異尖線蟲檢測技術(shù)研究進(jìn)展

陳秀琴，劉曉雷，林鋒強(qiáng)，白 雪* (1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 13006)

異尖科線蟲屬于線蟲動物門(Nematode)尾感器綱(Phasmida)蛔目(Ascaridata)，主要包括4個屬：異尖線蟲屬(Anisakis)，偽地新線蟲屬(Pseudoterranova)，對盲囊線蟲屬(Contracaecum)及宮脂線蟲屬(Hysterothylacium)[1]。人通過食用生的、腌制的或未煮熟的含異尖科線蟲某些種的活的第三期幼蟲的海魚而引發(fā)異尖線蟲病[2]。這些線蟲主要包括異尖線蟲屬和偽地新線蟲屬，偶爾見于對盲囊線蟲屬[3-4]，其中，異尖線蟲屬中的簡單異尖線蟲(A.simplex)和派氏異尖線蟲(A.pegreffii)是異尖線蟲病的主要病原[5]。

自20世紀(jì)60年代由荷蘭科學(xué)家首次報道異尖線蟲病以來[6]，該病已在全球各地均有報道。最新數(shù)據(jù)表明異尖線蟲病在全球的發(fā)病率估計為0.000 32%[7]。歐洲食品安全局報道2010年以前全世界大概有20 000異尖線蟲病病例，其中高于90%的病例數(shù)來自日本[8]。在歐洲，西班牙的異尖線蟲病病例數(shù)最多，主要是由于當(dāng)?shù)厥秤谩按着蔌P尾魚”的習(xí)慣。通過定量風(fēng)險評估發(fā)現(xiàn)，西班牙人每餐食用未經(jīng)處理的生的或腌制的鳳尾魚，可能會攝入0.66條異尖線蟲，每進(jìn)食一餐鳳尾魚感染異尖線蟲病的概率為9.56 × 10-5%[9]。

1993年，我國將異尖線蟲病列入《中華人民共和國禁止進(jìn)境的動物傳染病、寄生蟲病名錄》，是我國禁止入境的二類寄生蟲病。由于該病無特異性臨床癥狀，因此常被誤診[10]。此外該病也不存在人傳人[9]。

隨著生食海魚飲食方式的逐漸流行，異尖線蟲病的感染率及發(fā)病率可能將有所增長。因此，開展海魚及其相關(guān)產(chǎn)品中異尖線蟲的檢測工作至關(guān)重要。本研究主要對國內(nèi)外異尖線蟲檢測技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 異尖線蟲的生活史及其在海魚中的感染情況

1.1 生活史見圖1。異尖線蟲的成蟲寄生于海洋哺乳動物，包括鯨類動物(如鯨魚、海豚)和鰭足類動物(如海象、海豹)的消化道內(nèi)[2,11]。雌雄成蟲交配產(chǎn)卵并隨糞便排入海水中，蟲卵在海水中孵化，經(jīng)兩次蛻皮后發(fā)育為第三期幼蟲(L3)。第二期幼蟲(L2)可在海水中存活3～4個月，此時，小型浮游甲殼類動物為儲存宿主，在儲存宿主體內(nèi)，幼蟲仍然具有感染性，但不繼續(xù)發(fā)育[12]。感染了異尖線蟲幼蟲的甲殼類動物被海魚或頭足類動物捕食，在消化過程中釋放L3幼蟲，并移動到腸系膜和肌肉，被捕食后再轉(zhuǎn)移到其他中間宿主。此時，中間宿主攜帶的L3幼蟲對人類和終末宿主已經(jīng)具有感染性。終末宿主海洋哺乳動物捕食中間宿主魚或魷魚，L3幼蟲在胃黏膜中發(fā)育為成蟲[2,13]。

圖1 異尖線蟲的生活史

1.2 海魚中異尖線蟲的感染情況異尖線蟲分布十分廣泛，中間宿主(海魚類、頭足類)和終末宿主(鯨類、鰭足類)的感染在世界各大水域均存在。據(jù)報道有200種魚類和25種頭足類動物寄生異尖線蟲[14]。感染率較高的海魚主要有鱈魚、鯡魚、巖魚等，此外鮭魚、鯖等也有感染的報道[13]。

