脂質(zhì)過氧自由基誘導(dǎo)兔肉肌漿蛋白聚集機(jī)制

王兆明，徐寶才，李洪軍

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；3.農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

兔肉營養(yǎng)價(jià)值高，具有“四高四低”（高蛋白、高賴氨酸、高卵磷脂、高消化率和低脂肪、低膽固醇、低尿酸、低熱量）的特點(diǎn)。此外，兔肉還具有優(yōu)良的保健性能，Zotte等[1]指出兔肉富含生物活性物質(zhì)的特點(diǎn)對于控制心血管病及其他慢性疾病有重要的作用，可以作為功能性食品。Hermida等[2]證實(shí)兔肉“高鉀低鈉”的特點(diǎn)使其適于高血壓病人食用。同時(shí)，兔肉因煙酸含量高而具有美容的功效，被稱為“美容肉”[3]。

在兔肉蛋白質(zhì)中，肌漿蛋白是一種重要的蛋白質(zhì)組分，約占總蛋白質(zhì)組成的30%～34%[4]。肌漿蛋白是復(fù)雜的混合物，含有肌紅蛋白和多種代謝酶等組分。肌漿蛋白大多含有球蛋白結(jié)構(gòu)并具有水溶性[5]。球蛋白能夠賦予肌漿蛋白功能性質(zhì)，例如，肌紅蛋白溶解性功能依賴于球蛋白[6]。作為肌肉蛋白的重要組分，肌漿蛋白與肉的品質(zhì)密切相關(guān)。盡管Marino等[7]指出肌漿蛋白不是肌肉的結(jié)構(gòu)蛋白（肌原纖維蛋白），并且原位可溶性的特點(diǎn)使得肌漿蛋白組分的變化與肉的嫩度變化無關(guān)，但是肌漿蛋白對肉的保水性和色澤等品質(zhì)特性具有重要的影響[8]。肌漿蛋白中的肌紅蛋白直接影響鮮肉的色澤。肌漿蛋白中鈣蛋白酶氧化可以影響其對蛋白質(zhì)的水解活性，從而對鮮肉品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[9]。Liu Jiao等[10]研究發(fā)現(xiàn)變性的肌漿蛋白可以在肌原纖維外形成具有保水能力的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)保水性。

不飽和脂質(zhì)在引發(fā)劑（光、加熱、氧氣、金屬等）的作用下會脫氫生成自由基，這些脂質(zhì)自由基會與氧氣發(fā)生反應(yīng)生成過氧自由基（ROO·）。ROO·作為鏈傳遞反應(yīng)的載體不僅可以攻擊不飽和脂質(zhì)，還可以攻擊蛋白質(zhì)中富含電子的位點(diǎn)，引發(fā)蛋白質(zhì)的氧化反應(yīng)。蛋白質(zhì)氧化可以引起蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)的變化，例如構(gòu)象、溶解度以及水解敏感性，從而影響肉品品質(zhì)[8]。交聯(lián)聚集是蛋白質(zhì)氧化的重要形式，肌漿蛋白聚集對肌肉的保水性和色澤等具有重要影響[8]。利用偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）的熱分解作用生成ROO·已經(jīng)在脂質(zhì)氧化模擬體系中廣泛應(yīng)用[11-12]。AAPH在37 ℃條件下會自發(fā)分解生成一分子氮和兩分子碳中心自由基，后者可以迅速與分子氧反應(yīng)生成ROO·[13]。在含有蛋白質(zhì)的溶液中，AAPH能夠以1.36×10－6mol/（L·s）的恒定速率生成ROO·，并且生成ROO·的量與AAPH濃度成正比[13]。Zhou Feibai等[11]指出AAPH衍生的ROO·體系能夠模擬ROO·的穩(wěn)定形成，從而可以與肉的一些實(shí)際貯藏情況進(jìn)行比較。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)研究了ROO·對肌原纖維蛋白的氧化修飾效應(yīng)[11,14]，但是目前鮮見關(guān)于脂質(zhì)氧化產(chǎn)物對肌漿蛋白氧化修飾的相關(guān)報(bào)道。H??等[15]指出脂質(zhì)氧化產(chǎn)物中的過氧化物與蛋白質(zhì)之間具有較高的反應(yīng)活性，兩者在有水的基質(zhì)中則反應(yīng)更劇烈。因此，相較于肌原纖維蛋白，肌漿蛋白（水溶性蛋白）可能是ROO·（具有水溶性）優(yōu)先攻擊的蛋白質(zhì)組分。明確ROO·誘導(dǎo)肌漿蛋白氧化聚集的機(jī)制有助于全面理解兔肉品質(zhì)的形成?；诖?，本實(shí)驗(yàn)利用AAPH的熱分解穩(wěn)定地生成ROO·，研究其對兔肉肌漿蛋白聚集行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

