蛋白質組學揭示灘羊宰后成熟過程中風味前體物質的變化機理

尤麗琴，姬 琛，羅瑞明

（寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

灘羊是寧夏優(yōu)勢特色畜種，因其肉質細嫩鮮美、營養(yǎng)豐富和風味獨特而聞名。宰后肌肉成熟過程中主要發(fā)生的變化為細胞代謝和內源性蛋白酶對結構蛋白的降解[1]。宰后肉成熟過程中肌內的生化反應使肉中蛋白質降解生成的氨基酸以及小分子肽類等風味前體物質在加熱時產生一系列風味物質。因此，宰后成熟不僅改善了肉的嫩度，還對肉的風味產生影響，提高了肉的食用品質。

肉的生產和加工過程會引起肌肉生物化學、蛋白質豐度和結構的變化[2]。蛋白質組學是研究一定細胞、組織、體液、器官或有機體所表達的全部蛋白質的科學[3]。同位素標記相對和絕對定量技術（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）是目前用于蛋白質定量分析的有效技術，它具有較好的準確性和可重復性，允許同時對8 個樣品中的蛋白質進行相對定量分析，其與最高分辨率的多維液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術結合，可實現對低豐度蛋白的定量定性分析。從生物學方面分析，轉錄和翻譯后修飾作用對蛋白質的表達具有調控作用，mRNA轉錄水平反映了其基因表達的中間狀態(tài)和相應蛋白質的表達情況[4]。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）技術應用范圍較廣，且能夠對不同物種的mRNA表達水平進行有效的分析。宰后肉在成熟過程中包含復雜且相互依賴的生化機制，從而對肉的質地、風味和嫩度產生影響，為明確這一作用機制，可從蛋白質組學角度出發(fā)研究肉的成熟過程[5]，從而探索成熟過程中肉品風味特性變化規(guī)律。

目前宰后肉的蛋白質組學分析多集中在宰后肉色澤、持水性能和嫩度的研究[6-12]，而宰后成熟肉中肌原纖維蛋白降解產生風味前體物質及其結構完整性對風味形成的影響機制還未明確。因此，本研究以灘羊背最長肌為研究對象，采用iTRAQ以及多維LC-MS/MS技術，研究宰后肉不同成熟期的差異表達蛋白，確定灘羊肉成熟前后蛋白質的表達變化情況，同時采用qPCR技術對宰后灘羊肉中差異蛋白質基因表達水平進行檢測，從mRNA轉錄水平分析差異表達蛋白基因表達情況，并分析差異表達蛋白在mRNA轉錄水平與蛋白水平表達之間存在的關系，初步探討宰后灘羊肉成熟過程中風味前體物質的變化機理及其調控，為進一步研究灘羊肉宰后的代謝生化反應提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長肌 寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、IPG buffer、甲酸美國GE公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羧基氨基甲烷、三氯乙酸、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國Amresco公司；三乙二胺碳酸鹽和考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司；胰蛋白酶美國Promega公司；乙腈和Nuclease-free H2O 美國Thermo公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）預混液、ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Sciex Triple TOF 5600質譜儀、Eksigent nanoLC-1D液相色譜系統(tǒng)（配有Analyst TF 1.1數據處理軟件） 美國SCIEX公司；5910R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Image Scanner III掃描儀 美國GE公司；真空冷凍干燥機、NanoDrop 2000分光光度計 美國Thermo Fisher公司；VCX130超聲波細胞粉碎機 美國Sonics公司；Mini PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；LightCycler?480 II型qPCR儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集成熟條件為溫度4 ℃、相對濕度80%的灘羊背最長肌200 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時間點為0、4 d和8 d，每組樣本做3 個平行。

