AEE在人工胃/腸液和腸道菌群及生物樣品中的穩(wěn)定性

陶 琦，秦 哲，白莉霞，劉希望，李世宏，楊亞軍，李劍勇 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050)

阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester,AEE)是利用結(jié)構(gòu)拼合的前藥原理，以丁香酚對(duì)阿司匹林進(jìn)行酯化修飾而合成的一種新型藥用化合物，其降低了阿司匹林對(duì)胃腸道的刺激性，同時(shí)增強(qiáng)了揮發(fā)油丁香酚的穩(wěn)定性。研究表明，AEE具有確切的抗炎[1]、抗氧化[2-3]、降血脂[4-5]、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[6-7]和預(yù)防血栓形成[8-10]和抗急性肝損傷[11]等作用，效果優(yōu)于前體藥物阿司匹林和丁香酚，具有很好的成藥性。

口服是最為便捷的給藥途徑之一，但大多數(shù)藥物經(jīng)口服給藥后，會(huì)受到胃腸道中多種因素的影響[12]，如胃液的酸性和腸液的堿性環(huán)境、胃腸道消化酶、腸道上皮細(xì)胞中的酶，以及腸道菌群的影響等，使其在到達(dá)作用部位前發(fā)生降解和代謝[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠及犬口服給藥后，血漿中AEE及其前體藥物阿司匹林、丁香酚的濃度均極低，而代謝產(chǎn)物水楊酸的濃度較高[14-15]。本研究采用高效液相色譜法(HPLC)，考察了AEE在人工胃/腸液和組織樣品中的穩(wěn)定性，同時(shí)考察了SD大鼠腸道菌群對(duì)AEE的降解作用，為后續(xù)的制劑設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑AEE對(duì)照品(含量99.8%，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所自制，批號(hào)：20190815)；丁香酚對(duì)照品(含量99.95%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：20032206)；水楊酸(含量99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100106-201605);烏拉坦(NJKOCED，梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司);胰蛋白酶(酶活：250 NFU/mg，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：T8150)；胃蛋白酶(酶活：3 000-3 500 NFU/g,北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P8390);磷酸鹽緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：D1040-500)；厭氧培養(yǎng)基(CM1513 北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)；鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器超高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器，品牌:安捷倫，型號(hào):1290；勻漿機(jī)(IKA?T25easy clean digital)；厭氧培養(yǎng)箱(Thermo Forma 1029)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6只清潔級(jí)SD大鼠，雄性，8～10周齡，體質(zhì)量210～230 g，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：NKMYD201907018。

1.4 溶液的制備

1.4.1儲(chǔ)備液與溶液 分別稱(chēng)取AEE、水楊酸和丁香酚對(duì)照品適量，以乙腈溶解制成質(zhì)量濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液，于4℃儲(chǔ)備。使用前用乙腈稀釋得到相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

1.4.2人工胃液的制備 按文獻(xiàn)[16]方法，取稀鹽酸(鹽酸234 mL，加水稀釋至1 000 mL)16.4 mL，加水約800 mL，胃蛋白酶10 g，搖勻后，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH=1.3，加水稀釋并定容到1 000 mL，即得人工胃液。空白人工胃液的配制：除不含胃蛋白酶，其余與人工胃液配制相同。

1.4.3人工腸液的制備 按文獻(xiàn)[16]方法，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使其溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=6.8；稱(chēng)取胰蛋白酶10 g，加適量水溶解；將上述兩種溶液混合后，再加水稀釋并定容到1 000 mL，即得人工腸液?？瞻兹斯つc液的配制：除不含胰蛋白酶，其余與人工腸液配制相同。

1.4.4SD大鼠腸道菌群的制備 SD大鼠禁食12 h，刺激腹部采集新鮮糞便，將糞便與生理鹽水按比例(1 g∶5 mL)渦旋混合制成懸濁液，2 000 r/min離心10 min (4℃)，再將上清液與厭氧培養(yǎng)液按比例(1∶9)混合，置厭氧培養(yǎng)箱中過(guò)夜，制得腸道菌群培養(yǎng)液[17]。

1.4.5空白組織樣品的制備 參考文獻(xiàn)[18-20]制備樣品。230～250 g SD大鼠6只，禁食不禁水過(guò)夜，腹腔注射烏拉坦麻醉后迅速處死，取出肝臟、胃、小腸和大腸，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(4℃預(yù)冷2 h)沖洗表面后剪碎，再將各組織與磷酸鹽緩沖液按比例(1 g∶5 mL)混合，置于勻漿機(jī)中均質(zhì)后，2 000 r/min 離心10 min(4℃)，取上清液備用。上述操作均在冰浴條件下進(jìn)行。