伊拉配套系商品代公兔（體質(zhì)量2 200～2 500 g）購自阿興記原種兔養(yǎng)殖基地。按常規(guī)方法擊暈宰殺、去皮、去頭、去內(nèi)臟后迅速分割取后腿，用取樣箱（箱內(nèi)溫度約為6 ℃）在5 h內(nèi)迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于－80 ℃的冰箱中備用。所有樣品均在30 d內(nèi)使用。

所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA323S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；S25渦旋混合器 德國IKA集團(tuán)；5810型臺式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；UV-16001紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司；Avanti J-30I冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；DW-86W100超低溫冰箱 青島海爾集團(tuán)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Elix10純水機(jī)美國密理博公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；ZEN3690激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；SCIENTZ-10N普通型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌漿蛋白提取

參照Chen Qian等[16]的方法適當(dāng)修改后提取兔肉肌漿蛋白。取25 g絞碎的兔肉樣品于250 mL的離心管中，加入100 mL冰浴磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L、pH 6.8），10 000 r/min均質(zhì)處理30 s。均質(zhì)液在5 000×g條件下冷凍離心30 min。離心后用定性濾紙過濾上清液，過濾液即為肌漿蛋白。以上操作均在冰浴條件下進(jìn)行。用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.2 肌漿蛋白氧化體系的制備

將1.3.1節(jié)提取的肌漿蛋白溶液用磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L、pH 6.8）調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至10 mg/mL。分別取上述溶液50 mL于6 個(gè)磨口玻璃瓶中。然后加入AAPH溶液，使得肌漿蛋白溶液中AAPH的最終濃度分別為0、1、2、3、4 mmol/L和5 mmol/L。將得到的混合溶液在37 ℃條件下避光搖動(dòng)5 h。隨后將樣品溶液在冰浴條件下冷卻至4 ℃，并在10 000×g條件下冷凍離心15 min。將上清液在4 ℃的高純水中透析（透析袋截留分子質(zhì)量7 kDa）60 h以除去殘留的AAPH，每10 h更換一次高純水。最后冷凍干燥得到氧化的肌漿蛋白樣品。

1.3.3 高鐵肌紅蛋白相對含量的測定

將肌漿蛋白溶液用高純水稀釋至質(zhì)量濃度為5 mg/mL。分別在503、525、582 nm和557 nm波長處測定吸光度。參考Wang Zhaoming等[17]的方法按式（1）計(jì)算高鐵肌紅蛋白（methemoglobin，MetMb）的相對含量。

1.3.4 超鐵肌紅蛋白濃度的測定

參考Wang Zhaoming等[17]的方法測定超鐵肌紅蛋白Mb(IV)＝O濃度。將1.3.3節(jié)制備的肌漿蛋白溶液在412 nm波長處測定吸光度，根據(jù)摩爾消光系數(shù)（111 mmol/（L·cm））計(jì)算Mb(IV)＝O濃度。