1.3.2 蛋白質組學分析

結合李子欣等[13]的方法提取灘羊肉中總蛋白，采用BCA法定量蛋白，繪制標準曲線（y＝0.838 5x＋0.008 8，R2＝0.997 8），并通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）檢測蛋白質量。其余樣品置于－80 ℃冰箱備用。灘羊肉中蛋白iTRAQ分析委托上海鹿明生物科技有限公司進行，運用Analyst TF 1.1軟件獲得基于iTRAQ分析的蛋白質組學數據。蛋白質的定性及定量信息采用Protein pilot 4.0軟件獲得。檢索的數據庫為綿羊數據庫，數據庫來源為Uniprot。所有導出的蛋白質可信度水平均高于95%（Unused score≥1.3且peptide≥1）。數據進行歸一化處理后，以“差異倍數（fold change，FC）＞1.2或FC＜0.8”和“P＜0.05”為標準篩選差異表達蛋白。

1.3.3 差異表達蛋白基因表達分析

1.3.3.1 RNA提取

灘羊肉中總RNA的提取采用mirVanaTMRNA Isolation Kit說明書進行操作，使用NanoDrop 2000分光光度計確定RNA的純度，并使用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠進行電泳以評估RNA完整性，將所得到的RNA置于－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 反轉錄

利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（＋gDNA wiper）將待測RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系：總RNA 0.5 μg、4×gDNA wiper Mix 2 μL，加Nucleasefree H2O至8 μL，42 ℃保溫2 min去除基因組DNA，然后加5×HiScript II Q RT SuperMix II 2 μL。反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉錄完畢后加入90 μL Nuclease-free H2O儲存在－20 ℃冰箱備用。

1.3.3.3 qPCR分析

反應體系參照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書要求：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、cDNA 1 μL、Nuclease-free H2O 3.6 μL。采用LightCycler?480 II型qPCR儀進行擴增，PCR程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，45 個循環(huán)。循環(huán)結束后利用熔解曲線檢測產物特異性：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃，每升高1 ℃采集5 次熒光信號。每個樣品一式三份進行分析。引物基于美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫獲得的mRNA序列設計并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，如表1所示。以GAPDH為內參，使用2－ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

表1 qPCR引物序列Table1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010軟件處理數據。使用Origin 2020 b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 宰后灘羊肉蛋白提取與質量檢測結果

宰后灘羊肉蛋白進行提取后，采用SDS-PAGE對宰后不同成熟期灘羊肉蛋白樣品進行質量檢測，結果如圖1所示。灘羊成熟0 d時的3 個生物學重復（0 d-1、0 d-2和0 d-3）、成熟4 d時的3 個生物學重復（4 d-1、4 d-2和4 d-3）和成熟8 d時的3 個生物學重復（8 d-1、8 d-2和8 d-3）條帶均清晰度好，且完整均一，表明本次提取的蛋白質量較好，可滿足后期iTRAQ技術分析要求。

圖1 宰后灘羊肉成熟過程中總蛋白SDS-PAGE檢測結果Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis pattern of total proteins in Tan sheep meat during post-mortem ageing

2.2 差異表達蛋白的篩選及豐度的變化

2.2.1 差異表達蛋白的篩選結果

通過iTRAQ結合LC-MS/MS檢測宰后不同成熟期灘羊肉中差異蛋白質的表達變化，采用Protein pilot 4.0軟件檢索蛋白質數據，進一步篩選可信度水平在95%以上（Unused score≥1.3）且至少包含一個Unique肽段的蛋白為可信蛋白，多組重復以均能鑒定到可信蛋白為基本條件，共定性、定量鑒定出814 個可信蛋白。在鑒定出可信蛋白的基礎上，分別以“FC＞1.2或FC＜0.8”且“P＜0.05”作為宰后灘羊肉成熟時差異表達蛋白的篩選條件，共得到474 個差異表達蛋白。圖2為差異表達蛋白火山圖，能夠體現宰后灘羊肉不同成熟期差異表達蛋白的顯著性。由圖2A可知，宰后成熟0 d組和4 d組對比，差異表達蛋白159 個，其中4 d組與0 d組相比上調蛋白151 個，下調蛋白8 個；由圖2B可知，宰后成熟4 d組和8 d組對比，差異表達蛋白151 個，其中8 d組與4 d組相比上調蛋白35 個，下調蛋白116 個；由圖2C可知，宰后成熟0 d組和8 d組對比，差異表達蛋白164 個，其中8 d組與0 d組相比上調蛋白67 個，下調蛋白97 個。

