濾器。用雙縮脲法測定所得懸濁液中蛋白含量。用MFI緩沖液調(diào)節(jié)肌原纖維懸浮液中蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，于540 nm波長處測定吸光度，將所得結(jié)果乘以200后即為MFI。

1.3.6 羰基、總巰基含量測定

1.3.6.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參考Park等[17]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取2 g肉樣，加入4 倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（10 mmol/L磷酸鉀緩沖液、0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA，pH 7.0），13 000 r/min勻漿10 s，4 ℃、2 000×g下離心15 min，棄去上清液，用4 倍體積的標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液溶解沉淀后，4 ℃、2 000×g下離心15 min，棄上清液，重復(fù)2 次；沉淀再用4 倍體積的0.1 mol/L KCl溶液以上述條件洗滌2 次之后，經(jīng)單層紗布過濾以去除殘留結(jié)締組織等，于4 ℃離心15 min（1 250×g）后棄上清液，所得膏狀沉淀即為肌原纖維蛋白。沉淀用4 倍體積的0.1 mol/L KCl溶液溶解后，用雙縮脈法測定蛋白含量，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.2 羰基含量測定

羰基含量參考Wang Huihui等[18]的方法進(jìn)行測定。使用DNPH法測定羰基含量。稀釋后的肌原纖維蛋白樣品（5 mg/mL）中加入2 mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% DNPH的HCl溶液（2 mol/L），37 ℃避光條件下水浴60 min（每15 min渦流振蕩一次）。測定370 nm波長處的吸光度，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)2 200 L/（mol·cm）計算羰基含量。

1.3.6.3 總巰基含量測定

巰基含量參考Wang Huihui等[18]的方法進(jìn)行測定。用25 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 6.25）將肌原纖維蛋白樣品稀釋至2 mg/mL。取0.5 mL蛋白懸液于2.0 mL尿素-十二烷基硫酸鈉溶液（8.0 mol/L尿素、30 g/L十二烷基硫酸鈉、0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.4）和0.5 mL 10 mmol/L DTNB試劑（溶解在0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液中，pH 7.4）。室溫孵育15 min后，在412 nm波長處測定其吸光度。總巰基含量按摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)均采用Excel 2013軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Orign 2017軟件作圖，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s進(jìn)行多重差異顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后藏羊肉NOS活力及NO含量的變化

由圖1可知，對照組與各處理組中NOS活力、NO含量均隨宰后時間的延長總體呈現(xiàn)下降趨勢，L-NAME處理組的NOS活力及NO含量均低于對照組。成熟7 d時，30、60、90 mmol/LL-NAME處理組的NOS活力分別比對照組低29.5%、38.2%、41.3%（P＜0.05），但不同處理組之間差異不顯著；不同處理組的NO含量分別比對照組低35.6%、29.6%、66.9%（P＜0.05），30 mmol/L與60 mmol/LL-NAME處理組的NO含量差異不顯著，但顯著高于90 mmol/LL-NAME處理組的NO含量?？梢?，采用NOS抑制劑處理歐拉藏羊肉后，NOS活力、NO含量均降低。

圖1 不同濃度NOS抑制劑處理對藏羊肉NOS活力（A）、NO含量（B）的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of NOS inhibitor on the contents of NOS (A) and NO (B) in Tibetan sheep meat

2.2 NOS抑制劑處理對宰后藏羊肉pH值的影響

由圖2可知，對照組與處理組的pH值隨宰后時間的延長總體呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。不同成熟時間下與對照組相比，30、60、90 mmol/LL-NAME處理組的pH值均顯著降低（P＜0.05），且隨L-NAME濃度的增大pH值顯著減小（P＜0.05）。處理后成熟7 d時，30、60、90 mmol/LL-NAME處理組的pH值分別比對照組低7.3%、12.7%、14.7%（P＜0.05）。由此可見，NOS抑制劑處理歐拉藏羊肉后，pH值顯著降低。

圖2 不同濃度NOS抑制劑處理對藏羊肉pH值的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of NOS inhibitor on pH of Tibetan sheep meat

2.3 NOS抑制劑處理對宰后藏羊肉色澤的影響

表1反映了L-NAME處理對藏羊肉肉色的影響，對照組與NOS抑制劑處理組的肉色L*、a*、b*值隨宰后成熟時間的變化趨勢不一致，但處理后成熟7 d時，30、60、90 mmol/LL-NAME處理組的肉色L*值分別比對照組高4.4%、9.1%、7.9%（P＜0.05），a*值分別比對照組低7.8%、24.9%、39.8%（P＜0.05），b*值與對照組差異不顯著。由此可見，采用L-NAME處理后，歐拉藏羊肉的肉色L*值顯著提高，a*值顯著降低。

表1 不同濃度L-NAME處理對藏羊肉色澤的影響Table1 Effects of different concentrations of NOS inhibitor on color parameters of Tibetan sheep meat

2.4 NOS抑制劑處理對宰后藏羊肉MFI的影響

由圖3可見，對照組與L-NAME處理組的MFI均隨著宰后成熟時間的延長整體呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。L-NAME處理后成熟7 d時，30、60、90 mmol/LL-NAME處理組的MFI分別比對照組高16.5%、7.9%、4.0%（P＜0.05），而且3 個處理組之間差異顯著。綜上，采用NOS抑制劑處理后，歐拉藏羊肉的MFI顯著提高，說明肌原纖維蛋白的降解程度增大。

圖3 不同濃度NOS抑制劑處理對藏羊肉MFI的影響Fig. 3 Effects of different concentrations of NOS inhibitor on MFI in Tibetan sheep meat