1.3.5 肌漿蛋白羰基含量的測定

參考Zhou Feibai等[11]的方法適當(dāng)修改后測定肌漿蛋白羰基含量。將1.3.2節(jié)不同濃度AAPH處理的肌漿蛋白樣品分別用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L、pH 6.0）調(diào)整到質(zhì)量濃度為5 mg/mL，從每一組樣品中分別取兩份蛋白質(zhì)溶液（0.4 mL）于2 mL的離心管中。其中一份用800 μL的2 mol/L HCl溶液（含有0.2 g/100 mL的2,4-二硝基苯肼）處理，記為處理組；另一份用800 μL的2 mol/L HCl處理，記為空白組。將處理組和空白組樣品在室溫下反應(yīng)30 min后，加入400 μL的三氯乙酸（40 g/L）沉淀蛋白質(zhì)。隨后離心處理（4 ℃、5 000×g、5 min），并移除上清液。加入1 mL乙醇-乙酸乙酯混合液（1∶1，V/V）洗滌沉淀以除去未反應(yīng)的2,4-二硝基苯肼，隨后進(jìn)行離心（4 ℃、5 000×g、5 min）。上述洗滌過程重復(fù)3 次后，加入1.5 mL的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L、pH 6.5，含有6 mol/L鹽酸胍）溶解沉淀。放置過夜后，在370 nm波長處測定吸光度，蛋白質(zhì)羰基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)（22 000 mmol/（L·cm））計(jì)算。

1.3.6 肌漿蛋白總巰基含量的測定

參考Kang Dacheng等[18]的方法適當(dāng)修改后測定蛋白總巰基含量。用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L、pH 6.0）將1.3.2節(jié)肌漿蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整到5 mg/mL。吸取1 mL肌漿蛋白溶液，用9 mL的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0，包含8 mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl、10 mmol/L EDTA-2Na）稀釋。取3 mL的稀釋液于試管中，加入0.4 mL 0.1%的5,5’-二硝基(2-硝基苯甲酸)，隨后在40 ℃下避光放置25 min。冷卻至室溫后在412 nm波長處測定吸光度?？値€基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)（13 600 mmol/（L·cm））計(jì)算。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

用磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L、pH 6.8）將1.3.2節(jié)肌漿蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL。取1 mL的蛋白質(zhì)溶液分別加入4 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）（還原條件）和不含有β-ME（非還原條件）的上樣緩沖液中，在沸水條件下加熱3 min。冷卻至室溫后離心（3 000×g、5 min），取10 μL上清液上樣。在30 mA的條件下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后，在1 L染色液中（內(nèi)含100 mL冰醋酸、100 mL甲醇和1 g考馬斯亮藍(lán)R-250）染色處理1 h，隨后在1 L脫色液（內(nèi)含100 mL冰醋酸和100 mL甲醇）中脫色處理5 h。

1.3.8 肌漿蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測定

參考Jiang Wenxin等[19]的方法并適當(dāng)修改測定蛋白內(nèi)源熒光光譜。用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L、pH 6.0）將1.3.2節(jié)凍干肌漿蛋白溶解至0.5 mg/mL，用熒光分光光度計(jì)記錄300～500 nm波長處的光譜，激發(fā)波長為295 nm，掃描速率為1 500 nm/min。

1.3.9 肌漿蛋白表面疏水性的測定

參考Chelh等[20]的方法修改后測定蛋白質(zhì)表面疏水性。1.3.2節(jié)凍干肌漿蛋白用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）溶解至5 mg/mL。隨后，取1 mL的蛋白溶液與0.2 mL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液混合。同時(shí)制備對照組樣品，即取1 mL磷酸鹽緩沖液加入0.2 mL的溴酚藍(lán)溶液。所有樣品在25 ℃下振蕩10 min后離心（4 ℃、2 000×g、15 min）。取0.4 mL上清液，加入3.6 mL磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L、pH 6.0）稀釋，在595 nm波長處測定光密度值。肌漿蛋白質(zhì)表面疏水性以溴酚藍(lán)結(jié)合量表示，按式（2）計(jì)算。