圖2 宰后灘羊肉成熟過程中差異表達蛋白火山圖Fig. 2 Volcano plots of differentially expressed proteins in Tan sheep meat during post-mortem ageing

由此可知，宰后成熟0～4 d時，灘羊肉中上調蛋白質處于優(yōu)勢狀態(tài)，數量較多，說明成熟4 d前宰后灘羊肉肌細胞尚未徹底凋亡，細胞內代謝活動尚在進行，并且代謝活性大于蛋白質降解程度。而宰后成熟4～8 d時，灘羊肉中下調蛋白數量較多，上調蛋白質數量減少，說明此階段蛋白質降解程度明顯。宰后成熟0～8 d時，灘羊肉中差異表達蛋白的數量呈增加趨勢，說明成熟對灘羊肉蛋白質變化的影響較大。

2.2.2 差異表達蛋白豐度的變化

基于宰后灘羊肉成熟過程中鑒定出差異表達蛋白的定量數據，根據“FC＞1.2或FC＜0.8”和“P＜0.05”的篩選標準，在成熟期0、4 d和8 d中兩兩對比的基礎上，共篩選出了262 個與風味相關的差異表達蛋白，其中0 d和4 d對比組有131 個差異表達蛋白，0 d和8 d對比組有133 個差異表達蛋白，4 d和8 d對比組有125 個差異表達蛋白。韋恩圖顯示了宰后灘羊肉成熟過程中差異表達蛋白的數量分布和差異，其中0 d和4 d對比組與4 d和8 d對比組共有的差異表達蛋白71 個，0 d和4 d對比組與0 d和8 d對比組共有的差異表達蛋白79 個，0 d和8 d對比組與4 d和8 d對比組共有的差異表達蛋白83 個，而0 d和4 d對比組、4 d和8 d對比組及0 d和8 d對比組3 組共有的差異表達蛋白46 個（圖3）。表2中列出了宰后成熟過程中灘羊肉中46 個共有差異表達蛋白的具體信息。

表2 宰后灘羊肉成熟過程中共有的差異表達蛋白Table2 Shared differentially expressed proteins in Tan sheep meat during post-mortem ageing

續(xù)表2

宰后灘羊肉成熟過程中與風味調控相關的差異表達蛋白主要集中在代謝酶、結構蛋白和應激蛋白等。宰后灘羊肉不同成熟期共有的差異表達蛋白中代謝酶和結構蛋白的種類較多且含量變化較明顯，其中代謝酶15 種、結構蛋白16 種、應激蛋白3 種。肉風味的變化主要取決于宰后肉中肌原纖維結構完整性和結構蛋白降解程度的相互關系。本研究主要從宰后代謝酶調控、結構蛋白降解和應激蛋白的防護和抵御等方面來分析宰后灘羊肉成熟過程中影響風味前體物質形成的機制。

宰后肌肉代謝是影響肉品質的關鍵因素之一[14]。糖酵解直接影響宰后肉能量代謝，進而影響肉中風味前體物質的產生[15]。本研究發(fā)現參與糖酵解代謝的酶中，磷酸葡萄糖變位酶1、6-磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛縮酶、3-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、烯醇酶3、L-乳酸脫氫酶和丙酮酸激酶在宰后灘羊肉成熟0～4 d時的表達上調，而在成熟4～8 d時絕大部分代謝酶表達下調。這是因為畜禽被屠宰時，肌纖維處于低氧缺血狀態(tài)，使肌肉中腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）活性提高，宰后的肌肉能量代謝轉為無氧降解，在缺氧應激的狀態(tài)下，活化的AMPK能夠激活提高糖酵解關鍵酶己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性磷酸化酶激酶[16-18]，加強糖原分解。因此，宰后灘羊肉在成熟前期糖酵解途徑被調節(jié)，參與灘羊肉宰后成熟的糖酵解酶在成熟0～4 d時表達上調。隨著成熟的進行，由于無氧降解產生乳酸及ATP分解產生磷酸根離子使pH值降低，參與糖酵解的這些酶受到抑制或失活，檢測到灘羊肉中糖酵解酶在成熟4～8 d表達下調。Ross等[19]研究宰后豬肉發(fā)現，前期豬肉磷酸化水平較高，導致pH值下降速率較快，而且經磷酸化修飾的丙酮酸激酶和磷酸丙糖異構酶與宰后肉pH值下降有關。趙巧靈[4]研究發(fā)現金槍魚冷藏過程中代謝酶中磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油激酶、丙酮酸激酶和磷酸丙糖異構酶表達量變化明顯，且這些酶在糖酵解途徑中起調控作用。以上研究結果與本研究一致。綜上，宰后糖酵解酶的活性是影響宰后肉pH值下降速率的主要因素，其影響宰后肉僵直的進程，并對肉中整體風味的形成具有決定性作用。

