廣譜抗生素療程對(duì)極低出生體重兒糞便腸道菌群和短鏈脂肪酸影響的前瞻性研究

孫倩 王政力 劉曉晨 季艷春 賀雨 艾青 李祿全

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心/兒童健康與疾病國家臨床研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地/重慶市兒科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014）

人類腸道與共生微生物之間的相互作用可能是人體中最多樣化的，其中細(xì)菌占較大比例。不同種類的細(xì)菌在宿主免疫系統(tǒng)成熟、腸道屏障功能和人類疾病中起著關(guān)鍵作用［1-2］。相較于正常出生體重兒，低出生體重兒腸道菌群的組成豐富度和多樣性降低［3］。研究表明經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素會(huì)增加早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、壞死性小腸結(jié)腸炎［4］、晚發(fā)型敗血癥的發(fā)病率；同時(shí)影響遠(yuǎn)期預(yù)后，如生長障礙、肥胖、過敏和自身免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加［5］。

一方面，抗生素的使用會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失衡和多樣性減少，缺乏有益的雙歧桿菌屬和狹窄梭菌屬1［6］，同時(shí)機(jī)會(huì)致病菌腸桿菌科、腸球菌和葡萄球菌增加［7］。另一方面，抗生素的使用會(huì)影響腸道菌群代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）含量。SCFAs與多種疾病狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如炎癥性腸病、1型糖尿病和非酒精性脂肪肝等［8］。

目前針對(duì)極低出生體重兒（very low birth weight infant，VLBWI）的相關(guān)研究，大多著眼于抗生素干預(yù)對(duì)腸道菌群的影響，研究結(jié)果顯示抗生素治療會(huì)降低腸道菌群的多樣性并且增加有害菌［9］。Arboleya等［10］探討了抗生素療程后菌群及3種SCFAs含量的改變，本研究擬進(jìn)一步探討廣譜抗生素療程對(duì)VLBWI腸道細(xì)菌群落及大部分SCFAs的影響，并分析菌群與SCFAs之間的關(guān)聯(lián)。為合理使用廣譜抗生素提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步研究提供切入點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

前瞻性選取2020年6～12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心收治的29例VLBWI為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒出生24 h內(nèi)直接入住我科者；（2）胎齡<30周且出生體重<1 500 g者；（3）入院后因伴有感染、早產(chǎn)、母孕期高危因素并入住新生兒重癥監(jiān)護(hù)室，使用廣譜抗生素治療者。所有納入對(duì)象根據(jù)血培養(yǎng)結(jié)果決定是否停用抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）住院期間死亡和放棄治療者；（2）合并先天性消化道畸形（如先天性腸閉鎖、先天性巨結(jié)腸、腸旋轉(zhuǎn)不良等）；（3）未完成腸道菌群、SCFAs測(cè)定者；（4）不愿參加本研究者。

本研究已經(jīng)獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.2021-18）。參與這項(xiàng)試驗(yàn)新生兒的父母已經(jīng)簽署知情同意書。

1.2 分組

按抗生素療程分為≤7 d組［出生后經(jīng)驗(yàn)性使用了青霉素+頭孢菌素類藥物（總使用時(shí)間≤7 d）］和>7 d組［根據(jù)病情所需要，聯(lián)用了青霉素+頭孢菌素，或糖肽/碳青霉烯類藥物（總使用時(shí)間>7 d但≤28 d）］。本研究?jī)山M使用的抗生素均為廣譜抗生素，均為殺菌劑。

1.3 標(biāo)本采集

采用專用一次性糞便收集管收集兩組患兒住院后第14天和第28天糞便標(biāo)本；立刻分裝，-80℃保存，備檢。早產(chǎn)兒腸道菌群具有多樣性低和穩(wěn)定性差的特點(diǎn)，抗生素的治療及療程持續(xù)時(shí)間對(duì)腸道菌群有影響［9］。為給予抗生素反應(yīng)時(shí)間以獲得較穩(wěn)定的菌群及代謝結(jié)果，本研究?jī)H在VLBWI第2周齡和第4周齡檢測(cè)了糞便菌群和SCFAs。

