西尼羅河病毒感染與免疫機(jī)制研究進(jìn)展

孫 靜，何 展，蔡 暢，衛(wèi)芳芳，程昌勇，宋厚輝 (浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中澳動(dòng)物健康大數(shù)據(jù)分析聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

西尼羅河病毒(West Nile virus,WNV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)家族成員，為分節(jié)段的單股正鏈 RNA 病毒，基因組長度約為11 kb(圖1)。該病毒的生命周期如圖2所示，首先附著于細(xì)胞表面受體(未知)，被細(xì)胞內(nèi)吞后與吞噬體膜融合，釋放病毒基因組RNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，被翻譯為一個(gè)單一的多聚蛋白，該多聚蛋白隨后被病毒和宿主蛋白酶裂解，產(chǎn)生3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1]。結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)包裹病毒RNA參與病毒粒子的形成，非結(jié)構(gòu)蛋白形成負(fù)向和正向病毒RNA合成所需的復(fù)制復(fù)合體。病毒粒子在宿主體內(nèi)完成組裝并通過宿主分泌途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，成熟的病毒粒子通過胞吐作用從感染細(xì)胞釋放出來，從而進(jìn)行新一輪感染[2]。

圖1 WNV結(jié)構(gòu)

圖2 WNV生命周期

在自然界中，WNV主要在蚊(主要是庫蚊)和鳥類之間循環(huán)傳播，但偶爾出現(xiàn)循環(huán)外溢，從而感染人類和一些馬屬動(dòng)物。有研究顯示，WNV在一些哺乳動(dòng)物(如松鼠)和爬行類動(dòng)物(如鱷魚)中存在[3]。因此，目前建立的基于小鼠、倉鼠和一些非人類靈長類動(dòng)物的WNV感染動(dòng)物模型，為人類進(jìn)一步了解其感染機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)綜述WNV的發(fā)病機(jī)制，重點(diǎn)介紹先天免疫激活、先天免疫應(yīng)答與適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的相互干擾以及針對(duì)病毒免疫逃逸對(duì)策等方面的最新研究進(jìn)展并圍繞這些進(jìn)展進(jìn)行了討論，以期為新型治療方法的研制及疫苗接種期間如何提高免疫力的策略方面提供新思路。

1 WNV的發(fā)病機(jī)制

WNV可在蚊蟲的腸上皮細(xì)胞中復(fù)制，并通過血液、淋巴傳播到唾液腺和其他器官，由此可知，限制WNV傳播能力的關(guān)鍵步驟在于蚊蟲的腸道屏障，該屏障主要依賴于產(chǎn)生抗菌肽和圍食基質(zhì)(由幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖蛋白和蛋白聚糖組成)作為物理和免疫屏障，共同限制病毒在昆蟲內(nèi)的復(fù)制和傳播[4-5]。WNV感染可激活無脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)(如Toll、JAK-STAT介導(dǎo)的先天免疫信號(hào)通路和抗菌肽)，從而限制其感染。另外，蚊蟲攜帶的沃爾巴克氏體細(xì)菌(一種共生細(xì)菌)，可以抑制WNV在昆蟲體內(nèi)的復(fù)制。

WNV感染機(jī)體后會(huì)呈現(xiàn)3個(gè)不同的階段，包括初始感染和傳播(早期階段)、外周病毒擴(kuò)增(內(nèi)臟器官傳播階段)和神經(jīng)侵襲(中樞神經(jīng)系統(tǒng)階段)。人體一旦被感染，機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)發(fā)揮不同程度的抗病毒作用：(1)先天免疫應(yīng)答包括細(xì)胞內(nèi)抗病毒防御、Ⅰ型干擾素(IFN)應(yīng)答和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(包括中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和γδT細(xì)胞)，協(xié)調(diào)WNV的早期控制；(2)適應(yīng)性免疫應(yīng)答包括體液和適應(yīng)性免疫細(xì)胞(CD4+、CD8+和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)介導(dǎo)的應(yīng)答。

