3例犬皮膚肥大細(xì)胞瘤病理學(xué)及c-kit免疫組織化學(xué)染色研究

馬 瑩，謝騰熠，張 競，石俊超，高 蕊，徐榮藝，賀文琦，高 豐，陸慧君 (吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

隨著生活水平的不斷提高和人們對(duì)犬貓等動(dòng)物親近感的提升，伴侶動(dòng)物逐漸成為家庭的重要成員；同時(shí)蓬勃發(fā)展的動(dòng)物診療技術(shù)，也提高了伴侶動(dòng)物的生活質(zhì)量及壽命。但動(dòng)物進(jìn)入老年后，罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加，因此對(duì)于寵物各種腫瘤的精確診斷也愈加重要。腫瘤診斷不僅可對(duì)寵物的臨床治療方案及處置方式提供指導(dǎo)，而且也會(huì)為動(dòng)物主人提供一個(gè)寵物健康狀態(tài)的心理預(yù)期[1]。

皮膚型肥大細(xì)胞瘤(cMCT)是犬發(fā)生率較高的皮膚腫瘤之一。cMCT起源于真皮和皮下組織的肥大細(xì)胞，占所有皮膚腫瘤的16%～21%，其惡性率可達(dá)19%～39%[2]。病理組織學(xué)檢查是腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，絕大多數(shù)cMCT可以通過蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色及甲苯胺藍(lán)(toluidine blue，T-blue)或吉姆薩(Giemsa)等組織化學(xué)染色獲得診斷，但對(duì)于分化程度較差的cMCT，很難通過這些常規(guī)的染色技術(shù)確診；此外，cMCT和其他類型的皮膚圓形細(xì)胞瘤有一定的相似性，病理診斷時(shí)需要相互鑒別，診斷難度較大[3]。

近年來，免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry,IHC)作為精確診斷小動(dòng)物腫瘤的一種重要的方法已經(jīng)在歐美等國家普遍應(yīng)用，但在我國由于多種限制因素還未發(fā)展起來。最新研究表明，c-kit可作為低分化cMCT的特異性分子標(biāo)記，在常規(guī)組織化學(xué)染色檢查基礎(chǔ)上，可為cMCT的精準(zhǔn)診斷提供更為確鑿的證據(jù)；同時(shí)，KIT蛋白的不同表達(dá)模式與預(yù)后具有一定的相關(guān)性[4]。因此，本研究聯(lián)合應(yīng)用HE染色、T-blue組織化學(xué)染色以及c-kit免疫組織化學(xué)染色方法，對(duì)3例臨床疑似犬cMCT進(jìn)行系統(tǒng)的病理組織學(xué)觀察分析并作出確診，不僅為本次腫瘤病例的治療和預(yù)后提供精準(zhǔn)指導(dǎo)，而且可為獸醫(yī)臨床各種分化程度的MCT診、治、防及預(yù)后分析等提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例基本情況

1.1.1病例1 巴哥犬，5歲，雄性已去勢(shì)。本次就診的2個(gè)月前，曾在右前肢、左后肢和右側(cè)尾根發(fā)生過肥大細(xì)胞瘤，病理結(jié)果顯示為2級(jí)，分化良好(其他醫(yī)院診斷結(jié)果)；之后在左腹皮膚表面發(fā)現(xiàn)一小凸起(圖1A)，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)懷疑為肥大細(xì)胞瘤。

1.1.2病例2 比熊犬，6歲，雌性已絕育。約2個(gè)月前發(fā)現(xiàn)右后肢膝關(guān)節(jié)有1個(gè)高粱米粒大小的紅點(diǎn)，最近變大凸起(圖1B)，有舔舐腫塊行為。

1.1.3病例3 貴賓犬，5歲，雄性已去勢(shì)。約4年前發(fā)現(xiàn)左側(cè)胸壁一處有米粒大小的腫物，后期逐漸生長變大，經(jīng)常瘙癢抓撓，與皮下有連接(圖1C)。

A.病例1病灶照片；B.病例2病灶照片；C.病例3病灶照片圖1 臨床病例的病灶外觀

1.2 試劑及儀器

1.2.1試劑 甲醛、乙醇、二甲苯購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性樹膠(G8590)、甲苯胺藍(lán)(G3668)購于北京索萊寶科技有限公司；伊紅(G1101)、蘇木素(G1104)購于武漢塞維爾生物科技有限公司；c-kit抗體(ab32363)購于Abcam公司；免疫組化試劑盒(KIT-9710)、DAB顯色液(MAX-001)購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2儀器 包埋機(jī)(KD-BM，科迪)，切片機(jī)(RM2245，Leica)，切片掃描儀(Panoramic 250/MIDI，3D HISTECH)。

