間充質(zhì)干細(xì)胞治療動(dòng)物腎損傷研究進(jìn)展

何文來，李巴侖，張慧敏，劉蘊(yùn)蝶，彭 莎 (西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

腎臟是動(dòng)物機(jī)體維持水、電解質(zhì)、酸堿平衡的重要器官，保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進(jìn)行。當(dāng)腎臟處于有害條件下可引起腎損傷。根據(jù)腎損傷病程的長短可分為急性腎損傷 (acute kidney injury，AKI)和慢性腎損傷(chronic kidney disease，CKD)，根據(jù)病變部位和病因不同，AKI可分為腎前性、腎性和腎后性3大類，各有不同的發(fā)病機(jī)制[1]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類存在于多種組織(如骨髓、脂肪組織、臍帶血、牙髓等)、具有多向分化潛力的非造血干細(xì)胞類的成體干細(xì)胞[2]。20多年來，已有大量科學(xué)研究證明了MSCs在疾病治療中的潛力[3]。

1 MSCs移植治療腎損傷機(jī)制研究

目前，腎損傷已十分普遍，它具有多種病因，影響著各個(gè)年齡段、性別和種族的人[4]。與人類臨床醫(yī)學(xué)相似，腎損傷也是老年伴侶動(dòng)物的常見疾病之一，目前最為有效的治療方式為腎臟替代療法，包括血液透析、腹膜透析和腎臟移植，但此類方法或配型難度大或治療費(fèi)用高昂，且要求終身免疫抑制，難以應(yīng)用到寵物臨床治療上。因此，開辟新的治療方法顯得極為重要。目前，MSCs被認(rèn)為是治療腎臟疾病的新療法[5]。

研究表明， MSCs能促進(jìn)AKI發(fā)生后腎功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能涉及多條途徑，圖1列舉了MSCs在腎臟疾病中發(fā)揮作用的主要機(jī)制[6]，例如抗炎、抗氧化、抗凋亡及免疫調(diào)節(jié)等。

圖1 MSCs在腎臟疾病中發(fā)揮作用的主要機(jī)制

MSCs能夠與自身腎小管細(xì)胞融合，還能夠分化為腎臟細(xì)胞直接參與腎臟修復(fù)[7]。此外，移植后的MSCs進(jìn)入血液循環(huán)，表達(dá)多種黏附分子，例如L-選擇素、P-選擇素和血管細(xì)胞黏附分子-1引起中性粒細(xì)胞浸潤減少，進(jìn)而減輕了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]。不僅如此，MSCs還可以抑制巨噬細(xì)胞的活化，并促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的釋放[9]。在損傷組織的趨化信號(hào)下，MSCs遷移到受損的腎組織，分泌許多可以恢復(fù)損傷的細(xì)胞因子和趨化因子如肝細(xì)胞生長因子(HGF)、成纖維細(xì)胞因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，這些細(xì)胞因子和生長因子通過抗凋亡[10]、抗氧化[11]、抗纖維化[12]和促進(jìn)血管生成[13]等途徑促進(jìn)損傷修復(fù)。除了內(nèi)分泌機(jī)制外，這些因子還通過旁分泌的方式調(diào)節(jié)組織修復(fù)引起的免疫反應(yīng)[14]。MSCs發(fā)揮這些治療作用與其特性密不可分，MSCs具有低免疫原性的特性，可降低機(jī)體對(duì)外源MSCs的清除作用，因此，移植進(jìn)入機(jī)體的外源MSCs不易在短期內(nèi)被患者的免疫系統(tǒng)排斥，從而發(fā)揮治療作用[15]。

