2017～2019年兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的分子流行病學(xué)研究

段美霖 胡月 唐香 許紅梅

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院感染科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014）

諾如病毒是引起兒童病毒性腹瀉的主要病原體之一，也是導(dǎo)致全球所有年齡段人群食源性疾病和胃腸炎暴發(fā)的主要原因［1］。諾如病毒相關(guān)性胃腸炎臨床上以嘔吐、腹瀉為主要表現(xiàn)，可伴有發(fā)熱、惡心、腹痛、厭食、乏力、驚厥等［2］，雖然大多數(shù)患者感染程度較輕，但也有出現(xiàn)住院、死亡等重癥病例，特別是在5歲以下兒童、65歲以上老年人和免疫力低下者［3］。據(jù)統(tǒng)計，諾如病毒每年可導(dǎo)致12%～24%的社區(qū)或診所胃腸炎病例、11%～17%的急診室或住院病例，以及大約7～20萬人死亡，且在兒童中發(fā)病率最高［1］。由此給全球帶來的社會經(jīng)濟(jì)損失可高達(dá)603億美元［4］。

諾如病毒屬于杯狀病毒科諾如病毒屬，無包膜單股正鏈的RNA病毒。人諾如病毒基因組包括3個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。根據(jù)衣殼區(qū)及聚合酶區(qū)基因序列，可分為10個基因組（GⅠ-GⅩ）及8個P組，包括49個衣殼基因型及60個P型［5］。GⅠ、GⅡ、GⅣ、GⅧ及GⅨ可感染人，而最為常見的為GⅠ和GⅡ［6］。諾如病毒具有高變異性，持續(xù)檢測兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的病原學(xué)特征、基因型變遷，有助于諾如病毒感染的預(yù)防和控制。本研究對2017～2019年期間在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門診就診的1 458例急性胃腸炎患兒中諾如病毒的分子流行病學(xué)特征進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2017年1月至2019年12月期間就診于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的急性胃腸炎患兒1 456例的臨床資料。所有患兒均符合急性腸胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］及納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）大便次數(shù)增加（每日排便次數(shù)3次或以上）；（2）糞便性狀改變（包括水樣便、稀便）；（3）大便常規(guī)提示白細(xì)胞及紅細(xì)胞計數(shù)均≤10個/高倍鏡視野（+）；（4）病程不超過2周。本研究已獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)［（2020）年倫審（研）第（154）號］。

1.2 樣本的處理和病毒RNA提取

共采集糞便樣本1 458份，其中2例患兒分別于不同病程各采集1份糞便樣本，男860份，女598份。取0.2 mL大便樣本或豌豆大小糞便量，加入0.8 mL PBS緩沖溶液，充分混勻配制成20%的混懸液，離心后獲取上清液，采用德國QIAGEN公司病毒核酸提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，提取病毒RNA。

1.3 VP1區(qū)序列擴(kuò)增及測序

采用美國Invitrogen公司RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn) 錄 合 成cDNA，選 擇GISKF/GISKR（GI）、CoG2F/G2SKR（GII）作為引物［8］，應(yīng)用大連寶生物有限公司的TaKaRa Premix Taq試劑盒擴(kuò)增諾如病毒的VP1區(qū)序列。反應(yīng)體系：上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，dNTP Mix（2.5 mol/L）2.0μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.15μL，ddH2O 13.35μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸7 min，4℃終止。將1.5%瓊脂糖凝膠電泳陽性的PCR產(chǎn)物外送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.4 序列分析

采用DNAstar軟件對測定序列進(jìn)行編輯，利用PubMed在線BLAST功能進(jìn)行比對，諾如病毒基因在線分型工具（https：//www.rivm.nl/mpf/typingtool/norovirus/）檢索其基因型。應(yīng)用MEGA 5.05軟件進(jìn)行多序列比對，使用Neighbor-joining法、Kimura2-parameter模型構(gòu)建親緣進(jìn)化樹，Bootstrap檢驗進(jìn)化樹的可靠性，重復(fù)檢驗1 000次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用頻數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 諾如病毒檢測結(jié)果