1992年，我國首次從進(jìn)境海魚中檢出異尖線蟲。隨后，山東等多個地區(qū)均從海魚體內(nèi)檢出異尖線蟲，且感染率較高。對我國臺灣海峽的海魚進(jìn)行異尖科線蟲感染情況調(diào)查，采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法檢測190種魚506尾魚，結(jié)果表明有138種魚感染異尖科線蟲，對其中45種魚感染異尖科線蟲幼蟲做進(jìn)一步鑒定，共發(fā)現(xiàn)8種異尖線蟲，其中宮脂屬線蟲具有較高的感染率和較強(qiáng)的感染強(qiáng)度，五點斑鲆(Pseudorhombusquinquocellatus)和雜斑狗母魚(Synodusvariegat)異尖線蟲幼蟲感染強(qiáng)度均較高[15]。KONG等[16]對中國東海域的帶魚、小黃花魚、馬鮫魚進(jìn)行異尖科線蟲感染情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率高達(dá)95.1%(116/122)，7種屬于異尖屬和宮脂線蟲屬(Hysterothylacium)，其中84.8%為派氏異尖線蟲，0.6%(4/619)為簡單異尖線蟲，1.5%(9/619)為典型異尖線蟲，表明我國東海海魚以感染A.pegreffii為主。林陳鑫等[17]對福建省沿海3大漁場的海魚進(jìn)行異尖科線蟲幼蟲感染調(diào)查，解剖32種海魚共810尾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異尖線蟲幼蟲感染率為34.2%(277/810)，不同海魚的感染程度存在差異，帶魚、馬鮫魚、海鯽魚和包公魚的感染率較高，分別為 85.6%(95/111),63.5%(47/74),36.7%(67/162),36.7%(18/49)?？傮w來看，我國近海海魚的異尖科線蟲感染程度較為嚴(yán)重，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)防控。

2 危害

異尖科線蟲對人體的危害可概況為兩方面：破壞消化道和引起過敏反應(yīng)。幼蟲一旦進(jìn)入人體，約93.2%寄生在胃部，2.6%寄生在腸道，其余部位幾乎可以忽略[18]。急性感染時，寄生在胃部的幼蟲會導(dǎo)致明顯的上消化道癥狀，如6 h內(nèi)突然出現(xiàn)腹痛，而寄生在腸道的幼蟲較少引起腸道癥狀[19]。慢性感染時，幼蟲鉆入胃腸壁黏膜，損害胃腸壁，造成潰瘍、嗜酸性肉芽腫[20]。

另一方面，異尖線蟲可引起過敏反應(yīng)，其中簡單異尖線蟲是引起過敏反應(yīng)最主要的蟲種[21]。目前已經(jīng)從蟲體及其分泌物中發(fā)現(xiàn)了14種過敏原，其中Ani s 1(24 kDa)和Ani s 7(139 kDa)是最重要的過敏原[13,22]。這些過敏原在高溫和低溫條件下都非常穩(wěn)定。有文獻(xiàn)報道，用被異尖線蟲污染的魚粉配制飼料并飼喂畜禽，人通過食用畜禽肉甚至能引起過敏[23]。過敏反應(yīng)一般發(fā)生在食用被異尖線蟲幼蟲污染的食物60～120 min后，以血管性水腫、蕁麻疹和超敏反應(yīng)綜合征為臨床癥狀[24]。異尖科線蟲不僅危害人類身體健康，還會導(dǎo)致消費者抵制海魚產(chǎn)品，對漁業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[25]。

此外，異尖線蟲還具有一定的科研價值。由于自然界中的各種生物都是相互關(guān)聯(lián)的，一種生物發(fā)生變化具有一定的指示意義。異尖線蟲種類及流行病學(xué)發(fā)生改變可以用來預(yù)測全球氣候變化和海洋生態(tài)變化[26]。例如，簡單異尖線蟲的整個發(fā)育周期受水溫的影響[27]。隨著海水溫度的升高，該蟲種的生存范圍可能會擴(kuò)大到其他新海域，進(jìn)而導(dǎo)致更多的海魚感染異尖線蟲[28-29]。還有文獻(xiàn)報道，海洋中的異尖線蟲能夠富集更多的重金屬從而有助于海魚的生存，因此異尖線蟲可指示環(huán)境中重金屬的污染程度[30]。

3 檢測技術(shù)

目前，異尖線蟲的檢測技術(shù)主要包括物理學(xué)方法(燈檢法、紫外光-壓片法成像技術(shù))、酶解消化法和生物學(xué)方法(免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和蛋白質(zhì)組學(xué))。