2 MSCs移植治療AKI

目前被廣泛研究的MSCs主要來源于脂肪、骨髓和臍帶，其他類型如牙髓、羊水和誘導(dǎo)多能型干細(xì)胞來源的MSCs等也被證實(shí)具有治療潛力。

源自脂肪組織的脂肪MSCs(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)在脂肪中含量很高，且易于分離和純化，由于抽脂術(shù)在臨床上的廣泛使用使分離ADSCs的脂肪組織來源十分充足。此外，ADSCs體外增殖速度較快，為骨髓MSCs(bone marrow mesenchyml stem cell，BM-MSCs)的40倍[16]。ELHUSSEINI等[17]發(fā)現(xiàn)，在順鉑誘導(dǎo)的AKI大鼠中，ADSCs可分泌特定的細(xì)胞因子阻止p38 MAPK的活化，進(jìn)而將Bcl-2和Bax的表達(dá)調(diào)節(jié)到正常水平，隨之，凋亡途徑被抑制，最終腎小管細(xì)胞壞死和腎功能衰竭得到改善；他們還推測(cè)，受損的腎小管細(xì)胞會(huì)釋放某些信號(hào)，從而觸發(fā)ADSCs產(chǎn)生這些特異性細(xì)胞因子。在缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷的大鼠模型中，接受ADSCs尾靜脈移植的大鼠血清和組織中的丙二醛水平顯著降低，表明ADSCs可能通過抗氧化和抗炎發(fā)揮作用[18]。

有研究表明，BM-MSCs的給藥途徑對(duì)治療效果沒有顯著影響，向腎損傷大鼠動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)和腎臟包膜內(nèi)注射BM-MSCs均能有效改善腎功能和組織損傷[19]。與坎迪沙坦(血管緊張素Ⅱ阻滯劑)相比，BM-MSCs在Wister大鼠的AKI治療中更有效，BM-MSCs治療可顯著降低肌酐(serum creatinine，sCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，也使Bax和Caspase-3等凋亡標(biāo)志物以及p38、TNF-α和MCP-1等炎癥標(biāo)志物的表達(dá)水平降低[20]。

相較于骨髓來源的BM-MSCs，臍帶血MSCs(umbilical cord blood mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)可從人或動(dòng)物的臍帶中分離，更容易獲得[8]，同BM-MSCs相比，UCB-MSCs具有更低的免疫原性，可防止同種異體移植中的免疫排斥反應(yīng)。此外，它們顯示出更高的多系分化潛力和成纖維細(xì)胞集落形成能力[21]。在患有I/R損傷的大鼠中，UCB-MSCs比ADSCs能更好地改善腎小球?yàn)V過率和腎小管功能，與衰老有關(guān)的microRNA(microR-29a和microR-34a)及相關(guān)蛋白質(zhì)(β-半乳糖苷酶、p21Waf1/Cip1和p16INK4a)的表達(dá)都有所降低，預(yù)示著MSCs對(duì)腎臟功能的改善與細(xì)胞衰老之間也存在著某些聯(lián)系[22]。

相比于上述3種常見的MSCs，其他類型MSCs的研究相對(duì)較少。此前，脫落乳牙一直被視為醫(yī)療廢物。2015年，研究人員發(fā)現(xiàn)可從牙髓中分離到牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)，將其應(yīng)用于AKI小鼠，發(fā)現(xiàn)治療組小鼠血清中的sCr和BUN水平遠(yuǎn)低于對(duì)照組，而BM-MSCs卻沒有治療效果。SHED治療組體內(nèi)的炎癥細(xì)胞(包括嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)數(shù)量顯著減少，MCP-1、MIP-2和IL-1β的分泌水平明顯低于對(duì)照組[23]。體外研究發(fā)現(xiàn)，SHED顯著降低H2O2刺激的腎小管上皮細(xì)胞中MCP-1的分泌，促進(jìn)了HGF的分泌，進(jìn)而加速了劃痕試驗(yàn)中傷口的愈合，表明SHED在炎癥早期發(fā)揮抗炎活性，并通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的增殖和遷移。SHED可能提供一種新穎的干細(xì)胞資源，可用于治療缺血性腎損傷[24]。