1.4 糞便樣本微生物群分析

使用QIAamp快速DNA糞便試劑盒（Qiagen，德國），按照制造商的說明書提取儲(chǔ)存的糞便標(biāo)本的微生物基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA提取液。16S rDNA基因的V3+V4區(qū)域用指定引物放大。擴(kuò)增過程：變性（95°C下3 min，95°C下30 s）、退火（55°C下30 s）、延伸（72°C下45 s）持續(xù)27個(gè)循環(huán)和額外延伸（72°C下10 min）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences）進(jìn)行回收，并使用Quantus?熒光儀（Promega，USA）進(jìn)行定量。在Illumina MiSeq相關(guān)平臺(tái)上建立數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行測(cè)序。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)<20的堿基和長度為>10 bp的重疊序列刪除。在拼接序列的重疊區(qū)域，刪除超過最大錯(cuò)配率0.2的讀數(shù)。利用Uparse（7.1版）將處理后的序列劃分為操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），以97%的相似性閾值與OTU進(jìn)行生物信息學(xué)聚類分析，對(duì)菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行Alpha多樣性分析（腸道菌群中物種的豐富度、多樣性分別用Chao指數(shù)值和Shannon指數(shù)值來體現(xiàn)，其中Chao指數(shù)值與菌群豐富度成正比，Shannon指數(shù)值與菌群多樣性成正比［11］）和群落組成分析。

1.5 糞便樣本短鏈脂肪酸分析

取100 mg糞便樣本至2 mL研磨管中，加入研磨珠，加入900μL甲醇和100μL的內(nèi)標(biāo)（甲醇配制的1 000μg/mL的2-乙基丁酸），冷凍研磨儀50 Hz研磨3 min，2次。冰水浴30 min，-20℃靜置30 min，13 000 g（4℃）離心15 min。將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。加入50 mg無水硫酸鈉，渦旋，13 000 g（4℃）離心15 min。取上清液運(yùn)用安捷倫公司（Agilent Technologies Inc.CA，USA）的8890B-5977B GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)。最后用Masshunter定量軟件（美國Agilent公司，版本號(hào)：v10.0.707.0）對(duì)目標(biāo)SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸）進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和集成。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的SCFAs含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法。采用Spearman秩相關(guān)分析變量之間的相關(guān)性。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

2020年6～12月本中心共收治60例VLBWI，其中住院期間死亡和放棄治療者7例，先天性消化道畸形9例，未完成腸道菌群和SCFAs測(cè)定者5例，不愿參加本研究者10例，最終共納入29例VLBWI?？股丿煶獭? d組（n=9）和>7 d組（n=20）成功入組，所有入組患兒均母乳喂養(yǎng)。兩組VLBWI性別、胎齡、出生體重、入院年齡、住院時(shí)間、出生方式、胎膜早破、羊水污染、宮內(nèi)窘迫、Apgar評(píng)分、喂養(yǎng)方式、中心靜脈置管持續(xù)時(shí)間，以及喂養(yǎng)不耐受、壞死性小腸結(jié)腸炎、新生兒敗血癥、化膿性腦膜炎發(fā)生率等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組不同抗生素療程VLBWI臨床指標(biāo)對(duì)比

2.2 菌群?jiǎn)螛颖続lpha多樣性分析

≤7 d組第4周和第2周相比，Chao指數(shù)顯著降低（P<0.05），Shannon指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。>7 d組第4周和第2周相比，Chao指數(shù)顯著降低（P<0.05），Shannon指數(shù)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第2周時(shí)，>7 d組和≤7 d組相比，Shannon指數(shù)變化差異無統(tǒng)計(jì)意義（t=1.12，P=0.285），Chao指數(shù)的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.50，P=0.643）。第4周時(shí)，>7 d組和≤7 d組相比，Shannon指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.09，P=0.284），Chao指數(shù)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.80，P=0.444）。見表2。

表2 兩組不同抗生素療程VLBWI糞便的菌群Alpha多樣性分析

2.3 菌群組成分析

組內(nèi)比較：≤7 d組第4周與第2周的菌群相比，在屬水平上，狹窄梭菌屬1顯著升高（P=0.035），而不動(dòng)桿菌屬顯著降低（P=0.035）；在門水平上，厚壁菌門顯著升高（P=0.022），而變形菌門顯著降低（P=0.022）。見圖1。