1.3 病理組織切片制作與HE染色

1.3.1固定 將送檢組織置于10%中性福爾馬林溶液中，固定至少24 h。

1.3.2石蠟切片制作 將組織依次進(jìn)行酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋；將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)，切片厚度3～5 μm。

1.3.3HE染色與封片 切片經(jīng)二甲苯脫蠟，并依次用100%，90%，80%無水乙醇復(fù)水，放入蘇木素染液中染色5 min，用自來水沖洗返藍(lán)，80%酒精短暫脫水后，放入伊紅染液中染色3 min；將切片依次放入80%，90%，100%無水乙醇Ⅰ和Ⅱ、二甲苯Ⅰ和Ⅱ，每個(gè)步驟3 min，依次進(jìn)行脫水與透明。將切片從二甲苯中撈出，組織表面滴加中性樹膠，覆蓋載玻片，風(fēng)干保存。

1.4 甲苯胺藍(lán)染色對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、復(fù)水后，滴加T-blue染色液，染色5 min后用自來水沖洗，95%乙醇分化，后續(xù)步驟按照說明書進(jìn)行操作。

1.5 免疫組織化學(xué)染色(c-kit)對(duì)切片進(jìn)行脫蠟、復(fù)水后，在枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，PBST沖洗后使用正常動(dòng)物非免疫血清進(jìn)行封閉，c-kit抗體做為一抗4℃孵育過夜，PBST沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗，PBST沖洗3次后滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，PBST沖洗3次，滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色，自來水沖洗終止顯色后，用蘇木素進(jìn)行復(fù)染。

2 結(jié)果

2.1 大體病變病例1切除腫塊大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，福爾馬林固定后表面呈灰黑色(圖2A)；病例2切除腫塊大小0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm，皮膚顏色正常，切開皮下有黃色膠凍樣物質(zhì)(圖2B)；病例3切除物塊大小3 cm×3 cm×0.5 cm，腫塊處無毛，較正常皮膚稍紅，固定后顏色發(fā)白，切面呈灰白色(圖2C)。

A.病例1切除腫塊；B.病例2切除腫塊；C.病例3切除腫塊圖2 腫塊大體病變

2.2 HE染色結(jié)果低倍鏡下，可見腫塊均位于真皮層，無包膜包被，但與周圍組織界限清楚。腫塊內(nèi)部可見大量增生的嗜堿性深染的腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞或呈片狀致密分布(圖3A)，或零星的散布排列在嗜堿性的黏液樣物質(zhì)中(圖3B)，或呈條索狀或小梁狀排列(圖3C)。周圍正常組織因受到腫物壓迫而發(fā)生變形，腫物邊緣部分區(qū)域有發(fā)生出血及炎性細(xì)胞的浸潤。高倍鏡下，觀察到腫瘤細(xì)胞為圓形，胞質(zhì)呈藍(lán)灰色，核呈圓形位于中央，部分腫瘤細(xì)胞形態(tài)類似于“煎荷包蛋樣”外觀，細(xì)胞異型性較低，未見有絲分裂相(圖3D)。有些區(qū)域可見嗜酸粒細(xì)胞聚集及膠原纖維溶解形成“火焰狀”外觀(圖3E，F(xiàn))。從病理切片可見病例1和病例3手術(shù)邊緣較為完整，未見有散在的腫瘤細(xì)胞，腫瘤切除干凈；病例2手術(shù)邊緣處仍可見散在的腫瘤細(xì)胞，不排除復(fù)發(fā)的可能性。

A.深染的腫瘤細(xì)胞呈片狀排列；B.散在分布的腫瘤細(xì)胞；C.條索狀分布的腫瘤細(xì)胞；D.腫瘤區(qū)域部分腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)“煎蛋樣”形態(tài)特征；E.腫瘤區(qū)域嗜酸粒細(xì)胞聚集；F.腫瘤區(qū)域內(nèi)可見部分膠原纖維溶解圖3 組織切片HE染色結(jié)果

2.3 T-blue染色結(jié)果組織切片經(jīng)T-blue染色后，鏡下觀察可見腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，表現(xiàn)為藍(lán)紫色(圖4A，B，C)。

A.病例1組織切片；B.病例2組織切片；C.病例3組織切片圖4 組織切片T-blue染色結(jié)果

2.4 c-kit免疫組織化學(xué)染色結(jié)果3個(gè)病例樣本中的腫瘤細(xì)胞c-kit染色均呈陽性。病例1 c-kit陽性信號(hào)多為膜周標(biāo)記(圖5A)；病例2多為胞內(nèi)點(diǎn)狀或斑塊狀標(biāo)記，可見小部分聚集性彌漫性標(biāo)記(圖5B)；病例3 c-kit陽性信號(hào)以胞質(zhì)彌漫性標(biāo)記為主(圖5C)。