近年來，隨著生物材料、基因編輯、組織工程等技術(shù)的快速發(fā)展，目前已開發(fā)出多種處理策略以提高M(jìn)SCs的治療效率。圖2展示了目前的一些處理策略，不同處理策略各具優(yōu)缺點(diǎn)[25]。缺氧預(yù)處理簡單、快速，但面臨體系標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化的問題；與其他處理策略相比，基因修飾是一種更精確的方法，但存在載體毒性和體內(nèi)致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)；使用支持材料的優(yōu)勢(shì)是更大的生物相容性和針對(duì)性，但是，這些新開發(fā)材料目前的價(jià)格仍然很高，這將限制它們?cè)谂R床中的應(yīng)用。除上述方法外，將MSCs與細(xì)胞因子或化合物一起孵育是另一種有效可行的處理策略，該技術(shù)操作簡單、體系完善且安全性高，這使其成為臨床應(yīng)用中最具前景的一種MSCs處理策略[26]。

圖2 增強(qiáng)MSCs在AKI中治療效果的不同預(yù)處理方式示意圖

ADSCs通常在21%的氧環(huán)境中培養(yǎng)，但從生理角度上來講，ADSCs生存在遠(yuǎn)低于此氧張力的環(huán)境中[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)MSCs，細(xì)胞仍能保持多能性，并具有更強(qiáng)的增殖、遷移能力及更低的衰老率。更重要的是，低氧預(yù)處理的MSCs在體外不會(huì)分化為與腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，并且在體內(nèi)也不具有致瘤性，這使MSCs在臨床應(yīng)用中更具安全性[28]。

此前大量研究證實(shí)，MSCs通過分泌大量細(xì)胞因子促進(jìn)腎損傷恢復(fù)。CHEN等[29]將HGF過表達(dá)的UCB-MSCs應(yīng)用于I/R損傷的大鼠模型中，結(jié)果顯示HGF修飾可以增強(qiáng)UCB-MSCs的腎臟保護(hù)作用，UCB-MSCs處理組和HGF修飾后的MSCs處理組在再灌注后24，48 h的sCr和BUN水平無顯著差異，而在再灌注后72 h，HGF修飾的MSCs對(duì)大鼠的腎臟功能恢復(fù)更為明顯，修飾組大鼠的sCr和BUN水平幾乎降低至基線，其他數(shù)據(jù)表明MSCs可通過抑制受損組織中的腎細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)來改善I/R損傷。其他研究也表明，對(duì)UCB-MSCs進(jìn)行過表達(dá)IGF-1處理，通過移植治療慶大霉素誘導(dǎo)的AKI大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IGF-1組在抗氧化、抗炎癥和細(xì)胞遷移方面都比其他組具有更好的療效[21]。

白藜蘆醇是一種具有抗衰老或干細(xì)胞保護(hù)作用的天然多酚化合物，在改善MSCs增殖、維持分化潛能、延遲MSCs衰老等方面具有一定促進(jìn)作用。將20 μmol/L的白藜蘆醇與UCB-MSCs共處理后，白藜蘆醇通過旁分泌血小板衍生生長因子，激活腎小管細(xì)胞中的ERK通路并促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，進(jìn)而在修復(fù)順鉑誘導(dǎo)的AKI中比UCB-MSCs具有更高的效率[30]。

