羥基紅花黃色素A對LPS誘導(dǎo)的羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用

段景龍，宣超瑩，劉茂軍，馬玉忠* (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 0700；.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 004)

近年來，我國羊養(yǎng)殖量越來越大[1]，羊的各種疾病也隨之而來，尤其是生殖類疾病[2]。子宮內(nèi)膜炎是常見的羊生殖類疾病，該病發(fā)生的主要原因是當(dāng)難產(chǎn)、流產(chǎn)及胎衣不下時病原菌侵入子宮[3]。導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的病原菌主要為大腸桿菌，脂多糖作為其主要活性成分在致病過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。目前常用的治療子宮內(nèi)膜炎的方法是抗生素和激素療法，但抗生素的大量使用會造成耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，并且抗生素殘留會對人類健康造成不良影響，這給養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展、公共衛(wèi)生及食品安全帶來了巨大影響。因此，急需尋找一種安全高效且可保護(hù)子宮內(nèi)膜的藥物。羥基紅花黃色素A(HYSA)是紅花中最主要的水溶性成分，該成分屬于查耳酮類化合物[6]，具有抗炎等作用。研究發(fā)現(xiàn)，HYSA可以減弱香煙煙霧提取物對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，降低炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α在細(xì)胞上清的表達(dá)量[7]。本試驗用脂多糖(LPS)構(gòu)建羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)模型，用HYSA處理，探究其對LPS誘導(dǎo)的羊子宮內(nèi)膜炎性上皮細(xì)胞的影響，以便為HYSA的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2歲左右健康綿羊，體質(zhì)量25～30 kg，來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。在溫度16～28℃，相對濕度40%～60%條件下飼養(yǎng)。該研究經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物管理委員會批準(zhǔn)實驗。

1.2 主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基由Gibco公司提供；HYSA購自上海綠源生物科技有限公司；Hepes、CCK-8溶液和臺盼藍(lán)購自北京索萊寶科技有限公司；LPS購自Sigma公司；胎牛血清由杭州四季青公司提供；羊TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自DG Biotech公司；p-JNK、p-p38抗體購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.3 羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)在無菌條件下取羊子宮角，用含有雙抗的PBS漂洗3次，去除結(jié)締組織及脂肪，剖開子宮角，取子宮內(nèi)膜，修剪成3 mm×3 mm×2 mm大小的組織塊，放入6孔板內(nèi)，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。次日，加入2 mL 含有15% FBS的DMEM/F12，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次，觀察細(xì)胞生長狀況，并在10 d左右去除組織塊。

1.4 細(xì)胞傳代待孔內(nèi)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底的80%～90%時，去除培養(yǎng)基，每孔用2 mL PBS洗2次，每孔加入500 μL 0.25%的胰酶，于37℃消化2 min，當(dāng)顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞開始變圓、回縮、細(xì)胞間隙變大后，每孔加入1 mL含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，刮取細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 CCK-8法檢測HYSA對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活力的影響將處于對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞消化下來并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，按照100 μL/孔將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。棄舊培養(yǎng)基，加入10，20，40，60，80，100 mg/L HYSA，每個質(zhì)量濃度設(shè)5個重復(fù)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的吸光度。

1.6 HYSA處理將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞稀釋成5×105個/mL，按1 mL/孔將細(xì)胞懸液接種于24孔板中。隨機分為5組：對照組、LPS處理組、60 mg/L HYSA處理組、80 mg/L HYSA處理組、100 mg/L HYSA處理組。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底的80%～90%后，去除舊培養(yǎng)基，對照組加入新的培養(yǎng)液，其余各組加入50 mg/L LPS。12 h后，用60，80，100 mg/L HYSA處理12 h。

1.7 IL-1β、IL-6和TNF-α的含量檢測收集24孔板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液，10 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.8 Western blot法檢測p-p38、p-JNK蛋白的表達(dá)提取總蛋白，測定蛋白濃度。取38 μg總蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE分離，通過半干法轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜，加入p-p38、p-JNK抗體(1∶1 000稀釋)，常溫孵育2 h，用TBST洗膜，加入堿磷酶標(biāo)記二抗(1∶2 000稀釋)，孵育1 h，用TBST洗膜，用BCIP/NBT顯色。

2 結(jié)果

2.1 羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)觀察倒置顯微鏡下可見，培養(yǎng)9 d時，細(xì)胞呈離散型從組織塊向周圍爬出(圖1A)； 14 d時，細(xì)胞鋪滿整個孔底，多為上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(圖1B)；純化后獲得子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，呈鋪路石狀(圖1C)。

A.培養(yǎng)9 d時細(xì)胞從組織塊遷出；B.培養(yǎng)14 d時的羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞；C.純化后的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞圖1 羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)