宰后肉成熟過程中，由于肌原纖維和細胞結構蛋白的降解，肌肉結構變得更松散，離子和蛋白質之間的相互作用改變，內部毛細管空間增加[20]。因此，宰后肌原纖維蛋白的水解及肌原纖維結構的解離使肉的持水性、色澤和風味等都可能受到影響。結構蛋白與構成細胞和生物體有關，是宰后肌肉收縮、能量代謝的基礎[21]。肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白等都與肌肉收縮有關，結構蛋白直接影響宰后肉品質，如嫩度、保水性和肉色等[22]。肌動蛋白是參與肌肉收縮的蛋白，在肉制品加工過程中與肉品質的黏結性和質構都有密切關系[23]。本研究發(fā)現，宰后灘羊肉成熟0～4 d時，僅肌動蛋白α1、肌動蛋白（細胞質1）和角蛋白1表達量呈明顯下降趨勢。說明此階段肉中肌原纖維蛋白整體降解不明顯，肌原纖維結構相對完整，一定程度上，肌原纖維的結構完整性和降解程度反映了肌肉的成熟度，因此，宰后成熟4 d時灘羊肉的成熟過程尚未完成，風味物質還需進一步降解產生。肌鈣蛋白由T、C、I 3 個亞基構成，和原肌球蛋白一起通過調節(jié)鈣離子對橫紋肌動蛋白ATP酶的活性從而調節(jié)肌動蛋白和肌動球蛋白相互作用[24]。灘羊肉中肌鈣蛋白C1、肌鈣蛋白C2和肌鈣蛋白T3在宰后成熟0～4 d時表達量上調，說明在此階段肌鈣蛋白活性較高，肌動蛋白和肌動球蛋白的相互作用被調節(jié)，使肌原纖維收縮增強，此時水分由于肌原纖維收縮被擠出，肌肉表面呈現多汁狀態(tài)，風味物質在此階段也會隨著汁液的浸出而流出。肌球蛋白輕鏈是肌動球蛋白復合物的組成部分，在肌肉的結構保持和肌肉收縮過程中起重要的作用。宰后灘羊肉成熟0～4 d時，肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和肌球蛋白輕鏈6的表達量上調，說明肌原纖維蛋白在宰后成熟4 d時已逐漸發(fā)生降解，這是內源酶的作用使肌動球蛋白橫橋發(fā)生斷裂所致[25]。Marino等[21]研究了3 種不同品種牛肉成熟過程中肉質形狀和肌漿蛋白的變化，發(fā)現成熟過程中肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白T和原肌球蛋白的含量增加，說明肌纖維降解和蛋白水解隨成熟進行逐漸加劇。宰后灘羊肉成熟4～8 d時肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和原肌球蛋白3表達量下調，說明此階段肌原纖維蛋白降解較明顯，結構蛋白在保護細胞完整性中起到較重要的作用。宰后肌原纖維蛋白表達量的變化說明成熟對肌肉結構完整性和收縮能力的影響較大，肌原纖維蛋白水解可使蛋白質降解為呈味氨基酸和肽類。綜上，肌原纖維蛋白不僅能降解產生風味前體物質，還能通過風味前體物質之間的相互作用影響風味的感知，提升肉的風味水平。