褪黑素(melatonin，Mel)是一種主要由松果體分泌的神經(jīng)性激素，是哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的關(guān)鍵分子。除了參與許多其他病理生理過程之外，還具有抗炎和抗氧化特性。近年來，人們還發(fā)現(xiàn)Mel是一種有效的自由基清除劑，在包括腎臟在內(nèi)的多個(gè)器官功能失調(diào)中起到保護(hù)作用[31]。體外細(xì)胞存活分析顯示，Mel預(yù)處理后，ADSCs的增殖能力顯著增強(qiáng)，超氧化物歧化酶-1和血紅素加氧酶-1的表達(dá)被上調(diào)，表明Mel預(yù)處理后的ADSCs具有更好的生存、抗凋亡和抗氧化能力[32]。MIAS等[33]將Mel預(yù)處理的BM-MSCs移植到I/R誘導(dǎo)的AKI大鼠中，在預(yù)處理組腎臟中觀察到更多存活的MSCs和更快的血管生成，腎小管上皮細(xì)胞增殖加速，腎功能恢復(fù)加快。這些結(jié)果表明Mel在體內(nèi)微環(huán)境中具有保護(hù)MSCs存活及功能的潛在作用，體外分析結(jié)果顯示，Mel預(yù)處理組中過氧化氫酶和超氧岐化酶-1的表達(dá)水平升高，堿性成纖維細(xì)胞生長因子和HGF表達(dá)被上調(diào)，而Mel受體抑制劑Luzindole可抑制這些有益的保護(hù)作用。

目前，在塑料培養(yǎng)皿上2D培養(yǎng)細(xì)胞是最普遍、最方便的擴(kuò)增MSCs或其他細(xì)胞的方法，然而，2D培養(yǎng)并不能模擬MSCs在體內(nèi)的微環(huán)境，并且因此(如缺乏細(xì)胞間接觸)可能影響細(xì)胞的可用性。而在3D培養(yǎng)模式下，能更好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的緊密連接與交流，模擬MSCs體內(nèi)微環(huán)境[34]。更重要的是，由于治療需求的MSCs數(shù)量巨大，但MSCs的增殖速率在短期的大量擴(kuò)增后會(huì)穩(wěn)定下降，這表明細(xì)胞在不同時(shí)間進(jìn)入衰老狀態(tài)，所以必須提高M(jìn)SCs的培養(yǎng)效率。研究表明，采用3D培養(yǎng)模式的MSCs在分泌治療性抗炎和免疫調(diào)節(jié)因子方面均有所提升，這為進(jìn)一步增強(qiáng)MSCs的療效奠定了基礎(chǔ)[35]。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，無細(xì)胞治療逐漸興起。MSCs來源的外泌體是一種由MSCs分泌的直徑為30～100 nm的膜性外分泌囊泡。研究表明，外泌體富含細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)和mRNA等，可在調(diào)節(jié)受體細(xì)胞信號(hào)通路、組織修復(fù)和再生方面發(fā)揮作用[36]。大量數(shù)據(jù)表明，在AKI動(dòng)物模型中使用MSCs衍生的外泌體是安全的，并且可以增強(qiáng)腎臟的功能，這為再生醫(yī)學(xué)中的無細(xì)胞治療策略提供了新思路[37-38]。

有研究表明，當(dāng)與受體細(xì)胞融合時(shí)，外泌體將釋放大量生物因子對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生影響，包裹在外泌體中的miRNA可以增強(qiáng)組織再生、促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡[38]。分析人BM-MSCs來源的外泌體中的miRNA水平后發(fā)現(xiàn)，在23種主要的miRNA中，有幾種miRNA(miR-221-3p、miR-199a-3p和miR-21-5p)可以抑制I/R損傷引起的腎小管細(xì)胞凋亡，其中以miR-199a-3p的作用最為顯著[39]。最近的一項(xiàng)研究中，人BM-MSCs來源的外泌體中的miR-199a-3p參與了外泌體介導(dǎo)的凋亡抑制，通過下調(diào)Sema3A的表達(dá)激活A(yù)KT和ERK途徑，從而減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而緩解I/R損傷引起的腎小管擴(kuò)張、刷狀緣丟失、核丟失和管型形成。在體外試驗(yàn)中，敲低miR-199a-3p在外泌體中的表達(dá)后，人腎小管近端上皮細(xì)胞凋亡率明顯上升[40]。