2.5 病理診斷根據(jù)HE染色和T-blue染色的結(jié)果，3個(gè)病例的腫瘤組織中均可見有“煎蛋樣”的腫瘤細(xì)胞形態(tài)及胞質(zhì)顆粒藍(lán)紫色的著色反應(yīng)，同時(shí)見有膠原纖維溶解和嗜酸粒細(xì)胞浸潤的反應(yīng)，符合MCT的形態(tài)學(xué)特征。進(jìn)一步結(jié)合c-kit免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果綜合分析，確定3個(gè)病例均屬于cMCT。其中，病例1和病例2的腫瘤細(xì)胞分化良好，屬于low grade(two tier system)[5]或grade Ⅰ (three tier system)[6]，病例3的腫瘤細(xì)胞屬于中等程度分化，可分級(jí)為low grade(two tier system)或grade Ⅱ(three tier system)。

A.病例1組織切片；B.病例2組織切片；C.病例3組織切片圖5 送檢組織切片c-kit免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

3 討論

MCT可發(fā)生在犬身體的多個(gè)部位，最常見的是皮膚，其次是皮下；不同品種的犬都可發(fā)生，拳師犬、哈巴狗、波士頓犬的發(fā)生率更高。根據(jù)大量的統(tǒng)計(jì)資料分析，MCT尚無性別或年齡的相關(guān)性，但cMCT的發(fā)生率會(huì)隨著年齡的增長而增加，平均好發(fā)年齡為9歲[7]，但也曾有2周齡的幼犬發(fā)生cMCT的相關(guān)病例報(bào)告。

病例1腫物的表面顏色呈灰黑色，提示其組織內(nèi)可能有出血現(xiàn)象，這一推測(cè)已通過組織學(xué)切片分析結(jié)果證實(shí)；病例2腫物的中間存在黃色膠凍樣滲出物，顯微鏡下觀察證實(shí)其為嗜堿性的黏液樣物質(zhì)。經(jīng)HE染色的病理組織切片分析，確定3個(gè)病例的腫塊均位于真皮中；腫塊區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞呈卵圓形，體積較大，呈現(xiàn)散在、條索狀或片狀的排列方式；胞漿內(nèi)可見大量的嗜堿性顆粒；細(xì)胞核呈圓形或橢圓形。這些大量增生的細(xì)胞形態(tài)符合圓形細(xì)胞特征，初步認(rèn)為是肥大細(xì)胞。部分腫瘤區(qū)域可見嗜酸粒細(xì)胞聚集及膠原纖維溶解，推測(cè)可能與臨床檢查中按壓觸診導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺等炎性物質(zhì)有關(guān)。

獸醫(yī)臨床中，常常采取操作方便、快捷的細(xì)針穿刺抽吸方法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查來診斷犬MCT。但細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)肥大細(xì)胞辨識(shí)度比較低，容易造成誤診，而且對(duì)于腫瘤細(xì)胞的分化程度、MCT病理分級(jí)以及腫瘤切除的完整性均無法準(zhǔn)確判斷。因此，病理組織學(xué)分析在MCT診斷中仍是公認(rèn)的最精確全面的診斷方法。但是，cMCT可能與好發(fā)于皮膚的髓外漿細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤等其他類型的圓形細(xì)胞瘤具有相似的病理特征，當(dāng)部分細(xì)胞的形態(tài)特征不夠典型時(shí)，很難通過HE染色進(jìn)行診斷[8]。為進(jìn)一步確定腫瘤細(xì)胞類型，本試驗(yàn)進(jìn)行了T-blue染色?？梢娔[瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)含有大量著染藍(lán)紫色的均一性顆粒，符合肥大細(xì)胞的著色特征；組織中的其他細(xì)胞則呈現(xiàn)均勻淡藍(lán)色的陰性著色，故可排除其他圓形細(xì)胞瘤的可能，診斷為cMCT[1]。