式中：ODcontrol為對照組在595 nm波長處光密度值；ODsample為樣品在595 nm波長處光密度值。

1.3.10 肌漿蛋白粒度的測定

參考Bao Zhijie等[12]的方法適當(dāng)修改后測定肌漿蛋白粒度。用高純水將1.3.2節(jié)凍干肌漿蛋白溶解后，調(diào)整質(zhì)量濃度至0.25 mg/mL。用激光粒度分析儀測定肌漿蛋白的粒度分布。儀器參數(shù)設(shè)置為物質(zhì)折射率1.520、介質(zhì)為水、介質(zhì)折射率1.333。

1.3.11 肌漿蛋白濁度的測定

參考Chen Nannan等[21]的方法適當(dāng)修改后測定肌漿蛋白濁度，將1.3.2節(jié)凍干肌漿蛋白溶于磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L、pH 6.8）中，蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至5 mg/mL。在600 nm波長處測定分散體的吸光度，以吸光度表示樣品的濁度。

1.3.12 肌漿蛋白溶解度的測定

用磷酸鹽緩沖液（40 mmol/L、pH 6.8）將1.3.2節(jié)凍干肌漿蛋白溶解至5 mg/mL。在10 000×g條件下冷凍離心15 min。分別測定離心前后的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白溶解度按式（3）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測定3 次，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。運(yùn)用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA），用Tukey HSD法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ROO·對MetMb相對含量和Mb(IV)＝O濃度的影響

不同濃度AAPH處理對兔肉肌漿蛋白中MetMb相對含量的影響如圖1所示，隨著AAPH濃度的增大，MetMb相對含量顯著升高（P＜0.05），說明ROO·可以促進(jìn)肌紅蛋白的自動(dòng)氧化。Celedón等[22]報(bào)道了AAPH產(chǎn)生的ROO·可以促進(jìn)血紅蛋白的氧化，這與本研究的結(jié)果類似。通常而言，肌紅蛋白自動(dòng)氧化僅僅指血紅素內(nèi)鐵原子的氧化，而不涉及球蛋白氨基酸殘基的氧化修飾。在肌紅蛋白分子中，球蛋白可以保護(hù)肌紅蛋白血紅素輔基免受外部氧化環(huán)境干擾[6]。ROO·對球蛋白的氧化修飾可能引起其結(jié)構(gòu)的變化，繼而導(dǎo)致其對血紅素輔基保護(hù)功能減弱，使得血紅素內(nèi)的鐵原子容易接觸到氧化環(huán)境，發(fā)生自動(dòng)氧化反應(yīng)。

圖1 AAPH處理對肌漿蛋白中MetMb含量的影響Fig. 1 Changes in MetMb in sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

由圖1可知，隨著AAPH濃度的增大，Mb(IV)＝O濃度顯著增加（P＜0.05）。在DeoMb和OxyMb自動(dòng)氧化過程中，會生成超氧陰離子自由基和中性超氧陰離子自由基（O2·），二者可以相互反應(yīng)（和質(zhì)子）生成H2O2

[23]。在H2O2存在的情況下，MetMb可以進(jìn)一步發(fā)生氧化反應(yīng)生成血紅素自由基陽離子，即Mb·＋(IV)＝O[17]。Mb·＋(IV)＝O可以迅速與周圍的球蛋白發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，生成以Fe(IV)＝O為中心的球蛋白自由基，即Mb(IV)＝O前體物質(zhì)——·Mb(IV)＝O[17]，·Mb(IV)＝O不穩(wěn)定，隨即轉(zhuǎn)化為Mb(IV)＝O。本研究結(jié)果表明ROO·可以促進(jìn)肌紅蛋白的自動(dòng)氧化和MetMb的生成（圖1）。因此，隨著AAPH濃度增大，·Mb(IV)＝O/Mb(IV)＝O前體物質(zhì)含量逐漸升高，這可能是本研究中AAPH處理樣品中Mb(IV)＝O濃度顯著增加的主要原因。