1.4.6厭氧培養(yǎng)基的制備 稱(chēng)取厭氧培養(yǎng)基9.5 g，加水800 mL搖勻，加水稀釋并定容到1 000 mL，高壓滅菌后分裝到試管中，制成厭氧培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品處理

1.5.1人工胃/腸液樣品處理 移取AEE儲(chǔ)備液4份，每份500 μL，分別置于50 mL容量瓶中，再分別用空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液稀釋并定容，充分混勻后，再分裝到EP管中(每管1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，于37℃水浴中孵育不同時(shí)間后分別取樣300 μL，加入冰乙腈700 μL終止反應(yīng)，渦旋混勻，于4℃下14 000×g離心10 min，取上清液，按1.6色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。

1.5.2SD大鼠腸道菌群處理 取1.4.4制備好的腸道菌群培養(yǎng)液1 mL于EP管中，分別加入AEE儲(chǔ)備液10 μL，渦旋混勻后置入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，培養(yǎng)不同時(shí)間后分別取樣0.5 mL于EP管中(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，加入冰乙腈(-20℃預(yù)冷2 h)1 mL終止反應(yīng)，12 000×g離心10 min，取上清液，按1.6色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。以培養(yǎng)相同時(shí)長(zhǎng)不含AEE的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，同法操作。

1.5.3空白組織樣品處理 將1.4.5制備好的上清液迅速分裝到EP管中(每管1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份)，加入AEE儲(chǔ)備液10 μL，混勻后置37℃水浴中孵育不同時(shí)間后，移取300 μL，加入700 μL冰乙腈終止反應(yīng)，渦旋2 min，14 000×g離心10 min，取上清液，按1.6色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。

1.6 含量測(cè)定色譜條件使用Phenomenex Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)對(duì)樣品進(jìn)行色譜分析。流動(dòng)相A為0.5%磷酸，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫步驟：0 min，A 60%；10 min，A 40%；30 min，A 40%；35 min，A 60%。柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1專(zhuān)屬性 分別取空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液、人工胃液+AEE儲(chǔ)備液、人工腸液+ AEE儲(chǔ)備液、空白人工胃液+AEE儲(chǔ)備液、空白人工腸液+AEE儲(chǔ)備液，按1.5.1方法處理，再按1.6色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；另取空白腸道菌液、空白腸道菌液+AEE儲(chǔ)備液，按1.5.2方法處理，再按1.6色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；再取空白肝液、空白胃液、空白大腸及其內(nèi)容物、空白小腸及其內(nèi)容物、空白肝液+ AEE儲(chǔ)備液、空白胃液+AEE儲(chǔ)備液、空白大腸及其內(nèi)容物+ AEE儲(chǔ)備液、空白小腸及其內(nèi)容物+AEE儲(chǔ)備液，按1.5.3方法處理，再按1.6色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果如圖1所示，在該色譜條件下，AEE能被檢出，保留時(shí)間為13.985 min，分離度良好，不受其他物質(zhì)干擾。

A.空白人工胃液；B.空白人工胃液+AEE；C.人工胃液；D.人工胃液+AEE；E.空白人工腸液；F.空白人工腸液+AEE；G.人工腸液；H.人工腸液+AEE；I.空白菌液；J.空白菌液+AEE；K.大腸及內(nèi)容物；L.小腸及內(nèi)容物；M.胃液；N.肝液。AEE出峰時(shí)間13.985 min圖1 代表性色譜圖

2.1.2線性關(guān)系的考察 精密吸取AEE儲(chǔ)備液，用乙腈分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.3，0.6，1.2，2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L的一系列對(duì)照品溶液，按1.6色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄相應(yīng)的峰面積。以AEE儲(chǔ)備液的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，AEE回歸方程：y=8.108 3x+0.944 7(R2=0.999 9)，結(jié)果表明，AEE儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度在0.3～20.0 mg/L時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3儀器精密度 精密吸取同一份AEE儲(chǔ)備液，再按1.6色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到峰面積 RSD 值為1.98%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2 AEE在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性以0 h時(shí) AEE的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間段的剩余百分比。結(jié)果見(jiàn)圖2：AEE在空白人工胃液中孵育0～2 h 剩余百分比基本沒(méi)有發(fā)生變化，隨著時(shí)間的增加，剩余百分比有明顯的下降，到6 h時(shí)下降到71%；在人工胃液中的剩余百分比隨著時(shí)間的增加，逐漸下降，從0 h的98%降到6 h的65%。AEE在空白人工腸液中孵育，AEE的剩余百分比隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，從0 h的98%降到6 h的75%；而在人工腸液中孵育0～1 h，稍微下降，但1～3 h，剩余百分比迅速下降，從77%降到22%，孵育到5 h，剩余百分比降為0%。