另外，蛋白質如伴肌動蛋白和肌鈣蛋白T的降解會破壞肌原纖維的完整性，但同時也會產生味覺氨基酸和肽類[26]。隨著成熟的進行，宰后灘羊肉成熟4～8 d時肌鈣蛋白C1、肌鈣蛋白T3、肌球蛋白輕鏈1、肌球蛋白輕鏈2和原肌球蛋白3等蛋白表達量均下降，說明肌原纖維蛋白降解程度較明顯。Kemp等[27]發(fā)現宰后成熟肉中組織蛋白酶水解數量最多的肌原纖維蛋白主要包括肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白C、伴肌動蛋白、肌聯蛋白和原肌球蛋白。宰后肌肉中的肌原纖維蛋白是肉中味覺活性成分的豐富來源，有研究發(fā)現肌原纖維蛋白能夠提供8 133 種味覺氨基酸[28]。在肌原纖維蛋白中，味覺活性氨基酸和肽中含量較高的是肌鈣蛋白C（骨骼?。兄诟兄? 種基本味覺[26]。宰后灘羊肉成熟4～8 d時肌鈣蛋白C1和肌鈣蛋白T3的降解使肉中的味覺活性氨基酸和呈味肽含量增加，此階段灘羊肉中滋味屬性特點較明顯，味感豐富。此外，盧昊[3]的研究表明延邊牛宰后肌鈣蛋白降解程度與肉的嫩度有關。綜上，宰后灘羊肉成熟4～8 d時，肌原纖維蛋白降解產生風味物質，使呈味物質較豐富，同時由于此階段肌原纖維結構的完整性被破壞使風味前體物質更好地釋放。

應激蛋白可防止肌細胞凋亡引起的蛋白質結構損傷和降解，并保護肌動蛋白和其他細胞骨架蛋白免受應激作用所引起的肽鏈斷裂[29]。熱休克蛋白70是ATP依賴性伴侶蛋白，它可以使部分變性蛋白聚集以及使蛋白折疊，從而保護細胞氧化應激[30]。熱休克蛋白70可以直接參與代謝，本研究發(fā)現宰后灘羊肉成熟0～4 d時，應激蛋白中熱休克蛋白70表達量上調，而成熟4～8 d時，熱休克蛋白70表達量下調。灘羊肉成熟過程中，熱休克蛋白70表達量的升高，說明成熟0～4 d時熱休克蛋白70可能參與保護肌原纖維結構完整性的作用，而成熟4～8 d時熱休克蛋白70表達量的下降說明此階段開始降解，這也體現出肌原纖維蛋白穩(wěn)定性的降解變化動態(tài)。另外，Bjarnado等[31]研究發(fā)現熱休克蛋白70的表達量與嫩度有直接關系。綜上，宰后灘羊肉成熟0～4 d時應激蛋白的變化保護細胞骨架蛋白的完整性，使肌原纖原纖維結構在此階段相對穩(wěn)定，這也與結構蛋白的變化結果相吻合。

2.3 差異表達蛋白基因表達分析結果

2.3.1 差異表達蛋白基因相對表達量的變化

篩選與關鍵風味代謝物調控作用相關的差異表達蛋白，結合前期對灘羊肉風味形成中重要蛋白質研究的基礎[13]，選取包含代謝酶、結構蛋白和應激蛋白在內的共8 個差異表達蛋白，分別為糖原磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖異構酶、L-乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、肌球蛋白輕鏈2、肌動蛋白α1和熱休克蛋白70。采用qPCR對以上篩選出的差異表達蛋白在mRNA水平上進行轉錄水平驗證，研究不同成熟期灘羊肉差異表達蛋白在mRNA轉錄水平的變化，分析各蛋白質基因相對表達量及其變化規(guī)律。