2.5 NOS抑制劑處理對宰后藏羊肉蛋白氧化的影響

由圖4可知，隨著貯藏時間延長，對照組與L-NAME處理組的羰基含量總體呈顯著上升趨勢（P＜0.05），總巰基含量總體呈顯著降低趨勢（P＜0.05），處理后成熟7 d時，30、60、90 mmol/LL-NAME處理組的羰基含量分別比對照組低24.1%、14.5%、32.8%（P＜0.05），總巰基含量分別比對照組高18.1%、16.9%、29.0%（P＜0.05）。由此可見，采用NOS抑制劑對宰后藏羊肉進(jìn)行處理后，羰基含量降低，總巰基含量升高，降低了蛋白質(zhì)的氧化程度。

圖4 不同濃度NOS抑制劑處理對藏羊肉羰基（A）、總巰基（B）含量的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of NOS inhibitor on the contents of carbonyl (A) and total sulfhydryl (B) in Tibetan sheep meat

3 討 論

NO主要由肌肉細(xì)胞中NOS催化精氨酸向瓜氨酸代謝所產(chǎn)生，其作為活性氮的主要來源，在調(diào)節(jié)肌肉收縮、鈣穩(wěn)態(tài)、糖酵解和蛋白降解中發(fā)揮重要作用[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在宰后早期，動物肌肉中NOS的活性隨著冷藏時間的延長而逐漸減弱[6]。L-NAME作為L-精氨酸類似物，可通過與L-精氨酸競爭NOS的催化位點(diǎn)來抑制NOS的活性，從而導(dǎo)致肌肉中NO生成減少。本研究表明，采用NOS抑制劑處理后，藏羊肉的NOS活力與NO表達(dá)量顯著降低。該結(jié)果與Cottrell等[10]報道的宰前注射NOS抑制劑，宰后羊羔肉成熟過程中NO表達(dá)量降低的結(jié)果相一致。

pH值是衡量肉品質(zhì)重要指標(biāo)之一，直接反映肌糖原和葡萄糖酵解產(chǎn)生乳酸的積累程度，影響肉的嫩度和肉色等品質(zhì)[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用L-NAME處理后，隨著抑制劑濃度的增加，藏羊肉的pH值顯著降低，該結(jié)果可能是NOS抑制劑處理提高了肌酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和磷酸果糖激酶等糖酵解酶的活性，從而導(dǎo)致糖酵解速率加快，pH值降低[21]。張麗麗[22]研究表明，宰后經(jīng)L-NAME處理的豬肉pH值顯著下降。以上報道與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

肉色是重要的感官評價指標(biāo)，反映了肉品的新鮮度，主要由肌紅蛋白含量決定[23]。Moller等[24]研究發(fā)現(xiàn)，NO與肌紅蛋白發(fā)生反應(yīng)，使肉制品呈現(xiàn)粉紅色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L-NAME處理組中的a*值較低，可能與NO含量較少有關(guān)。同時，L-NAME處理組L*值顯著提高，可能是處理組具有較低的pH值，從而引起肌肉表面滲出水分增多，導(dǎo)致光線照射到肉表面會被反射回來，使得肉色L*值變大[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Zhang Wangang等[12]報道的雞胸肉成熟期間NOS抑制劑處理組具有更高L*值和更低a*值的結(jié)果相一致。

MFI能夠反映肌原纖維蛋白的降解情況，是評估肉嫩度的一個重要指標(biāo)[26]。MFI越大，肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性受到破壞的程度越大，肌肉成熟度越高[27]。鈣蛋白酶系統(tǒng)負(fù)責(zé)細(xì)胞骨架蛋白（肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白）和中間絲蛋白（肌間線蛋白）的水解[28]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)硝基化可能通過間接改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度或直接影響鈣蛋白酶的活性從而對肌原纖維蛋白的降解產(chǎn)生影響[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用L-NAME處理后，歐拉藏羊肉的MFI顯著提高，說明肌原纖維蛋白的降解程度增大。可能由于NO是鈣蛋白酶的調(diào)節(jié)因子，抑制了骨骼肌細(xì)胞中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的蛋白水解[11]。Hou Qin[8]與Li Yupin[13]等也發(fā)現(xiàn)，采用L-NAME處理能顯著加速肌原纖維蛋白的降解。

蛋白氧化是影響肉品質(zhì)的一個重要因素，其氧化程度可用羰基與總巰基含量反映[30]。NO作為自由基能夠加速蛋白質(zhì)的氧化[5]。隨著宰后肌肉抗氧化能力的減弱，NO會與肌肉中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2－·）生成過氧亞硝酸根離子（ONOO－），從而提高肌肉的氧化水平[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，L-NAME處理組的羰基含量降低，總巰基含量升高，降低了蛋白質(zhì)的氧化程度，可能是抑制劑組的NO表達(dá)量減少，從而降低了蛋白質(zhì)的氧化程度。Zhang Wangang[12]和Li Yupin[13]等分別發(fā)現(xiàn)雞胸脯肉和豬背最長肌在宰后成熟過程中NO供體處理組羰基含量高于對照組與NOS抑制劑組。

4 結(jié) 論

NOS抑制劑L-NAME處理能夠顯著降低NOS活性，減少NO的含量（P＜0.05），導(dǎo)致宰后藏羊肉成熟過程中pH值、肉色a*值及羰基含量顯著降低（P＜0.05）。同時，肉色L*值、MFI和總巰基含量顯著上升（P＜0.05）。綜上，NOS抑制劑L-NAME處理抑制了宰后藏羊肉成熟過程中蛋白質(zhì)氧化，促進(jìn)了肌原纖維蛋白的降解，對宰后藏羊肉品質(zhì)具有改善作用。因此，可采用注射L-NAME的方法調(diào)控宰后藏羊肉的品質(zhì)，但是，L-NAME對宰后藏羊肉品質(zhì)的影響機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。