2.2 ROO·對肌漿蛋白羰基和總巰基含量的影響

不同濃度AAPH處理的兔肉肌漿蛋白羰基含量變化如圖2所示。對照組肌漿蛋白羰基含量為0.94 nmol/mg，這一結(jié)果與Lund等[24]報(bào)道的新鮮豬肉肌漿蛋白中的羰基化合物含量接近。隨著AAPH濃度的增大，肌漿蛋白羰基含量顯著增加（P＜0.05），并呈現(xiàn)出線性增長趨勢。當(dāng)AAPH濃度為5 mmol/L時(shí)，肌漿蛋白羰基含量達(dá)到最大值，為3.29 nmol/mg，該值與Yang Hua等[25]報(bào)道的豬肉貯藏4 d時(shí)肌漿蛋白羰基含量接近。蛋白質(zhì)氧化可以通過自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行。ROO·是親電性自由基，優(yōu)先攻擊蛋白質(zhì)分子中的富電子位點(diǎn)[13]。ROO·可以從蛋白質(zhì)分子中的C—H（或S—H）鍵中提取氫原子[26]，引發(fā)蛋白質(zhì)的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。ROO·直接攻擊敏感氨基酸殘基是引起蛋白質(zhì)羰基化的主要原因。

由圖2可知，對照組肌漿蛋白總巰基含量為104.68 nmol/mg，這一結(jié)果與Li Binbin等[27]報(bào)道的四川香腸肌漿蛋白中的總巰基含量接近。肌漿蛋白中含有多種酶類物質(zhì)，細(xì)胞中的酶類大多具有半胱氨酸殘基[28]，而半胱氨酸是蛋白質(zhì)分子中含有巰基基團(tuán)的主要氨基酸。因此，巰基主要來源于肌漿蛋白中的酶類物質(zhì)。隨著AAPH濃度的增大，肌漿蛋白總巰基含量顯著降低（P＜0.05）。總巰基含量的下降可能與二硫鍵的生成有關(guān)。總巰基含量越低，蛋白質(zhì)氧化越嚴(yán)重。因此，巰基含量的變化說明隨著AAPH濃度的增大，肌漿蛋白氧化程度加劇。這與肌漿蛋白羰基含量變化所反映出的結(jié)論相一致。

圖2 AAPH處理對肌漿蛋白羰基含量和總巰基含量的影響Fig. 2 Changes in carbonyl and total sulphydyl contents of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果

肌漿蛋白是肌漿中的水溶性蛋白，包含糖酵解途徑的大部分酶、肌酸激酶和肌紅蛋白等[29]。由圖3可知，在兔肉肌漿蛋白電泳條帶中主要包括糖原磷酸化酶b、丙酮酸激酶、肌酸激酶、醛縮酶、磷酸甘油醛脫氫酶和肌紅蛋白等。這一結(jié)果與Wang Zhaoming等[30]報(bào)道的兔肉肌漿蛋白SDS-PAGE結(jié)果一致。

圖3 AAPH處理對肌漿蛋白在非還原（A）和還原（B）條件下凝膠電泳圖譜的影響Fig. 3 SDS-PAGE patterns of fresh and AAPH-treated sarcoplasmic proteins in the absence (A) and presence (B) of β-mercaptoethanol

在不含有β-ME的情況下（非還原條件），肌漿蛋白中糖原磷酸化酶b、肌酸激酶和醛縮酶等條帶灰度隨著AAPH濃度的增加逐漸減弱，而在濃縮膠頂部有聚集物生成，并且聚集物條帶灰度隨著AAPH濃度增大逐漸增強(qiáng)（如圖3A中紅框區(qū)域所示），這說明ROO·導(dǎo)致了肌漿蛋白交聯(lián)的生成。在β-ME存在的條件下（還原條件），消失的肌漿蛋白組分復(fù)原，并且伴隨著濃縮膠頂部聚集物消散（如圖3B中紅框區(qū)域所示），表明肌漿蛋白組分主要是通過二硫鍵產(chǎn)生蛋白質(zhì)交聯(lián)。ROO·可以從半胱氨酸的S—H基團(tuán)中提取氫原子并產(chǎn)生硫中心自由基[23]，其可以進(jìn)一步與其他蛋白質(zhì)分子的巰基反應(yīng)以形成二硫鍵交聯(lián)。