2017～2019年采集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的兒童腹瀉樣本1 458份，諾如病毒陽性檢出率為10.84%（158/1 458）；2017年陽性檢出率為10.0%（48/482），2018年陽性檢出率為12.3%（60/489），2019年陽性檢出率為10.3%（50/487），不同年份諾如病毒陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.588，P>0.05）。檢出的諾如病毒主要為GⅡ型（97.5%，154/158），GⅠ型僅4例（2.5%，4/158）。

2.2 諾如病毒感染性別分布

158例諾如病毒陽性患兒中，男性檢出率為12.2%（105/860），女性檢出率為8.9%（53/598），男性檢出率明顯高于女性（χ2=4.088，P=0.043）。

2.3 諾如病毒感染年齡分布

納入研究的患兒年齡分布從1月齡至165月齡，依次分為<6月齡、6月齡～、12月齡～、18月齡～、24月齡～、≥36月齡組，諾如病毒陽性率分別為3.1%（9/292）、13.5%（66/490）、16.9%（51/301）、13.4%（19/142）、6.2%（6/97）、5.1%（7/136），各年齡組間諾如病毒陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=40.982，P<0.001）。兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的發(fā)病年齡以小于2歲為主，占比為95.6%（151/158）。諾如病毒陽性率最高的年齡組為12～<18月齡組（16.9%），占所有諾如病毒陽性患兒的32.3%（51/158）。

2.4 諾如病毒感染時間分布

2017～2019年兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的各月監(jiān)測結(jié)果分析顯示，諾如病毒感染流行月份主要為8～10月份，不同年份略有波動。2017年諾如病毒檢出高峰在8、9月份，檢出率分別為32%（13/41）、31%（21/67）；2018年諾如病毒檢出高峰在9、10月份，檢出率分別為28%（13/47）、40%（16/40），同年5月份有一個小高峰，檢出率為25%（4/16）；2019年諾如病毒檢出高峰在9、10月份，檢出率分別為31%（15/48）、33%（20/60）。見圖1。

圖1 2017～2019年重慶地區(qū)兒童諾如病毒性胃腸炎病例的月份分布情況

2.5 諾如病毒感染臨床特征

諾如病毒陽性患兒臨床上以腹瀉（100%，158/158）為主要表現(xiàn)，可伴隨嘔吐（79.1%，125/158）、發(fā)熱（29.1%，46/158）、腹痛（1.3%，2/158）、脫水（1.3%，2/158）、精神萎靡（1.3%，2/158）等癥狀。92.4%（146/158）的患兒糞便性狀呈水樣便，少數(shù)為稀便（7.6%，12/158）；大便常規(guī)顯示有28例患兒檢出白細(xì)胞［≤10個/高倍鏡視野（+）］，4例患兒檢出紅細(xì)胞［≤10個/高倍鏡視野（+）］，合并輪狀病毒（膠體金法檢測）感染有23例（14.6%）。

2.6 諾如病毒的基因型分布

經(jīng)過核酸序列比，在158份陽性樣本中共檢出8種基因亞型，其中以GⅡ.4為主，占69.6%（110/158），且99份為GⅡ.4 Sydney 2012，占62.7%（99/158）；其次為GⅡ.3，占15.2%（24/158）；GⅡ.2占10.1%（16/158）；GⅡ.6占1.9%（3/158）；GⅡ.17占0.6%（1/158）；GⅠ.3占1.3%（2/158）；GⅠ.2、GI.5各占0.6%（1/158）。GⅡ.4 Sydney 2012在2017～2019年每年都占有明顯優(yōu)勢，在7～12月份為主要流行株，但2～4月卻無檢出。在1月和3～5月，GⅡ.3則成為主要流行株。GⅡ.6、GⅡ.17、GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.5散發(fā)在不同月份，且2017年無GⅠ檢出，2018年、2019年各檢出2例。見圖2。