其他類型MSCs來源的外泌體，如UCB-MSCs來源的外泌體已被證明對(duì)AKI的治療具有有益作用。ZHOU等[41]證明了UCB-MSCs衍生的外泌體可通過緩解腎組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平保護(hù)順鉑引起的AKI。在此基礎(chǔ)上，他們發(fā)現(xiàn)在順鉑建立AKI大鼠模型前，在腎被膜下進(jìn)行外泌體注射，對(duì)順鉑造成的腎損傷具有預(yù)防作用，并且通過抑制腎小管上皮細(xì)胞中的mTOR信號(hào)通路來激活自噬，從而減少細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，最終使腎臟功能得到改善[42]。

3 MSCs移植治療CKD

CKD是指各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常(病史超過3個(gè)月)，衰老、糖尿病腎病、缺血性腎病、遺傳性腎病等是CKD的幾大主要病因。現(xiàn)階段，CKD已經(jīng)成為全球性公共衛(wèi)生問題，大約影響世界人口的11.7%～15.1%[43]。有報(bào)告統(tǒng)計(jì)，該病在我國患病率約為10%，并隨著老齡化、糖尿病、高血壓、肥胖等問題的加重有逐年上升的趨勢(shì)[44]。CKD的特征為進(jìn)行性腎小球硬化與間質(zhì)纖維化，腎單位受損或者減少引起腎小球超濾，充血腫脹，小球內(nèi)高壓以及全身性高血壓導(dǎo)致腎小球硬化；間質(zhì)和腎小球被以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，引起腎組織纖維化和大量膠原沉積[45]。盡管藥物或手術(shù)療法可以改善整體腎臟功能，但不能改善受影響的周圍組織的再生和功能恢復(fù)。實(shí)際上，腎臟具有一定的再生能力，然而，這種能力有限，通常無法有效預(yù)防和恢復(fù)纖維化，最終，CKD走向終末期腎病[46]。因此，需要新穎的療法阻止或延緩腎臟損傷過程。

細(xì)胞再生療法已被廣泛認(rèn)為是許多暫無其他治療選擇的替代治療方式，有望提高內(nèi)源性修復(fù)能力，恢復(fù)受損腎臟的結(jié)構(gòu)與功能，從而延緩或終止疾病的發(fā)展。MSCs具有抗纖維化、抗炎和促血管生成的特性，可調(diào)節(jié)炎癥、免疫激活和新血管生成[47]。MSCs所具有的多重特性以及在治療AKI中的出色表現(xiàn)使其在CKD細(xì)胞療法中被予以厚望。

目前，大多數(shù)有關(guān)CKD的基礎(chǔ)研究都是通過實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行的，例如殘余模型，也稱為5/6腎切除術(shù)。研究人員對(duì)成年大鼠實(shí)施5/6腎切除術(shù)以建立CKD模型，治療組單次靜脈內(nèi)輸注0.5×106個(gè)MSCs，結(jié)果表明，治療組sCr水平顯著低于模型組，組織學(xué)損傷評(píng)分也低于模型組，治療組腎臟中VEGF的表達(dá)水平更高，提示MSCs所介導(dǎo)的修復(fù)作用與血管保護(hù)相關(guān)[48]。VEGF是內(nèi)皮和血管系統(tǒng)發(fā)展和腎小球形成的重要因素。它在成人腎臟中的表達(dá)僅限于腎小球和一些管狀細(xì)胞，在這些細(xì)胞中，它參與維持構(gòu)成腎小球的毛細(xì)血管的通透性和完整性。此前也有研究表明，在進(jìn)行性腎臟疾病中，VEGF具有對(duì)抗腎小球損害的作用，且其表達(dá)量與腎小球硬化程度呈反比[49]。