2.4 ROO·對肌漿蛋白色氨酸熒光光譜的影響

不同濃度AAPH處理的兔肉肌漿蛋白色氨酸熒光光譜如圖4所示，對照組兔肉肌漿蛋白在334 nm波長處具有最大熒光強(qiáng)度，這與Sun Weizheng等[31]在豬肉肌漿蛋白研究中報(bào)道的結(jié)果一致。這一結(jié)果符合色氨酸殘基在相對疏水的環(huán)境中的典型內(nèi)源熒光特征圖譜。未氧化組肌漿蛋白最大熒光強(qiáng)度為4 538 A.U.，隨著AAPH濃度的增大，肌漿蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，在AAPH濃度為5 mmol/L時(shí)，最大熒光強(qiáng)度減小為3 180 A.U.。蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光強(qiáng)度的下降可以反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。在本研究中，內(nèi)源熒光強(qiáng)度的下降說明了ROO·可以引起肌漿蛋白的去折疊。Chanarat等[32]指出在氧化過程中，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水部分會暴露出來。Wu Wei等[33]認(rèn)為蛋白質(zhì)最大熒光強(qiáng)度的減小是由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致的色氨酸殘基所處微環(huán)境變化引起。此外，在蛋白質(zhì)氨基酸中，色氨酸較為敏感，易于發(fā)生氧化反應(yīng)，并且色氨酸氧化處在蛋白質(zhì)氧化級聯(lián)反應(yīng)的上游。ROO·可以從色氨酸中提取氫生成蛋白質(zhì)自由基[34]。色氨酸的直接氧化也會導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的下降[35]。因此，本研究中ROO·引起熒光強(qiáng)度下降的原因可能包括色氨酸殘基的直接氧化、色氨酸殘基的暴露以及色氨酸殘基微環(huán)境的變化。

圖4 AAPH處理對肌漿蛋白內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響Fig. 4 Changes in fluorescence spectra of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.5 ROO·對肌漿蛋白表面疏水性的影響

不同濃度AAPH處理的兔肉肌漿蛋白表面疏水性如圖5所示。隨著AAPH濃度的增大，肌漿蛋白表面疏水性逐漸增大。通常而言，氧化可以改變蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性等物理性質(zhì)發(fā)生變化[36]。蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊后，內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，繼而引起表面疏水性增大。表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)分子表面的疏水性氨基酸殘基的分布情況[37]。蛋白質(zhì)表面疏水性與蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用密切相關(guān)[9]。蛋白質(zhì)表面疏水性越大，蛋白質(zhì)疏水相互作用越強(qiáng)。綜上，本研究結(jié)果表明ROO·誘導(dǎo)的肌漿蛋白氧化修飾可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用。

圖5 AAPH處理對肌漿蛋白表面疏水性的影響Fig. 5 Changes in surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.6 ROO·對肌漿蛋白粒度的影響

不同濃度AAPH處理的兔肉肌漿蛋白粒度分布如圖6所示，所有肌漿蛋白樣品粒度主要分布在200～2 000 nm之間。未氧化的肌漿蛋白粒度較小，隨著AAPH濃度的增大，肌漿蛋白粒度逐漸增大。Bao Zhijie等[12]報(bào)道了AAPH可以引起卵清蛋白粒度的增大，這與本研究的結(jié)果一致。蛋白質(zhì)粒度可以比較直觀地反映蛋白質(zhì)的聚集。粒度越大，蛋白質(zhì)聚集程度越高。綜上，本研究結(jié)果表明ROO·可以引起肌漿蛋白聚集程度的增大。蛋白質(zhì)粒度的增大是分子間通過二硫鍵和疏水相互作用等作用力產(chǎn)生聚集體引起的[38]。