采用qPCR檢測宰后灘羊肉成熟過程中8 種目標差異表達蛋白在mRNA轉錄水平上的變化，如圖4所示，宰后成熟0～4 d時，6-磷酸葡萄糖異構酶、L-乳酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、肌球蛋白輕鏈2和熱休克蛋白70在mRNA轉錄水平上呈上調趨勢，而糖原磷酸化酶、丙酮酸激酶和肌動蛋白α1在mRNA轉錄水平上呈下調趨勢。而宰后成熟4～8 d時，糖原磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖異構酶、肌動蛋白α1和熱休克蛋白70在mRNA轉錄水平上呈上調趨勢，而L-乳酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶和肌球蛋白輕鏈2呈下調趨勢。對比整個成熟過程，各目標差異表達蛋白mRNA轉錄水平不同，L-乳酸脫氫酶在成熟0～4 d時上調較明顯，而丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶和肌球蛋白輕鏈2在成熟8 d時下調較明顯，且?guī)缀踅咏?，這說明灘羊肉隨著成熟的進行，差異表達蛋白的mRNA豐度在不同成熟階段不同。

圖4 目標差異表達蛋白基因轉錄的qPCR分析Fig. 4 qPCR analysis of the mRNA expression levels of target differentially expressed proteins

2.3.2 差異表達蛋白在蛋白水平和mRNA轉錄水平的比較

為了進一步分析宰后成熟過程中灘羊肉中蛋白質的變化機理，在不同成熟期分別對比與風味相關差異表達蛋白的iTRAQ和qPCR結果，探討風味相關差異表達蛋白在蛋白水平和mRNA轉錄水平的變化情況，結果如表3所示。

表3 風味相關差異表達蛋白的iTRAQ和qPCR結果比較Table3 Comparison of results from iTRAQ and qPCR for flavorrelated differentially expressed proteins

差異表達蛋白在轉錄和翻譯后修飾作用的調節(jié)下導致表達水平不同，從生物學角度分析，mRNA轉錄水平反映了基因表達的中間狀態(tài)，同時也反映了潛在的蛋白水平表達情況[32]。qPCR因檢測靈敏度高、檢測范圍廣、檢測結果重復性好的特點而被廣泛應用。差異表達蛋白基因相對表達量的分析是針對蛋白質組學分析的補充，在獲得基因表達情況的同時，也可以得知兩者之間的聯系，差異表達蛋白在蛋白水平和mRNA轉錄水平的研究相互補充和驗證，可為宰后灘羊肉中生物代謝變化和調控機制提供新的思路。

由表3可知，灘羊肉成熟過程中差異表達蛋白中有4 個差異表達蛋白在0～4 d和4～8 d時蛋白水平和mRNA轉錄水平的表達模式一致，分別為2 個代謝酶（L-乳酸脫氫酶和磷酸丙糖異構酶）和2 個結構蛋白（肌球蛋白輕鏈2和肌動蛋白α1），其余差異表達蛋白在兩種水平表達模式不一致，可能是由于宰后成熟過程灘羊肉中蛋白質的降解不但來自自身內源酶的作用，還可能受到外界酶的影響，從而改變了轉錄效率或轉錄后降解的速率[3]，在外界酶的調控下抑制或促進了相關蛋白質的翻譯，從而使兩種表達水平結果不一致。另外，本研究中差異表達蛋白如6-磷酸葡萄糖異構酶和熱休克蛋白70在4～8 d時mRNA轉錄水平上呈現上調趨勢，而在蛋白水平上呈現下調趨勢，這可能是由于翻譯后修飾或在激活因子的作用下，這兩種蛋白質的活性狀態(tài)發(fā)生改變或失活，導致mRNA轉錄水平上調而蛋白水平下降。

3 結 論

本實驗采用iTRAQ技術對宰后灘羊肉不同成熟期的蛋白質組學進行分析，與風味相關的差異表達蛋白主要分為代謝酶類、結構蛋白和應激蛋白。灘羊肉不同成熟期差異表達蛋白存在不同程度的變化，灘羊肉中酶的活性在宰后成熟前期被激活且在風味前體物質變化中期發(fā)揮主要調控作用，結構蛋白在宰后成熟后期降解較明顯，而應激蛋白在成熟前期肌原纖維結構的穩(wěn)定性中起保護作用，隨著成熟的進行逐漸降解或部分失活。采用qPCR對灘羊不同成熟期背最長肌的蛋白質組學分析進行了后續(xù)補充分析，使宰后成熟過程中灘羊肉中差異蛋白表達情況在mRNA轉錄水平上得到了有效驗證。