在另外一項(xiàng)研究中，CKD大鼠接受了2×105個(gè)大鼠來源的BM-MSCs，結(jié)果顯示，治療組sCr和BUN顯著低于未處理組，蛋白尿水平有所下降。此外，MSCs治療組紅細(xì)胞比容顯著增加，貧血情況有所好轉(zhuǎn)，血壓、血糖、血清白蛋白無明顯變化。對(duì)MSCs進(jìn)行追蹤后，在間質(zhì)區(qū)域和血管附近發(fā)現(xiàn)了CD73和CD90雙陽性共定位的MSCs。Masson和Sirius Red染色結(jié)果表明，MSCs治療組的腎臟組織纖維化明顯減少，腎小球硬化程度降低。在mRNA表達(dá)水平上，纖維化分子如FSP-1、波形蛋白和膠原蛋白表達(dá)量顯著下降。同時(shí)，抗纖維化分子HO-1、HGF等的表達(dá)量上調(diào)。MSCs治療后，腎IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著降低，而IL-4和IL-10表達(dá)水平升高。這些結(jié)果表明，MSCs可以調(diào)節(jié)慢性腎臟損傷初期的炎癥反應(yīng)。MSCs的免疫抑制和重塑特性可能與腎臟纖維化減少有關(guān)[50]。在一項(xiàng)長達(dá)4周的分析中也表明，ADSCs具有長期的免疫調(diào)節(jié)作用，通過減少間質(zhì)膠原沉積以及組織趨化因子和細(xì)胞因子抑制了葉酸所致的腎纖維化和慢性炎癥。除此之外，中性粒細(xì)胞浸潤的減少在該過程中起到了重要作用[51]。

與MSCs治療AKI類似，對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理同樣適用于CKD的治療，利用MSCs衍生的外泌體治療CKD也有報(bào)道。與直接細(xì)胞治療相比，外泌體是功能性生物產(chǎn)品，不是隨機(jī)產(chǎn)生的生物膜結(jié)構(gòu)殘留物，也許能夠克服傳統(tǒng)細(xì)胞療法的不利影響。特別是對(duì)于那些需要MSCs長期治療的疾患來說，可有效避免由于常規(guī)細(xì)胞治療方法而引起的細(xì)胞突變或癌變[37]。

越來越多的證據(jù)表明，外泌體中的miRNA是參與外泌體介導(dǎo)的CKD恢復(fù)過程中的關(guān)鍵組成部分，如miRNA-29、miRNA-21、miRNA-199等。有研究對(duì)比了人肝干細(xì)胞來源和人BM-MSCs來源的外泌體對(duì)于糖尿病腎病小鼠腎臟纖維化的潛在治療作用，結(jié)果表明，外泌體有效地抑制了纖維化的發(fā)展。生物信息學(xué)分析表明，盡管2種來源的外泌體在miRNA表達(dá)上存在差異，但在抗纖維化途徑和治療效果上不具有明顯差異[52]。不僅如此，有研究還發(fā)現(xiàn)外泌體可以影響腎臟本身的miRNA調(diào)控，在馬兜鈴酸誘導(dǎo)的CKD小鼠中，連續(xù)使用人BM-MSCs來源的外泌體進(jìn)行治療，對(duì)比治療組和模型組小鼠腎臟中的miRNA，發(fā)現(xiàn)在10個(gè)具有顯著性差異的miRNA中，7個(gè)在外泌體治療后顯著下調(diào)，生物信息學(xué)分析這7個(gè)miRNA后發(fā)現(xiàn)，它們共涉及90余種途徑，在選取的37個(gè)途徑中，大多數(shù)都與腎損傷病理過程如纖維化、炎癥和細(xì)胞凋亡等相關(guān)[53]。

目前關(guān)于使用Mel預(yù)處理的MSCs治療CKD的報(bào)道較少，SABERI等[54]用Mel預(yù)處理BM-MSCs后，將其移植到單側(cè)輸尿管阻塞的大鼠中。發(fā)現(xiàn)Mel預(yù)處理的MSCs可以降低TGF-β、TNF-α和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，并且與對(duì)照組相比，鈣黏蛋白的表達(dá)被上調(diào)，腎小管上皮細(xì)胞間的黏附增加，最終使腎臟組織中的纖維化區(qū)域減少。另外，在受損的腎臟中觀察到更多存活的被移植的MSC，這表明Mel預(yù)處理的MSCs具有更好的存活和遷移活性。