2.2 HYSA對羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的影響如表1所示，通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，用10，20，40，60，80，100 mg/L HYSA處理12，24 h，對羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生長均有促進(jìn)作用(P<0.01)，80 mg/L 時促進(jìn)增殖的效果最好。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞經(jīng)HYSA處理12 h的活力比24 h高，因此選用80 mg/L HYSA處理羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，時間為12 h。

表1 HYSA對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖活力的影響 %

2.3 HYSA對LPS誘導(dǎo)的羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響如表2所示，用60，80，100 mg/L HYSA作用經(jīng)LPS處理12 h的羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，12 h后，細(xì)胞上清中IL-β、IL-6和TNF-α的含量均有所下降，其中60，100 mg/L HYSA處理組的IL-1β、IL-6含量與模型組相比無顯著性差異； 80 mg/L HYSA處理組的IL-1、IL-6含量與模型組相比顯著降低(P<0.05)；60，80，100 mg/L HYSA處理組的TNF-α含量與對照組相比極顯著降低(P<0.01)。

表2 HYSA對子宮內(nèi)膜上皮炎性細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的影響 ng/L

2.4 HYSA對LPS誘導(dǎo)的羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞p-p38、p-JNK含量的影響利用 Western blot檢測p-p38、p-JNK蛋白含量，結(jié)果見圖2，與對照組相比，LPS 處理后p-p38、p-JNK蛋白水平顯著升高(P<0.01)，80，100 mg/L HYSA處理組的p-p38、p-JNK含量與模型組相比極顯著降低(P<0.01)；60 mg/L HYSA處理組p-JNK含量與模型組相比極顯著降低(P<0.01)，p-p38含量與模型組相比無顯著變化。

*表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與模型組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)圖2 HYSA對LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜上細(xì)胞p-p38、p-JNK蛋白表達(dá)的影響

3 討論

子宮內(nèi)膜炎是常見的母羊生殖器官疾病，會影響母羊早期的妊娠，造成母畜的不孕[8]。引起子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的原因多種多樣，主要原因是病原微生物入侵機體所致。大腸桿菌作為一種革蘭陰性菌，是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的主要致病菌之一[2]。革蘭陰性菌細(xì)胞壁內(nèi)的LPS在細(xì)菌死亡時會被釋放，與Toll樣受體4結(jié)合，激活機體免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，促使機體發(fā)生炎癥[9]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是炎癥早期產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)活性，可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附到上皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致機體產(chǎn)生局部炎性反應(yīng)[10]。IL-1β是一種致炎性因子，參與誘導(dǎo)炎癥，可以促進(jìn)黏附分子的分泌，且可以誘導(dǎo)IL-6的分泌[11]。IL-6是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，IL-6濃度的變化可以在一定程度上反映疾病的變化[12]。張興云等[9]研究發(fā)現(xiàn)，藏羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞經(jīng)過大腸桿菌刺激后會導(dǎo)致炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量增加。本試驗中，用50 mg/L LPS刺激綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞12后，IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量顯著增加，說明綿羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥，炎癥模型構(gòu)建成功。

HYSA是一種重要的黃酮類化合物，是中藥紅花的重要成分，具有抗炎、抗腫瘤等功效[13]。張園等[14]對大鼠采取灌胃的方式飼喂HYSA，發(fā)現(xiàn)HYSA可降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中炎性因子IL-6和TNF-α的水平，并降低了NF-κB蛋白的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，說明HYSA可以抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞損傷。DONG等[15]采用腹腔注射HYSA治療急性軟組織損傷的小鼠，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過HYSA治療后，小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量降低，肌肉中p-p38 MAPK含量降低，說明HYSA可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化，從而降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)[15]。本試驗結(jié)果顯示，HYSA可以降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，在質(zhì)量濃度為80 mg/L時，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量與模型組相比顯著降低，表明80 mg/L HYSA對LPS誘導(dǎo)的羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用最佳。

MAPK信號通路是哺乳動物體內(nèi)重要的傳導(dǎo)通路之一，它可被LPS激活，進(jìn)而產(chǎn)生酶促級聯(lián)反應(yīng)，將刺激傳遞至細(xì)胞內(nèi)引起生物學(xué)反應(yīng)[16]。JNK、ERK、p38/MAPK信號通路是MAPK信號通路的組成部分。JNK、p38/MAPK信號通路與炎癥相關(guān)。李金等[17]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以抑制p-JNK、p-p38蛋白的活化，降低RAW264.7細(xì)胞的炎性反應(yīng)。本試驗結(jié)果表明，HYSA可以降低p-JNK、p-p38蛋白的表達(dá)，說明HYSA可以降低p-JNK/MAPK、p-38/MAPK信號通路的活化，從而抑制炎性反應(yīng)進(jìn)程。