圖6 AAPH處理對肌漿蛋白粒度的影響Fig. 6 Changes in particle size of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.7 ROO·對肌漿蛋白溶液濁度的影響

不同濃度AAPH處理的兔肉肌漿蛋白濁度變化情況如圖7所示，隨著AAPH濃度的增大，肌漿蛋白濁度呈現(xiàn)不斷增大的趨勢。在AAPH濃度為5 mmol/L時(shí)，肌漿蛋白濁度約為對照組濁度的1.5 倍。蛋白質(zhì)濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度。濁度增大主要是由溶液中聚集體的質(zhì)量和尺寸變化引起的[15]。肌漿蛋白溶液濁度增大說明ROO·可以導(dǎo)致肌漿蛋白溶液中形成較大的蛋白質(zhì)聚集體，這與2.6節(jié)粒度分析得出的結(jié)論一致。Cui Xuhai等[39]報(bào)道了羥自由基可以引起乳清蛋白濁度的增大，這與本研究的結(jié)論類似。結(jié)合前文中總巰基含量變化結(jié)果以及SDS-PAGE的蛋白變化結(jié)果分析，不難發(fā)現(xiàn)，隨著AAPH濃度的升高，通過二硫鍵形成的聚集體數(shù)量逐漸增多，這是本研究中肌漿蛋白聚集體形成的主要原因。

圖7 AAPH處理對肌漿蛋白溶液濁度的影響Fig. 7 Changes in turbidity of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.8 過氧自由基對肌漿蛋白溶解度的影響

不同濃度AAPH處理的兔肉肌漿蛋白溶解度變化如圖8所示，當(dāng)AAPH濃度為0～2 mmol/L時(shí)，肌漿蛋白溶解度變化不顯著（P＞0.05），而當(dāng)AAPH濃度為3～5 mmol/L時(shí)，肌漿蛋白溶解度隨AAPH濃度增大顯著減?。≒＜0.05）。蛋白質(zhì)溶解度下降可能與肌漿蛋白聚集行為引起的不穩(wěn)定性有關(guān)[40]。Berardo等[41]報(bào)道了氧化可以引起肌漿蛋白溶解度的下降。巰基氧化后形成二硫鍵交聯(lián)，這會引起蛋白質(zhì)聚集，繼而導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降[42]。Li Chengliang等[43]報(bào)道了輻照處理可以引起豬肉肌漿蛋白溶解度的降低，并且認(rèn)為這是由氧化修飾后肌漿蛋白的交聯(lián)以及肌漿蛋白無序分子結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)引起的。綜上，本研究中肌漿蛋白聚集體的生成是引起蛋白質(zhì)溶解度下降的主要原因之一。Mohan等[40]指出氨基酸殘基的平均疏水性和電荷頻率是決定蛋白溶解度的兩個(gè)重要因素：平均疏水性越低，電荷頻率越高，蛋白溶解度越高。蛋白質(zhì)溶解度可以反映蛋白質(zhì)變性情況，其從根本上與蛋白質(zhì)的疏水性/親水性平衡有關(guān)。本研究中，ROO·引起肌漿蛋白表面疏水性的增大，這使得肌漿蛋白分子間疏水相互作用增強(qiáng)，從而形成蛋白質(zhì)聚集體，導(dǎo)致溶解度下降。

圖8 AAPH處理對肌漿蛋白溶解度的影響Fig. 8 Changes in solubility of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.9 肌漿蛋白聚集機(jī)制分析結(jié)果