在協(xié)助WNV傳播感染過程中，蚊蟲發(fā)揮了重要的作用。首先，根據(jù)蚊蟲種類的不同，每次叮咬可將多達(dá)106個(gè)噬斑形成單位(plaque forming unit，PFU)的病毒注入宿主體內(nèi)。蚊子唾液中除了含有阻斷宿主免疫反應(yīng)的病毒因子外，還含有抗止血、減少炎癥和改變宿主免疫的分子，導(dǎo)致宿主局部免疫反應(yīng)失調(diào)，包括細(xì)胞因子水平的改變、局部免疫抑制，減少中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)和T細(xì)胞向感染原發(fā)部位的募集等。

在突破皮膚表層結(jié)構(gòu)后，病毒首先感染角質(zhì)細(xì)胞和皮膚原位DCs(包括真皮DCs和朗格漢斯細(xì)胞)，隨后在引流淋巴結(jié)內(nèi)擴(kuò)增，導(dǎo)致病毒血癥并擴(kuò)散到脾臟等內(nèi)臟器官，其中，脾臟是病毒在外周組織中復(fù)制的主要場所。截止目前，WNV在脾臟和其他外周組織感染的特異性靶細(xì)胞尚不清楚，但被認(rèn)為可能與DCs、巨噬細(xì)胞的亞群，中性粒細(xì)胞有關(guān)。WNV感染的第3階段即嚴(yán)重危害感染者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。其主要發(fā)病機(jī)制依賴于病毒進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并在靶細(xì)胞(包括神經(jīng)元和髓細(xì)胞)內(nèi)的有效傳播能力。就病毒本身而言，其結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于侵襲神經(jīng)系統(tǒng)也有重要作用。研究顯示，WNV的E蛋白結(jié)構(gòu)上的N鏈接聚糖能夠控制神經(jīng)侵襲，但其具體機(jī)制尚未清楚，可能與內(nèi)皮細(xì)胞的滲透有關(guān)。神經(jīng)侵襲更常見的則是血腦屏障的破壞，這種變化主要由血管活性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)和基質(zhì)活化調(diào)節(jié)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化觸發(fā)。其他進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制還包括嗅覺神經(jīng)元感染和一種“特洛伊木馬”機(jī)制，其主要借助被感染的免疫細(xì)胞將病毒傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。綜上所述，病毒能夠通過多種方式感染宿主細(xì)胞，因此，細(xì)胞的免疫防御機(jī)制顯得尤為重要[6]。

2 WNV引起的細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)答

2.1 RLRs抗病毒機(jī)制先天性抗病毒防御對(duì)于控制WNV感染至關(guān)重要。這些防御包括Ⅰ型IFN(研究顯示IFN具有潛在的抵抗多種RNA病毒感染的能力)和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的抗病毒基因表達(dá)和后期細(xì)胞內(nèi)適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)生[7]。伴隨著免疫應(yīng)答的發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路同樣被激活，病毒的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)會(huì)被相應(yīng)的宿主細(xì)胞模式識(shí)別受體(pathogen-recognition receptors,PRRs)識(shí)別，例如視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣螺旋酶受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)活化過程中的PAMPs，主要包括視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ蛋白(retinoic-acid-inducible protein Ⅰ,RIG-Ⅰ)，黑素瘤分化抗原5(melanoma differentiation antigen 5,MDA5，亦稱IFIH1)和LPG2(亦稱DHX58)等，這些病毒模式識(shí)別受體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平升高，激活下游效應(yīng)子，最終導(dǎo)致IFN調(diào)節(jié)因子(IRF)介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄和Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[8]。體外WNV感染小鼠原代細(xì)胞的研究表明，RIG-Ⅰ在感染早期很重要，而MDA5的功能是維持和放大先天免疫反應(yīng)。這表明，WNV編碼的病毒PAMPs可以觸發(fā)RIG-Ⅰ和MDA5信號(hào)。在后期研究中發(fā)現(xiàn)，RIG-Ⅰ可以檢測(cè)正鏈和負(fù)鏈的WNV RNA，從而引起抗病毒免疫[9]。