3.1 燈檢法該方法是目前工廠檢測海魚中異尖科線蟲的主要方法。包括日光燈檢法和紫外燈檢法。日光燈檢法適用于諸如鱈魚等白色魚肉的檢測?？拷~片表面的異尖線蟲呈現(xiàn)出紅棕色或乳白色，而嵌入深層肉的蟲體呈現(xiàn)陰影。紫外燈檢法適用于諸如馬哈等紅色魚肉的檢測。若魚肉中含有蟲體則被激發(fā)出熒光[31]。該方法受魚片厚度、形狀、質(zhì)地、顏色和魚品種等多種因素的影響，且結(jié)果的判定需要專業(yè)技術(shù)人員[32]。

3.2 紫外光-壓片法(UV-Press)該方法是將紫外光燈檢法與壓片法結(jié)合起來的方法。具體操作方法是將海魚切成1～2 mm薄片，置于透明袋中用壓片設(shè)備將魚片壓實，將魚片放在-18℃冷凍至少12 h，在366 nm紫外線的照射下觀察是否有幼蟲[33]。異尖線蟲幼蟲發(fā)明亮的熒光，因而容易被檢測[34]。該方法的檢測準(zhǔn)確度明顯高于燈檢法，能將燈檢法不能檢測到的50.9%幼蟲檢測到[34]。

3.3 酶解消化法該方法是利用蛋白酶對海魚和蟲體消化能力的差異，結(jié)合過濾、沉降等手段從而將蟲體分離出來，用肉眼或者顯微鏡觀察，最終確定蟲種[35]。該方法適用于實驗室。對紫外光-壓片法和酶解消化法進(jìn)行比較，結(jié)果表明紫外光-壓片法的準(zhǔn)確度和靈敏度均可達(dá)到100%，而酶解消化法的準(zhǔn)確度和靈敏度分別為98%和96%，紫外光-壓片法的重復(fù)性略高于酶解消化法[36]。因此酶解消化法的準(zhǔn)確度、靈敏度和重復(fù)性與紫外光-壓片法均相當(dāng)。

3.4 免疫學(xué)方法目前發(fā)現(xiàn)的異尖科線蟲的抗原包括蟲體抗原、排泄分泌抗原和表面抗原[37]。異尖科線蟲相關(guān)免疫學(xué)方法的研發(fā)多數(shù)基于蟲體抗原和排泄分泌抗原。免疫學(xué)方法的應(yīng)用包括異尖科線蟲抗原檢測及異尖線蟲病診斷兩方面。

傳統(tǒng)的檢測方法如目檢法、壓片法、酶解消化法都是基于蟲體的形態(tài)學(xué)，對于深加工魚產(chǎn)品如魚醬、沙拉、罐頭等則不適用，這些食品蛋白質(zhì)含量很高，用免疫學(xué)方法檢測更合適[38-39]。例如，WERNER等[40]建立的夾心ELISA 方法可實現(xiàn)對魚產(chǎn)品和海鮮中簡單異尖線蟲蛋白的定量，檢測限度為每克樣品檢出1.1 μg蟲體蛋白。KOCHANOWSKI等[39]分別建立了化學(xué)發(fā)光夾心ELISA法和化學(xué)發(fā)光競爭ELISA法用于檢測食品中簡單異尖線蟲，分別用0.05，0.5，5.0，50.0，100.0，200.0，300.0，400.0 μg/L的簡單異尖線蟲抗原人工污染魚罐頭，經(jīng)高壓蒸汽處理(100℃ 60 min)，證明兩種方法的檢測限度分別為0.5,5.0 μg/L，批內(nèi)準(zhǔn)確度(CV%)分別為1.5%～4.3%，5.1%～7.5%，批間準(zhǔn)確度(CV%)分別為2.7%～7.7%，6.2%～13.5% ，表明所建立的化學(xué)發(fā)光夾心ELISA法更適合用于檢測簡單異尖線蟲抗原。

3.5 分子生物學(xué)方法

3.5.1PCR技術(shù) 由于通過形態(tài)學(xué)不容易鑒定線蟲，而PCR等分子生物學(xué)方法具有靈敏度高等優(yōu)點，近些年來已經(jīng)被應(yīng)用于寄生蟲的檢測。因此，有人建議應(yīng)用PCR方法對靶標(biāo)18S核糖體RNA位點的序列同源性進(jìn)行線蟲鑒定。選擇特異性靶基因是設(shè)計引物的關(guān)鍵，通常用線粒體DNA(mtDNA)的cox1基因[41]、cox2基因[42]，小核糖體RNA(ssrRNA)，核糖體大亞基(lsrRNA)，核糖體DNA(rDNA)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS1、ITS2)鑒別異尖科線蟲[43-44]。PAOLETTI等[45]選用rDNA的ITS和mtDNA的cox2、rrnS基因分別設(shè)計引物，通過PCR及測序成功鑒別派氏異尖線蟲、簡單異尖線蟲和二者的復(fù)合蟲體。TIMI等[43]用rDNA的ITS-1、ITS-2和mtDNA 的cox2基因分別設(shè)計引物，建立了用于鑒別偽地新線蟲屬的PCR方法，用該方法結(jié)合測序和進(jìn)化樹分析首次證明西南大西洋海域的海魚寄生偽地新線蟲屬L3幼蟲。

熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)可定性和定量分析結(jié)果，靈敏度比普通PCR高。該技術(shù)已被應(yīng)用于檢測異尖科線蟲。RT-PCR包括探針法和熒光染料法。FANG等[46]基于rDNA的ITS-2序列建立了檢測派氏異尖線蟲的Taq Man RT-PCR方法，并證明具有高度特異性。PAOLETTI等[47]建立了鑒別異尖屬和偽地新線蟲屬的RT-PCR方法，該法能夠鑒定A.simplex(s.s.)，A.pegreffii，P.decipiens(s.s.)，P.krabbei和P.bulbosa5種異尖屬蟲種。用熒光染料SYBR Green建立的RT-PCR方法也可用于海魚及海魚產(chǎn)品的異尖線蟲的定量分析，檢測限度為每克食品基質(zhì)檢測0.3 ng 的A.simplex(s.l.) DNA[48]。此外，多重RT-PCR也應(yīng)用于檢測異尖屬和偽地新線蟲屬，檢測限度分別為0.32,1.60 μg/ L[49]。

3.5.2環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP) LAMP技術(shù)具有反應(yīng)時間短，操作簡便等優(yōu)點。CAMMILLERI等[50]報道用LAMP技術(shù)可鑒別異尖屬、偽地新線蟲屬和宮脂線蟲屬，靈敏度比RT-PCR低100倍。

3.5.3聯(lián)用技術(shù) 有些異尖線蟲并非只包含一種蟲種，例如，A.simplexs.1.包含派氏異尖線蟲、簡單異尖線蟲和二者的復(fù)合蟲體，因此，分子生物學(xué)方法還需要與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用才能更好地鑒別異尖線蟲。例如，PCR技術(shù)結(jié)合限制片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)或單核苷酸構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)能夠提高鑒別類似種屬寄生蟲的準(zhǔn)確度[51]。RFLP 方法利用Hinf、TaqⅠ酶切ITS序列，AccⅠ和AvrⅡ 酶切mtDNA的cox2基因，TscAⅠ、Hin1Ⅱ酶切β微管蛋白基因可以鑒別異尖線蟲屬的多個蟲種[52]。GMEZ-MATEOS等[52]分別擴(kuò)增rDNA 的ITS1-5,8S-ITS2序列、mtDNAcox2基因和高保守的β微管蛋白基因，隨后分別進(jìn)行RFLP，該方法能鑒別簡單異尖線蟲、派氏異尖線蟲和二者的復(fù)合蟲種。PCR-RFLP技術(shù)與高分辨溶解曲線(high resolution melting,HRM)技術(shù)聯(lián)用用于鑒別異尖屬的派氏異尖線蟲和簡單異尖線蟲兩個種[53]。

LAMP技術(shù)結(jié)合側(cè)向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)具有獨特的優(yōu)勢。喬艷等[54]建立的LAMP-LFD可以特異性檢測出簡單異尖線蟲和派氏異尖線蟲，整個檢測過程只需50 min。

3.6 成像技術(shù)

3.6.1高光譜成像技術(shù) 該方法是一種無損檢測技術(shù)，通過結(jié)合傳統(tǒng)的成像和光譜學(xué)，從而獲得空間信息和光譜信息，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域[55]。應(yīng)用該方法能夠無干擾地顯示出異尖線蟲在鱈魚魚片中的位置[34]，且在水產(chǎn)加工廠應(yīng)用的檢出率和燈檢法的檢出率相當(dāng)[56]。為了提高該方法的檢出率，可以將統(tǒng)計學(xué)的圖像處理和圖譜結(jié)合起來分析。