圖2 AEE在人工胃腸液中的孵育后的剩余百分比(n=3)

2.3 AEE在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性以0 h 時(shí)AEE的峰面積為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分比。AEE在SD大鼠腸道菌群中孵育時(shí)發(fā)生降解，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AEE的剩余百分比逐漸下降(圖3)，而生成的兩個(gè)主要色譜峰的面積隨著時(shí)間的增加而增加。為了探究代謝生成產(chǎn)物，測(cè)定了水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品和丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品，按1.6色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果AEE代謝生成的主要色譜峰與水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰和丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰比較，在相同的保留時(shí)間上顯示相同的色譜峰。由此可知，AEE的代謝產(chǎn)物主要是水楊酸和丁香酚，生成水楊酸和丁香酚的色譜峰面積與時(shí)間的關(guān)系如圖4。

圖3 AEE在SD大鼠腸道菌群中孵育后剩余百分比(n=3)

圖4 AEE在SD大鼠腸道菌群中孵育生成水楊酸和丁香酚的色譜峰面積(n=3)

2.4 AEE在生物樣品中的穩(wěn)定性AEE在生物制品中發(fā)生明顯降解，孵育0.5 h時(shí)，此色譜條件下已檢測(cè)不到AEE的色譜峰，而生成兩個(gè)主要的色譜峰，與2.3中已測(cè)得的水楊酸和丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰比較，在相同的保留時(shí)間上顯示相同的色譜峰，表明AEE的代謝產(chǎn)物主要是水楊酸和丁香酚。生成水楊酸和丁香酚的色譜峰面積與時(shí)間的關(guān)系如圖5，6。

圖6 AEE在生物樣品中孵育后生成丁香酚的色譜峰面積(n=3)

3 討論

口服藥物在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性檢測(cè)是新藥開(kāi)發(fā)的重要研究?jī)?nèi)容，藥物在胃腸道中的含量變化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21]。本研究測(cè)定了AEE在人工胃/腸液、腸道菌群及生物樣品中的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AEE在空白胃液、人工胃液、空白人工腸液中發(fā)生了降解(約30%)，在人工腸液中降解最明顯，5 h時(shí)基本完全降解，表明胰蛋白酶對(duì)AEE的影響較大，胃蛋白酶對(duì)其影響較小。鑒于進(jìn)入腸道的藥物會(huì)受到腸道菌群的影響[22]，因此另外測(cè)定了AEE在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明AEE剩余百分比與時(shí)間成反比，主要的代謝產(chǎn)物水楊酸和丁香酚的色譜峰面積隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，說(shuō)明腸道菌群對(duì)AEE代謝有一定的作用。

為了使試驗(yàn)條件更加接近生物體內(nèi)代謝環(huán)境[23]，進(jìn)一步檢測(cè)了AEE在生物制品中的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AEE在空白大鼠肝臟、空白大鼠胃液、空白大鼠大腸及內(nèi)容物、空白大鼠小腸及內(nèi)容物中不穩(wěn)定，0.5 h時(shí)基本完全降解，主要代謝產(chǎn)物為水楊酸和丁香酚，二者的含量比較穩(wěn)定，不會(huì)隨著孵育時(shí)間的增加而變化。

綜上所述，動(dòng)物體內(nèi)的酶對(duì)AEE具有較強(qiáng)的代謝作用，AEE在體內(nèi)的代謝主要發(fā)生在小腸，在胰酶、腸上皮細(xì)胞中的酶、腸道菌群等作用下會(huì)產(chǎn)生水楊酸和丁香酚兩種主要代謝產(chǎn)物。此結(jié)果與前期的研究結(jié)果相似[14-15,24]，前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠及犬口服給藥后，血漿中AEE及其前體藥物阿司匹林、丁香酚的濃度均較低，而代謝產(chǎn)物水楊酸的濃度較高。本研究的結(jié)果表明，在開(kāi)發(fā)AEE口服制劑時(shí)需要進(jìn)行特殊的處理來(lái)防止AEE在體內(nèi)的降解。