圖1 抗生素療程≤7 d組生后第2周和第4周菌群差異分析

組間比較：第4周時(shí)，在屬水平上，>7 d組的狹窄梭菌屬1較≤7 d組顯著降低（P=0.021）；在門水平上，>7 d組的厚壁菌門較≤7 d組顯著降低（P=0.008），而變形菌門顯著升高（P=0.010）。見圖2。

圖2 抗生素療程≤7 d組和>7 d組生后第4周的菌群差異分析

2.4 SCFAs測(cè)定

≤7 d組第4周與第2周相比，總SCFAs、丙酸、丁酸、戊酸含量顯著升高（P<0.05）。>7 d組第4周與第2周相比，總SCFAs、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸含量顯著升高（P<0.05）。見表3。

第4周時(shí)，>7 d組異丁酸（Z=-2.357，P=0.018）和戊酸（Z=-2.121，P=0.034）含量較≤7 d組顯著下降；>7 d組丙酸（Z=-0.707，P=0.501）、丁酸（Z=-1.839，P=0.069）、異戊酸（Z=-1.084，P=0.295）、己酸（Z=-0.990，P=0.340）和異己酸（Z=-0.283，P=0.799）含量與≤7 d組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 兩組不同抗生素療程VLBWI糞便的SCFAs含量分析［M（P25，P75），μg/g］

2.5 菌群與糞便樣本SCFAs相關(guān)性分析

根據(jù)Spearman相關(guān)性熱圖分析，方法與Su等［12］和Tsukuda等［13］一致。在門水平上，厚壁菌門與丁酸含量呈顯著正相關(guān)（rs=0.36，P=0.012），變形菌門與丁酸（rs=-0.44，P=0.0017）和異丁酸（rs=-0.42，P=0.0025）含量呈顯著負(fù)相關(guān)；在屬水平上，狹窄梭菌屬1與異丁酸（rs=0.29，P=0.045）、丁酸（rs=0.57，P=0.00002）和戊酸（rs=0.41，P=0.0037）含量均呈顯著正相關(guān)。這提示SCFAs含量與腸道中某些類別菌的比例相關(guān)。見圖3。

圖3 腸道菌群與SCFAs的相關(guān)性

3 討論

抗生素的經(jīng)驗(yàn)性使用在VLBWI中較常見，抗生素的使用對(duì)腸道菌群有顯著影響［10］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)廣譜抗生素療程可能會(huì)對(duì)VLBWI腸道細(xì)菌群落的豐富度、定植和演化，以及其代謝產(chǎn)物SCFAs的含量產(chǎn)生較大影響。

本研究發(fā)現(xiàn)抗生素療程≤7 d組第4周和第2周比較，Chao指數(shù)顯著降低；>7 d組，第4周和第2周比較，Chao指數(shù)也顯著降低。這提示抗生素療程治療后均可導(dǎo)致VLBWI的菌群豐富度顯著降低?？股丿煶?7 d組較≤7 d組Chao指數(shù)降低更明顯，進(jìn)一步提示抗生素療程越長，菌群豐富度越顯著降低。有研究發(fā)現(xiàn)抗生素治療后會(huì)降低早產(chǎn)兒腸道菌群多樣性［9，14］。本研究中，抗生素療程≤7 d組第4周和第2周相比，Shannon指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)>7 d組，第4周和第2周相比，Shannon指數(shù)差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示抗生素療程治療后對(duì)VLBWI的菌群多樣性無明顯影響。本研究與其他研究結(jié)論存在差異的原因可能與本研究樣本量小有關(guān)。