除Mel等化合物外，生物工程材料的應(yīng)用也為干細(xì)胞治療帶來了廣闊的前景。靜脈途徑給予的細(xì)胞在到達(dá)目標(biāo)器官前死亡，大劑量細(xì)胞則可能引起自身聚團(tuán)，淤積在肺部并因此導(dǎo)致肺栓塞，手術(shù)直接疏通動(dòng)脈通路操作難度大，并且時(shí)刻面臨麻醉風(fēng)險(xiǎn)，患者接受度也不高，這是目前MSCs治療所面臨的重大難題。水凝膠是一類極為親水的三維結(jié)構(gòu)凝膠，以多種方式增強(qiáng)MSCs的療效，如利用水凝膠將MSCs直接遞送至局部并最大化目標(biāo)區(qū)域的細(xì)胞比例，減少體內(nèi)微環(huán)境對(duì)MSCs的損傷，以及靶向地釋放生物活性分子等[55]。目前，利用水凝膠進(jìn)行CKD細(xì)胞治療的研究很少，然而，基于水凝膠的干細(xì)胞療法在一系列其他慢性疾病模型中展現(xiàn)出了很好的療效，包括心肌梗死[56]、聲帶再生[57]、神經(jīng)損傷[58]等。對(duì)于CKD的治療，有研究者提出一種理想的長期水凝膠，可以在細(xì)胞受到周圍組織炎癥刺激時(shí)，使長期保持未分化狀態(tài)的干細(xì)胞向腎臟持續(xù)釋放抗纖維化信號(hào)[55]。盡管水凝膠在治療CKD中的應(yīng)用尚不發(fā)達(dá)，但在其他慢性疾病治療方面取得的巨大進(jìn)展有望使水凝膠材料應(yīng)用于CKD 的治療中。

MSCs不僅在AKI及CKD中被證實(shí)具有治療作用，在AKI向CKD發(fā)展過程中，MSCs同樣展現(xiàn)出治療潛力。MSCs治療優(yōu)于藥物的優(yōu)勢(shì)是其在體內(nèi)外的多能再生性，涵蓋了AKI-CKD過程中大部分高度復(fù)雜的病理生理過程[59]。在通過單側(cè)I/R損傷建立的AKI-CKD模型中，ADSCs治療上調(diào)了腎小管Sox9的表達(dá)，促進(jìn)了腎小管的再生，緩解了AKI并減輕了隨后的腎纖維化[60]。目前，再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大多數(shù)研究仍局限于評(píng)估MSCs在AKI或CKD上的治療效果，很少有研究關(guān)注從AKI向CKD發(fā)展的問題。因此，在將MSCs作為AKI-CKD轉(zhuǎn)變過程中的現(xiàn)實(shí)臨床治療工具之前，還有很長的路要走。

4 MSCs治療犬貓腎損傷

現(xiàn)階段，MSCs應(yīng)用于犬臨床前試驗(yàn)及臨床研究大都集中于骨髓及關(guān)節(jié)疾病。據(jù)GUGJOO等[61]報(bào)道，在33項(xiàng)臨床研究中，有關(guān)脊髓和關(guān)節(jié)的占到60%以上。目前僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于MSCs治療犬腎臟和肝臟損傷，在慶大霉素和順鉑聯(lián)合建立的犬AKI模型中，在超聲引導(dǎo)下，在腎被膜內(nèi)進(jìn)行了UCB-MSCs移植，血液分析顯示，治療組犬血清sCr和BUN水平均明顯下降，組織學(xué)分析表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)，間質(zhì)中白細(xì)胞浸潤減少，腎小管損傷和腎小球壞死水平降低[62]。在順鉑建立的犬AKI模型中，治療組接受1×106個(gè)BM-MSCs靜脈移植治療，結(jié)果顯示腎小管壞死擴(kuò)張減少，組織纖維化減少，同時(shí)腎小管上皮細(xì)胞的增殖增加，犬腎功能有所提高但未表現(xiàn)出差異[63]。在健康犬中，通過腎動(dòng)脈導(dǎo)管插入法對(duì)犬同種異體MSCs進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞追蹤和對(duì)腎臟的生理病理影響的研究中，MSCs的輸入引起腎臟皮質(zhì)一過性低血壓，35 d內(nèi)并未引起功能性并發(fā)癥，表明移植MSCs對(duì)于犬來說是安全的[64]。