用于犬的MCT的病理分級(jí)體系主要有兩種。最早是PATNAIK等[5]和BOSTOCK[9]提出的Patnaik分級(jí)體系(three tier system)，該體系將cMCT分為3種，分別為分化良好(GradeⅠ)、中等程度分化(GradeⅡ)和分化較差(Grade Ⅲ)；級(jí)別越高，患犬存活時(shí)間越短，腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率也越高。但是，不同病理學(xué)家應(yīng)用該體系分級(jí)的一致性較低，易造成診斷混亂。2011年，KIUPEL等[6]提出了MCT兩級(jí)分級(jí)方法(two tier system)，將cMCT分為低等級(jí)(low grade)和高等級(jí)(high grade)。研究顯示，該方案在不同病理學(xué)家之間的診斷一致性大于97%，且該分級(jí)體系與腫瘤的預(yù)后有顯著的相關(guān)性。因此，專家認(rèn)為，兩級(jí)分級(jí)體系更適合犬cMCT的分級(jí)[10]。本研究依據(jù)上述不同的分級(jí)體系，對(duì)3個(gè)病例進(jìn)行了分級(jí)診斷。病例1和病例2中腫瘤細(xì)胞分化良好，細(xì)胞大小、形態(tài)均與正常細(xì)胞無明顯差異，異型性較低，并且腫瘤區(qū)域與正常組織界限清晰，沒有出現(xiàn)侵犯正常組織跡象，所以將這兩個(gè)病例的腫瘤分級(jí)歸屬于gradeⅠ(three tier system)或low grade(two tier system)；病例3的腫瘤細(xì)胞中等分化，且腫瘤區(qū)域與周圍組織的界限比較模糊，有侵犯正常組織的現(xiàn)象，分級(jí)為grade Ⅱ (three tier system)或low grade (two tier system)。

研究表明，c-kit基因突變?cè)?0%～30%的犬MCT發(fā)生中起核心作用，甚至可根據(jù)該基因的突變情況，選擇toceranib、imatinib和masitinib等特異性的靶向藥物進(jìn)行腫瘤的干預(yù)治療[11]。c-kit基因編碼酪氨酸激酶跨膜受體(KIT蛋白)，基因突變后誘導(dǎo)KIT蛋白持續(xù)活化，導(dǎo)致下游信號(hào)不受控制，肥大細(xì)胞發(fā)生不可控的異常增殖，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生[12-14]。根據(jù)KIT蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)，可以對(duì)術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的可能性進(jìn)行評(píng)估。KIT蛋白呈膜周(KITⅠ)標(biāo)記時(shí)，一般預(yù)后較好，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移可能性較低；而KIT蛋白陽性信號(hào)呈胞質(zhì)點(diǎn)狀和斑塊狀(KITⅡ)或彌漫性(KIT Ⅲ)標(biāo)記時(shí)，一般預(yù)后較差，術(shù)后存活時(shí)間較短，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可能性較大[11,15]。本研究中，病例1和2腫瘤細(xì)胞KIT蛋白多為KIT Ⅰ和KITⅡ標(biāo)記，病例3中腫瘤細(xì)胞以KIT Ⅲ標(biāo)記為主。結(jié)合HE染色結(jié)果，病例1手術(shù)邊緣完整，腫瘤切除干凈，KIT蛋白以KIT Ⅰ標(biāo)記為主，推測(cè)預(yù)后良好；病例2的手術(shù)邊緣仍可見到散在的腫瘤細(xì)胞，手術(shù)切除不完全，并且KIT蛋白以KIT Ⅱ型標(biāo)記較多，存在復(fù)發(fā)的可能性；病例3的腫瘤細(xì)胞分化程度中等，c-kit免疫組化染色有較多KIT Ⅲ型標(biāo)記，推測(cè)該病例腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可能性較高。

目前臨床上對(duì)于犬的MCT，主要有3種治療方法，即外科手術(shù)切除、化療和放療。外科手術(shù)切除是最常用的治療方法，腫塊邊緣2～3 cm是目前認(rèn)為比較科學(xué)的切除范圍[1]。對(duì)于c-kit基因突變導(dǎo)致的犬MCT，可以選擇特異性的靶向藥物治療。對(duì)于未明確c-kit突變導(dǎo)致的MCT，可以選擇長春花堿(vinblastine，VLB)、潑尼松龍(prednisolone)和洛莫司汀(lomustine)等常規(guī)化療藥物。由于放射線療法可能引起組織胺的釋放，在執(zhí)行之前建議給予固醇類藥物。病例1腫瘤病理分級(jí)低，KIT蛋白以KIT Ⅰ為主，完整手術(shù)切除后應(yīng)有不錯(cuò)的預(yù)后。病例2和病例3腫瘤病理分級(jí)較高，KIT蛋白以KIT Ⅱ和KIT Ⅲ為主，因此建議外科手術(shù)切除后給予常規(guī)的化療藥物配合治療，進(jìn)一步可進(jìn)行c-kit基因的突變分析，選擇更加精準(zhǔn)的靶向藥物治療。同時(shí)，應(yīng)及時(shí)追蹤患寵恢復(fù)情況。