圖2 2017～2019年重慶地區(qū)兒童諾如病毒性胃腸炎的基因型分布

隨機(jī)選取各基因型代表序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的參考株，構(gòu)建諾如病毒衣殼區(qū)的分子遺傳進(jìn)化樹。本研究中15株GⅡ.4 Sydney 2012毒株與臺灣株GⅡ.4 Sydney 2012 MH979230.1在同一遺傳支，同源性在96.8%～100%；13株GⅡ.3毒株與浙江株GⅡ.3 KY433576.1同源性在97.0%～100%；13株GⅡ.2毒株與俄國株GⅡ.2 MK886705.1同源性在98.3%～100%；3株GⅡ.6毒株與巴西株GⅡ.6 KX154761.1同源性在99.3%～99.7%；1株GⅡ.17毒株與江蘇株GⅡ.17 KU720506.1同源性為100%；1株GⅠ.5毒株與韓國株GI.5 MN494557.1同源性為99.7%；2株GⅠ.3毒株與韓國株GⅠ.3 MW532368.1同源性在93.4%～100%，其中GI.3 CQNV42012018CHN與韓國株GI.3 MN421672.1同源性在99.7%；1株GⅠ.2與俄國株GI.2 MF615618.1同源性為98.4%。見圖3。

圖3 諾如病毒衣殼區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

諾如病毒是導(dǎo)致兒童急性病毒性腹瀉第2位病原，在部分地區(qū)甚至越居第1位［9］，因而越來越受到重視，但目前諾如病毒疫苗仍處于研發(fā)階段，進(jìn)展最快的候選疫苗處于臨床實驗的IIb期［10］，迄今為止尚無有效的上市疫苗。因此，對諾如病毒流行特征及基因型變遷的監(jiān)測至關(guān)重要。

本研究顯示2017～2019年1 458份急性胃腸炎患兒糞便標(biāo)本中，3年諾如病毒的檢出率分別為10.0%、12.3%、10.3%，總檢出率為10.84%。相比于同地區(qū)2012～2014年的諾如病毒檢出率（21.9%、15.6%、13.1%）均降低［11-13］，但與2015年的諾如病毒檢出率10.7%相當(dāng)［14］。這提示2017～2019年諾如病毒陽性率波動幅度較小，較2012～2014年有下降趨勢，一方面可能與本地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、衛(wèi)生條件改善相關(guān)；另一方面可能與監(jiān)護(hù)人健康意識的提高，輕癥腹瀉自行予以對癥處理有關(guān)。與同時間段我國南北城市的諾如病毒監(jiān)測情況比較，云南省疾病預(yù)防控制中心調(diào)查顯示自云南、四川等省的各腹瀉監(jiān)測點采集2017～2019年的兒童腹瀉樣本中有10.43%檢出諾如病毒［15］，本地區(qū)與之相當(dāng)，但李潔等［16］監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示北京地區(qū)諾如病毒檢出率為7.5%，石鑫等［17］收集黑龍江哨點醫(yī)院腹瀉標(biāo)本研究諾如病毒感染的流行特征時發(fā)現(xiàn)7.14%的樣本檢出諾如病毒。

上述中國南北方諾如病毒陽性率的差異，可能與經(jīng)濟(jì)、氣候、居住環(huán)境、飲食生活習(xí)慣、健康意識、人群易感性等有關(guān)，而這一方面的研究國內(nèi)少見。據(jù)報道，濕度變化有利于輪狀病毒的持久性，增加了通過受污染表面?zhèn)鞑サ娘L(fēng)險［18］，由此推測濕度可能也會影響諾如病毒的持久性。也有研究表明極端天氣變化可能影響病毒性胃腸炎的發(fā)生，例如厄爾尼諾南方濤動，就被確認(rèn)是病毒性胃腸炎發(fā)生的重要危險因素［19］。而具體到諾如病毒而言，包括濕度、溫度、降雨、大風(fēng)、洪水等多種環(huán)境因素，對諾如病毒感染是否具有影響，需要諾如病毒與氣候條件的同步監(jiān)測，以進(jìn)一步研究。人群對諾如病毒易感性很大程度取決于腸道上皮表面是否存在組織血型抗原和非分泌者的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶2基因突變，從而導(dǎo)致相應(yīng)酶的活性喪失，腸道上皮細(xì)胞不能表達(dá)血型抗原，從而抵抗大部分諾如病毒的顯性感染，非分泌者感染諾如病毒的風(fēng)險低于分泌者［20］。對于我國不同區(qū)域人群組織血型抗原表達(dá)情況與諾如病毒感染的關(guān)系，仍然需要進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示諾如病毒流行高峰在8～10月份，與本地區(qū)既往監(jiān)測情況大致相當(dāng)［11-12］。在中國中部地區(qū)，例如湖北省則以10～12月份為流行高峰［21］，而黑龍江、北京等北方地區(qū)，流行高峰卻在2月份［16-17］。諾如病毒全球季節(jié)模式顯示其流行高峰期在冬季，提示溫度與諾如病毒流行存在一定相關(guān)，同時研究亦有提出降雨量與季節(jié)性存在正相關(guān)［22］。我國不同區(qū)域的諾如病毒流行的月份差異亦有可能與氣溫、降雨量有關(guān)。而這種差異性，或許對今后不同區(qū)域的疫苗接種時間的決策提供參考。

兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的發(fā)病年齡以小于2歲為主。諾如病毒陽性率最低的年齡組為<6月齡（3.1%），考慮可能與從母體獲得的保護(hù)性抗體有關(guān)，同時亦可能與這一年齡階段患兒活動范圍小，接觸感染的機(jī)會較低有關(guān)。本研究男性患兒諾如病毒陽性率較女性患兒更高，男性被認(rèn)為是兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的危險因素［23］，這可能與男性患兒衛(wèi)生意識較低，活動范圍較廣，接觸病毒感染的機(jī)會更多有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示兒童急性胃腸炎中諾如病毒感染仍以GII.4為主，這與我國多省市地區(qū)監(jiān)測結(jié)果相符［24］。由于諾如病毒具有高變異性，在抗原漂移、基因重組的雙重作用下，約每2～4年便會出現(xiàn)一個新的GII.4變異株以替代既往流行的GII.4變異株，但自2012年來，GII.4 Sydney 2012一直持續(xù)流行［25］，本研究亦顯示了GII.4 Sydney 2012為本地區(qū)2017～2019年流行的主要流行株。有研究認(rèn)為帶有GⅡ.4 Sydney 2012衣殼的病毒通過重組進(jìn)化持續(xù)存在［25］。

GII.3在人群中長期廣泛流行，在本研究中GII.3處在諾如病毒基因型檢出的第2位，而何菲等［26］研究天津市兒童GII感染情況時則發(fā)現(xiàn)GII.3檢出率甚至高于GII.4，但根據(jù)全球數(shù)據(jù)顯示，GII.3仍是次于GII.4的導(dǎo)致兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的基因型［23］，對于GII.3今后是否超越GII.4成為主要優(yōu)勢株，需要進(jìn)一步監(jiān)測。GII.17自1978年第1次報道以來，常為零星感染，而且該基因型較GII.4、GII.3在成年人的暴發(fā)感染中更常見［27］，而在2014～2015年，GII.17在亞洲部分地區(qū)，例如中國廣東地區(qū)及日本［27-28］，短暫替代GII.4 Sydney 2012，成為諾如病毒暴發(fā)流行的主要基因型，而后該基因型再次呈現(xiàn)零星感染，主要流行株仍為GII.4 Sydney 2012。GI在人群中感染率較低，根據(jù)Mans等［29］對1997～2018年諾如病毒流行病學(xué)及基因型分布的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析，結(jié)果顯示GI基因組中最為流行的毒株為GI.3基因型。本研究中GI在2017年未檢出，這與本地區(qū)既往2012年、2014年、2015年未檢出結(jié)果一致［11-12，14］，但在2018及2019年各檢出2例，說明今后本地區(qū)需注意GI感染的監(jiān)測。大體上看本地區(qū)GI感染率低，基本符合全球范圍內(nèi)流行趨勢，GI基因組在人群中感染率較低，或許與其變異性較低、病毒間交叉保護(hù)作用等相關(guān)。

綜上所述，本研究顯示2017～2019年間諾如病毒仍是引起兒童急性胃腸炎中的重要病原之一，陽性率為10.84%。其流行高峰在8～10月份，兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的發(fā)病年齡以小于2歲為主，男性患兒諾如病毒陽性率較女性患兒更高。GII.4 Sydney 2012為主要流行株，GII.3、GII.2次之，GI偶有檢出。諾如病毒的流行病學(xué)受到地區(qū)經(jīng)濟(jì)、氣候、居住環(huán)境、飲食生活習(xí)慣、健康意識、人群易感性等多方面因素影響，對兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的時間分布、人群分布、臨床特征、基因型分布等的持續(xù)監(jiān)測，可為本地區(qū)兒童諾如病毒相關(guān)性胃腸炎的預(yù)防與控制提供重要支持。