在貓的腎損傷治療中，MSCs療法的效果似乎并不是很理想。15只成年貓?jiān)趩蝹?cè)腎動(dòng)脈夾閉1 h后，分別施以同種異體ADSCs、BM-MSCs及成纖維細(xì)胞移植，結(jié)果顯示各組貓尿比重、蛋白尿、腎小球?yàn)V過率和組織病理學(xué)表現(xiàn)上均未表現(xiàn)出差異[65]。一項(xiàng)臨床研究中，4只CKD患貓?jiān)诨疾?，4，6周后接受2×106/kg劑量的ADSCs靜脈注射，另外3只貓以生理鹽水作為對(duì)照。隨后8周的隨訪中未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)，但也未觀察到患貓腎功能改善的情況[66]。在腎內(nèi)自體MSCs治療貓腎臟疾病研究中，2只臨床3期CKD患貓的腎小球?yàn)V過率和sCr水平有所改善，且未出現(xiàn)不良反應(yīng)，但由于從老年貓中擴(kuò)增出足夠多的自體MSCs過于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所需的干預(yù)措施過于復(fù)雜，在臨床應(yīng)用上沒有潛力[67]。這些陰性結(jié)果可能與貓MSCs會(huì)被貓泡沫病毒感染有關(guān)，大約20%～50%的MSCs會(huì)被該病毒感染，從而降低細(xì)胞的增殖率，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此泡沫病毒感染可能是限制貓MSCs治療的一大因素[68]。

5 展望

目前，隨著再生醫(yī)學(xué)、生物工程和組織工程等前沿領(lǐng)域的不斷發(fā)展，基于MSCs的療法在臨床上應(yīng)用愈發(fā)廣泛，特別是在模式動(dòng)物中，MSCs的基礎(chǔ)研究逐漸深入為其在臨床中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，與生物工程、材料科學(xué)等的緊密結(jié)合進(jìn)一步提升了細(xì)胞治療的效果。除了在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的杰出貢獻(xiàn)，MSCs療法的出現(xiàn)也為動(dòng)物臨床中一些疑難雜癥的治療提供了嶄新的思路，例如在神經(jīng)損傷、肌腱、關(guān)節(jié)損傷等疾病的治療研究中已開展了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)[69-71]。應(yīng)用MSCs治療終末期臟器衰竭及腫瘤疾病的相關(guān)研究也逐漸增多，并且也由基礎(chǔ)研究逐漸走向臨床實(shí)踐[72-73]。

盡管大量的臨床前和臨床研究已證實(shí)了MSCs在治療多種疾病中的有效性，但是還需要進(jìn)一步的深入研究來完善治療方案以實(shí)現(xiàn)更長久的療效。同時(shí)，對(duì)于細(xì)胞類型的選擇、移植細(xì)胞的劑量、時(shí)間、途徑等都需要進(jìn)一步評(píng)估。此外，MSCs在某些非常見病如自身免疫性疾病中的效果如何還研究甚少。因此，我們還需要很長的一段路要走。相信在不久的將來，隨著細(xì)胞療法及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和普及，一定能造福更多的人和伴侶動(dòng)物，并帶來人類臨床醫(yī)學(xué)和小動(dòng)物臨床醫(yī)療的新一輪革命。