3.6.2紫外線技術(shù) 包括紫外成像法和紫外熒光成像法，分別用到紫外線檢測儀和CCD成像設(shè)備。紫外熒光成像法利用寄生蟲熒光特性與魚肉熒光特性的不同，從而實現(xiàn)檢測寄生蟲。早在 1970 年就有研究者報道異尖線蟲的紫外熒光性質(zhì)[57]。在360 nm紫外光照射下，異尖線蟲幼蟲可發(fā)出白色熒光，從而與被檢魚肉區(qū)分。YANG等[58]建立了基于主成分分析和灰度值分析的紫外熒光成像法，該方法的檢出率高于80%。紫外熒光成像法可實現(xiàn)自動化檢測海魚及其產(chǎn)品[59]。

3.7 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是對蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)相互作用等進(jìn)行研究的學(xué)科[60]。該方法可用于鑒定和定量細(xì)胞的蛋白質(zhì)組成、細(xì)胞的亞組分或細(xì)胞在某一時刻分泌物，還可用于闡明生命在生理或病理狀態(tài)下的變化機(jī)制[61]。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)對寄生蟲的特異性蛋白進(jìn)行鑒定有助于診斷寄生蟲病和開發(fā)抗寄生蟲藥。

由于基于核酸檢測的分子生物學(xué)方法檢測到蟲體DNA與樣品中是否含蟲體致敏蛋白并不存在必然關(guān)系，只有幼蟲分泌的致敏蛋白才會導(dǎo)致過敏反應(yīng)。因此，檢測樣品中是否含致敏蛋白至關(guān)重要。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)也開始被應(yīng)用于異尖線蟲致敏蛋白的鑒定及定量檢測。CARREARA等[62]以Ani s 9蛋白中的多肽作為標(biāo)志物，采用平行反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜分析法檢測異尖線蟲(A.simplex和P.krabbei)，檢測時間不到2 h。FASTE等[63]將異尖線蟲的血紅蛋白(Ani s 13)和SXP/RAL-2蛋白(Ani s 5,Ani s 8,Ani s 9)的多肽作為報告基團(tuán)，采用無標(biāo)記的nLC-nESI-OrbitrapMS/MS半定量方法檢測緩沖液和三文魚基質(zhì)，檢測限度分別為1，10 mg/L，而采用LC-TripleQ-MS/MS絕對定量方法檢測緩沖液和三文魚基質(zhì)，檢測限度分別為0.10，2.0 mg/L。由于蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測成本高，該方法主要用于驗證海魚及其相關(guān)產(chǎn)品中是否含異尖線蟲致敏蛋白。

3.8 其他檢測技術(shù)其他檢測方法還包括擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)(amplification refractory mutation system,ARMS-PCR)、核磁共振法和電磁波法等。KIM等[64]建立的ARMS-PCR方法能鑒別簡單異尖線蟲和派氏異尖線蟲，結(jié)果與PCR-RFLP和ITS測序完全一致，該法與PCR-RFLP法相比，具有檢測快速、操作簡單和成本低的優(yōu)點。

核磁共振法是一種新型的檢測異尖科線蟲的方法，具有靈敏、不損害魚產(chǎn)品等優(yōu)點，但是需要昂貴的硬件設(shè)備、專業(yè)技術(shù)人員，數(shù)據(jù)采集速度慢(每條魚需要13 min)，而且也不適用于冷凍魚產(chǎn)品[65]。

電磁波法是基于含寄生蟲的魚肉區(qū)域與無寄生蟲魚肉區(qū)域致密性的差異，使得磁場發(fā)生變化，從而確定魚肉中是否含有寄生蟲[31]。該方法需要用到超導(dǎo)量子干涉測磁裝置(SQUID)，價格昂貴，因而，在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。

異尖線蟲各種檢測方法的比較如表1所示。

表1 不同異尖線蟲檢測方法比較

4 展望

目前，異尖線蟲的檢測技術(shù)仍然主要依賴傳統(tǒng)方法。在歐盟，管理條例(No 2074/2005)要求對海魚及海魚產(chǎn)品進(jìn)行目檢，大多數(shù)參考實驗室采用酶解消化法或紫外光-壓片法。總體來看，本研究所羅列的方法均存在局限，很難只要一種方法即可得到檢測或鑒定結(jié)果，也沒有一種方法可作為國際公認(rèn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。在已有的條件下更可取的辦法是聯(lián)合使用不同的檢測方法。例如，對于大量檢測的樣品，可先采用燈檢法進(jìn)行初步篩選，再用酶解消化法等方法進(jìn)一步驗證。同時還要開發(fā)更多檢測快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的商品檢測試劑盒。相信隨著分子生物學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，將會開發(fā)出更多異尖線蟲檢測方法，從而將異尖線蟲病的危害降到最低。