2.2 TLRs抗病毒機(jī)制另一個(gè)關(guān)鍵的先天性免疫信號(hào)通路是由TLRs介導(dǎo)的。與RLRs類似，TLRs識(shí)別PAMPs，隨后激活下游信號(hào)通路，激發(fā)先天免疫防御應(yīng)答。其中，TLR3可識(shí)別雙鏈RNA (dsRNA)，而TLR7和TLR8可識(shí)別GU-rich ssRNA。隨著配體的結(jié)合，TLR3募集接頭分子TRIF (TIR域內(nèi)接頭誘導(dǎo)IFN-β)，并激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3、IRF7和核因子κB (NF-κB)，最終引起IFN-β的轉(zhuǎn)錄和Ⅰ型IFN和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[10]。TLR7和TLR8可在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，與ssRNA結(jié)合后，招募接頭分子MYD88，激活轉(zhuǎn)錄因子IRF7和NF-κB，從而引發(fā)Ⅰ型IFNs和促炎因子的表達(dá)[11]。

2.3 Ⅰ型干擾素信號(hào)介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制RLR和TLR信號(hào)都能激活I(lǐng)RF轉(zhuǎn)錄因子，尤其是IRF3和IRF7，它們對(duì)于調(diào)節(jié)病毒感染后的Ⅰ型IFN應(yīng)答至關(guān)重要[12]。這些IRFs可誘導(dǎo)Ⅰ型IFN分泌，并與IFN-α和IFN-β受體復(fù)合物(IFNAR)結(jié)合，激活受體相關(guān)的激酶如酪氨酸激酶2 (TYK2)和JAK1，隨后STAT1和STAT2發(fā)生磷酸化并引起ISG因子3 (ISGF3)復(fù)合物的組裝，該復(fù)合物由STAT1-STAT2異質(zhì)二聚體和IRF9組成[13]。該復(fù)合物形成后會(huì)移至細(xì)胞核并啟動(dòng)IFN刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄。此外，NF-κB激酶ε抑制劑(IKKε)可使STAT1的708位絲氨酸位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致ISGF3復(fù)合物的特異性發(fā)生改變，從而增強(qiáng)依賴IKKε抗病毒基因的表達(dá)[14]。雖然IRF3和IRF7均可限制病毒在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)制，不同細(xì)胞選擇激活的IRF也存在差異。在WNV感染的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和皮質(zhì)神經(jīng)元中，Ⅰ型IFN-α的誘導(dǎo)依賴于IRF3并被IRF7放大，而在DCs和巨噬細(xì)胞中，IFN轉(zhuǎn)錄僅需要IRF7[15]。而IRF3和IRF7的表達(dá)量降低并不會(huì)阻斷這些細(xì)胞中IFN-β的轉(zhuǎn)錄和ISG的表達(dá)，表明在RLR或TLR信號(hào)下游存在額外的IRFs或其他轉(zhuǎn)錄因子起協(xié)調(diào)作用，調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN分泌[16]。

2.4 炎性小體調(diào)節(jié)免疫程序炎性小體是一種先天免疫信號(hào)復(fù)合物，可通過分泌IL-1β家族的促炎細(xì)胞因子(包括IL-1β、IL-18和IL-33)調(diào)節(jié)免疫程序并促進(jìn)病毒的清除。IL-1β是一種多效細(xì)胞因子，具有雙向作用：一方面它可以通過促進(jìn)免疫細(xì)胞運(yùn)輸和分泌抵抗病原感染引起保護(hù)性免疫；另一方面它可以通過程序性細(xì)胞死亡，觸發(fā)病理反應(yīng)。

在多種類型炎性小體中，NLRP3(含NOD、LRR和pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3)炎性小體的激活以及隨后IL-1β家族促炎細(xì)胞因子的分泌被認(rèn)為與抵抗WNV感染有關(guān)[17]。研究顯示，感染W(wǎng)NV的患者在發(fā)病過程中全身IL-1β水平增加，而缺乏IL-1β信號(hào)或NLRP3的小鼠更容易感染W(wǎng)NV[18]。感染機(jī)理為IL-1β利用朗格漢斯細(xì)胞向引流淋巴結(jié)遷移以及CD45+巨噬細(xì)胞和病毒特異性CD8+T細(xì)胞向WNV感染小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移促進(jìn)免疫細(xì)胞運(yùn)輸?shù)絎NV感染部位[19-20]。