過氧自由基誘導(dǎo)肌漿蛋白聚集機(jī)制如圖9所示。在肌肉組織中，脂質(zhì)誘導(dǎo)氧化體系和肌紅蛋白誘導(dǎo)氧化體系是主要的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成體系。ROO·是脂質(zhì)誘導(dǎo)氧化體系中重要的ROS，可以直接引發(fā)肌漿蛋白的氧化（羰基化、巰基損耗和二硫鍵交聯(lián)）。同時(shí)，ROO·可以促進(jìn)肌紅蛋白的氧化，引起高價(jià)肌紅蛋白（四價(jià)）的積累，Mb(IV)＝O可以從蛋白質(zhì)分子中提取氫原子并引發(fā)蛋白質(zhì)氧化。因此，ROO·不僅可以直接引起肌漿蛋白的氧化，還可以通過影響肌紅蛋白誘導(dǎo)氧化體系來促進(jìn)肌漿蛋白氧化。ROO·直接或通過介導(dǎo)肌紅蛋白誘導(dǎo)氧化體系引發(fā)的蛋白質(zhì)二硫鍵生成是蛋白質(zhì)交聯(lián)的重要作用力。

圖9 過氧自由基誘導(dǎo)肌漿蛋白聚集機(jī)制Fig. 9 Aggregation mechanism of sarcoplasmic proteins induced by lipid peroxyl radicals

巰基與弱二級鍵有關(guān)，有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)[38]。作為蛋白質(zhì)中最為活躍的位點(diǎn)，巰基優(yōu)先受到脂質(zhì)誘導(dǎo)氧化體系和肌紅蛋白誘導(dǎo)氧化體系的ROS攻擊，引起蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化，繼而引發(fā)蛋白質(zhì)的去折疊。伴隨著蛋白質(zhì)的去折疊，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)疏水相互作用增強(qiáng)。疏水相互作用是引發(fā)蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集的另一主要作用力。

事實(shí)上，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化也會影響其巰基的氧化。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的空間位阻效應(yīng)可以阻止ROS進(jìn)入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部攻擊敏感氨基酸殘基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)發(fā)生去折疊時(shí)，位于內(nèi)部的巰基基團(tuán)更容易接觸到自由基，繼而發(fā)生氧化反應(yīng)。此外，在蛋白質(zhì)去折疊過程中，兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基距離接近時(shí)，就可能發(fā)生氧化反應(yīng)，形成二硫鍵交聯(lián)[44]。因此，ROO·引起的肌漿蛋白結(jié)構(gòu)變化不僅可以直接通過疏水相互作用對蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)生影響，還可以通過影響二硫鍵的交聯(lián)對蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)生作用。

除二硫鍵和疏水相互作用外，一些其他的共價(jià)鍵（色氨酸-色氨酸、酪氨酸-酪氨酸、色氨酸-酪氨酸）也是引起蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集的重要作用力。但在本研究中，SDS-PAGE結(jié)果比較直觀地反映出這些共價(jià)鍵并未參與肌漿蛋白的交聯(lián)聚集。由此可知，二硫鍵交聯(lián)和疏水相互作用是引發(fā)肌漿蛋白交聯(lián)聚集的主要作用力。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用AAPH的熱分解作用生成ROO·，研究了ROO·脅迫兔肉肌漿蛋白氧化聚集機(jī)制。作為脂質(zhì)誘導(dǎo)氧化體系的重要自由基物質(zhì)，ROO·可以直接引起肌漿蛋白的氧化修飾。此外，ROO·也可以通過影響肌紅蛋白誘導(dǎo)氧化體系引發(fā)Mb(IV)＝O等ROS的積累。ROO·的直接作用和間接作用（影響肌紅蛋白誘導(dǎo)氧化體系）共同導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基化、巰基損失和蛋白質(zhì)二硫鍵交聯(lián)生成，同時(shí)還可以引起肌漿蛋白的去折疊和疏水基團(tuán)的暴露。蛋白質(zhì)二硫鍵交聯(lián)和疏水相互作用是引起肌漿蛋白聚集的主要作用力。