通常隨著日齡的增長，早產(chǎn)兒厚壁菌門的比例增加而變形菌門的比例降低［9］。在本研究中，抗生素療程≤7 d組第4周與第2周的菌群相比，厚壁菌門顯著增加而變形菌門顯著降低。這提示≤7 d抗生素療程治療對(duì)腸道菌群的構(gòu)成和演化影響較輕微和暫時(shí)，隨著抗生素停用和日齡增長有一定恢復(fù)的趨勢(shì)，與之前研究結(jié)果一致［10，14］。本研究中，抗生素療程>7 d組第4周與第2周的菌群相比，門水平和屬水平上均無顯著變化。這提示>7 d抗生素治療療程對(duì)菌群的構(gòu)成和演化影響可能較嚴(yán)重，無顯著恢復(fù)趨勢(shì)。與其他研究結(jié)果顯示長期抗生素治療顯著改變了腸道菌群的組成一致［15］。第4周時(shí)，在門水平上，抗生素療程>7 d組較≤7 d組的厚壁菌門顯著降低而變形菌門顯著升高；在屬水平上，>7 d組較≤7 d組的狹窄梭菌屬1顯著降低。這提示>7 d的抗生素療程治療會(huì)導(dǎo)致有害菌或機(jī)會(huì)致病菌如變形菌門的比例顯著增加，有益菌屬如厚壁菌門及狹窄梭菌屬1的比例顯著降低，與對(duì)早產(chǎn)兒的腸道菌群的其他研究結(jié)果一致［16］。這可能是由于廣譜抗生素的較長時(shí)間應(yīng)用，較強(qiáng)的抗菌活性導(dǎo)致有益菌一直處于受抑制狀態(tài)［15］。

SCFAs大多是未經(jīng)小腸吸收利用的膳食纖維被大腸的腸道菌群發(fā)酵而生成的，且與菌群的種類和數(shù)量密切相關(guān)［17］。有研究表明，新生兒的腸道在出生時(shí)是有氧環(huán)境，然后逐漸變?yōu)閰捬醐h(huán)境，從而使厭氧菌（如梭菌和擬桿菌）得以定植［18］。異丁酸和戊酸大多是由厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)生，其含量應(yīng)隨著厭氧菌的定植增多而顯著升高［19］。本研究在第4周時(shí)，抗生素療程>7 d組的異丁酸和戊酸含量較≤7 d組顯著降低。這提示>7 d的抗生素療程治療會(huì)顯著減少VLBWI異丁酸和戊酸含量，與之前結(jié)果顯示抗生素療程會(huì)降低SCFAs含量及破壞腸道代謝的穩(wěn)態(tài)一致［10，15］。異丁酸有助于降低代謝紊亂個(gè)體對(duì)胰島素的抵抗［20］，戊酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用［21］，為功能性SCFAs。影響功能性SCFAs的含量可能對(duì)健康有影響。

為尋找精準(zhǔn)干預(yù)靶點(diǎn)，本研究進(jìn)一步探求特定菌群與SCFAs之間的關(guān)系。有研究顯示厚壁菌門和梭狀芽孢桿菌屬是產(chǎn)生SCFAs的優(yōu)勢(shì)類別，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，糞便中的丁酸含量與梭狀芽胞桿菌相關(guān)系數(shù)最高［13］。本研究?jī)H討論了組間SCFAs、菌群的測(cè)定結(jié)果具有顯著性差異且對(duì)應(yīng)一致的菌的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)狹窄梭菌屬1與異丁酸、丁酸和戊酸含量呈正相關(guān)，且>7 d組的抗生素療程治療會(huì)顯著減少其豐度。這提示狹窄梭菌屬1可能是進(jìn)一步相關(guān)研究的良好切入點(diǎn)。

本研究有一定的局限性。本研究只涉及來自同一家醫(yī)院的少量患兒樣本，未能進(jìn)一步依據(jù)胎齡和體重進(jìn)行分層分析。同時(shí)，本研究處于三級(jí)甲等醫(yī)院，收治的病例病情較為嚴(yán)重，因此未收集到胎齡小于30周且未使用抗生素的VLBWI作為對(duì)照組。本院未設(shè)有婦產(chǎn)科，本研究中的早產(chǎn)兒一經(jīng)住院立即使用抗生素，故使用抗生素前的自身對(duì)照標(biāo)本收集困難。

廣譜抗生素療程可能會(huì)導(dǎo)致胎齡小于30周的VLBWI腸道菌群的豐富度降低、定植和演化改變，以及其代謝產(chǎn)物功能性SCFAs含量降低。不利于腸道健康，臨床上應(yīng)該嚴(yán)格把握廣譜抗生素的適應(yīng)證及療程。