IL-1β與Ⅰ型IFN信號(hào)通路之間通過相互干擾控制WNV感染，當(dāng)選擇性抑制IL-1β或IFN-β其一，只能抑制部分WNV的復(fù)制，而同時(shí)抑制兩者后，神經(jīng)元細(xì)胞幾乎完全消除了WNV感染[21]。目前，這些途徑如何在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)(可能存在于其他細(xì)胞類型)聚合引起細(xì)胞的抗病毒作用機(jī)理尚未清楚，目前能夠確定的是，對(duì)WNV的有效免疫反應(yīng)可能依賴于IL-1β的保護(hù)功能和病理功能之間的平衡。

3 WNV的先天免疫逃避策略

隨著進(jìn)化演變，WNV已經(jīng)衍生出對(duì)抗先天免疫的機(jī)制。針對(duì)RLRs途徑，WNV主要通過被動(dòng)逃避，掩蓋或隔離病毒RNA，使其不被RLRs所識(shí)別。這種機(jī)制使得WNV能夠順利完成病毒粒子的組裝與合成，并有助于其阻斷下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)。

此外，WNV也被證實(shí)具有干擾Ⅰ型IFN表達(dá)的作用[22]。WNV非結(jié)構(gòu)蛋白通過溶酶體和蛋白酶體依賴的途徑介導(dǎo)IFNAR1的降解；WNV逃避IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的其他策略包括將細(xì)胞膽固醇重新分配到病毒復(fù)制復(fù)合體的位置，從而改變膜相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以有利于病毒的復(fù)制及非編碼亞基因組RNA的合成，后者已被確定為IFN拮抗劑[22-23]。目前已知的WNV結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白(包括NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5)都被報(bào)道能夠通過不同機(jī)制積極協(xié)助WNV逃逸IFIT1(IFIT1是一種ISG蛋白，被病毒感染誘導(dǎo)后高表達(dá)，在多條信號(hào)通路中發(fā)揮抗病毒作用)的抗病毒作用[24]。

4 WNV的免疫防控策略

目前尚沒有WNV疫苗或批準(zhǔn)的治療方法用于人類預(yù)防或治療WNV感染。由于WNV的出現(xiàn)和持續(xù)傳播在世界各地造成重大的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)，迫切需要制定干預(yù)戰(zhàn)略。目前，WNV的研究主要集中在確定宿主信號(hào)成分和調(diào)節(jié)免疫感染的途徑。這些研究揭示了感染細(xì)胞和組織內(nèi)的調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)，利用它們影響細(xì)胞和適應(yīng)性免疫對(duì)WNV感染的某些特征反應(yīng)，篩選出能夠引起人體免疫反應(yīng)的最佳抗原片段，為后期WNV疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

WNV主要在老年人中引起嚴(yán)重疾病，且年齡越大，免疫衰老和免疫反應(yīng)性降低就越相關(guān)。要使WNV疫苗對(duì)老年人達(dá)到充分保護(hù)性，可能需要其能夠誘導(dǎo)一種強(qiáng)大的、持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)。迄今為止，中和抗體是保護(hù)黃病毒感染的最可靠屏障之一。此外，WNV特異性T細(xì)胞同樣發(fā)揮著重要的作用[17]。臨床試驗(yàn)表明，WNV嵌合病毒候選疫苗可誘導(dǎo)WNV E蛋白特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)長達(dá)1年[25]。

通過對(duì)WNV感染和免疫過程的解析有利于探明宿主對(duì)病原體的免疫應(yīng)答機(jī)制，包括先天性免疫防御、Ⅰ型干擾素抗病毒機(jī)制和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫控制機(jī)制。揭示這些機(jī)制為后續(xù)開發(fā)WNV特異性疫苗提供了重要的參考價(jià)值，但仍有幾個(gè)問題有待解決。首先需要進(jìn)一步確定細(xì)胞和組織特異性基因表達(dá)的環(huán)境依賴性功能以及編碼蛋白的作用機(jī)制。其次，一些研究已經(jīng)確定了介導(dǎo)免疫逃避的病毒因子，但作用機(jī)制尚不清楚。目前，特異性針對(duì)WNV的載體疫苗尚未開發(fā)出來，更多是通過切斷傳染源限制病毒的感染，因此研發(fā)WNV疫苗意義重大。