綿羊乳腺上皮細(xì)胞的分離鑒定及炎性模型的建立

宣超瑩，段景龍，劉茂軍，馬玉忠* (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 0700；.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 004)

乳腺上皮細(xì)胞是一種具有合成和分泌乳汁功能的特化細(xì)胞[1]，是機體黏膜免疫系統(tǒng)的一部分，是抵御病原體的第一道屏障[2]。大量研究表明，微生物感染是乳房炎發(fā)生的主要原因，以葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主[3-4]。乳房炎會造成乳品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。目前藥物治療乳房炎是普遍使用的方法，但效果不甚理想，通過體外試驗進(jìn)行乳房炎的研究相對較少。本研究旨在獲得同一性高、純度高、活力強的乳腺上皮細(xì)胞，并建立乳腺上皮細(xì)胞炎性模型，為進(jìn)行體外研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2歲左右健康泌乳期綿羊，體質(zhì)量25～30 kg，來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。在溫度16～28℃，相對濕度40%～60%條件下飼養(yǎng)。該研究經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物管理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑DMEM/F12、Ⅰ型膠原酶、0.25% Trypsin購自Gibco公司；CCK-8試劑盒購自Solarbio公司；CK-18抗體購自Abcom公司；TLR-4抗體購自Bioss公司。

1.3 乳腺組織的采集和處理無菌條件下采集5 cm×5 cm×5 cm乳房基部組織，用含有青、鏈霉素的PBS進(jìn)行清洗，去除結(jié)締組織，并將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊，清洗到?jīng)]有奶漬和血漬為止。

1.4 組織塊法將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)入6孔板中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h，每孔加入2 mL含15% FBS的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d換液1次。

1.5 酶消化組織塊法向組織塊中加入0.25%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化1.5 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，轉(zhuǎn)入6孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，加入2 mL含15% FBS的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 酶消化法向組織塊中加入0.25%的胰酶(Trypsin)于37℃振蕩消化15 min后，1 000 r/min離心5 min，棄上清,加入2倍體積10%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化1.5 h后用100 μm孔徑濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含15% FBS的DMEM/F12重懸細(xì)胞，置于細(xì)胞瓶中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.7 細(xì)胞純化及傳代待細(xì)胞長到80%～90%時，棄培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，以EDTA-Trypsin 于37℃作用1～2 min，加入含15% FBS的DMEM/F12終止消化。將成纖維細(xì)胞吹打下來，棄去液體，用PBS洗2次，加入含15% FBS的DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)2～3次后得到較為純凈的乳腺上皮細(xì)胞。待純凈的細(xì)胞再次長滿，用PBS清洗后，加入EDTA-Trypsin 于37℃作用4 min，用含15% FBS的DMEM/F12終止消化，傳代到培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 姬姆薩染色待第7代細(xì)胞鋪滿瓶底時棄去原培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加姬姆薩染色A液靜置2 min，加入等量B液混勻，靜置5 min，洗去多余染色液，晾干后封片，觀察。

1.9 乳腺上皮細(xì)胞的免疫熒光染色將細(xì)胞鋪到含蓋玻片的平皿中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h，用4%多聚甲醛固定；PBS浸洗3次后用0.2% TritonX-100進(jìn)行通透；PBS浸洗后用1% BSA封閉；加CK-18一抗(1∶100稀釋)，4℃孵育過夜；用PBS浸洗后加二抗(1∶100稀釋)，37℃孵育35 min；用PBS浸洗3次，加10 mg/L DAPI，作用5 min；用PBS洗滌后吸干水分，封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.10 乳腺上皮細(xì)胞的RT-PCR鑒定提取細(xì)胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板，通過引物(β-酪蛋白-F：5′-TGCTACTCATCTTTATTTTGGAC-3′；β-酪蛋白-R：5′-TTCCTAAAACATTTGCAGTCA-3′)，進(jìn)行PCR擴增。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增產(chǎn)物。

1.11 乳腺上皮細(xì)胞的生長曲線純化好的上皮細(xì)胞用EDTA-Trypsin消化后，用DMEM/F12重懸細(xì)胞，接種到96孔板中，每隔24 h用CCK-8法測D值，連測7 d，繪制生長曲線。

1.12 構(gòu)建炎性模型的LPS最適質(zhì)量濃度的篩選將細(xì)胞鋪到96孔板中，隨機分為3個組，每組使用0，5，10，20，50 mg/L LPS處理，每個質(zhì)量濃度5個孔，3個組在37℃、5% CO2條件下分別處理6，12，24 h。每孔加10 μL CCK-8作用1 h，測D450值，計算相對增長率。

細(xì)胞相對增長率(%)=(D加藥組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%

1.13 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8和TNF-α的濃度將細(xì)胞鋪到96孔板中，分成2組，每組5個孔。分別用0，10 mg/L LPS處理12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測IL-8和TNF-α濃度。

1.14 Western blot法檢測TLR-4蛋白的表達(dá)將細(xì)胞鋪到24孔板中，分別使用0，5，10，20，50 mg/L的LPS處理12 h。提取總蛋白，測定蛋白濃度。以40 μg總蛋白/孔的量在12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳，通過半干法轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶封閉，用TLR-4一抗(1∶1 000稀釋)孵育過夜，用TBST洗膜，加入堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶2 000稀釋)，孵育1 h，TBST洗膜后進(jìn)行顯色。

1.15 數(shù)據(jù)處理用SPSS 10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，評估試驗組之間的差異，并使用Dumcan方法進(jìn)行多重比較，用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)觀察通過組織塊法進(jìn)行細(xì)胞分離，培養(yǎng)5 d后，可見有少量成纖維細(xì)胞從組織塊遷出，呈紡錘形或者星形(圖1A)，培養(yǎng)11 d左右可見有上皮細(xì)胞遷出；通過酶消化組織塊法進(jìn)行細(xì)胞分離，在消化培養(yǎng)第3 天可見有極少量的成纖維細(xì)胞遷出，第7天可見乳腺上皮細(xì)胞呈暈狀出現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)呈多邊形，均一良好，排列緊密(圖1B)；通過酶消化法進(jìn)行細(xì)胞分離，鋪板次日可見有細(xì)胞貼壁，部分細(xì)胞向外延伸呈島嶼狀，由于消化下來的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，會出現(xiàn)成纖維細(xì)胞包圍上皮細(xì)胞生長的現(xiàn)象(圖1C)。

A.成纖維細(xì)胞；B.乳腺上皮細(xì)胞；C.酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察

2.2 乳腺上皮細(xì)胞的純化以上3種方法均可成功獲得乳腺上皮細(xì)胞，利用成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞對Trypsin敏感性不同的特點，通過Trypsin消化使成纖維細(xì)胞先脫落，去除成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，從而達(dá)到分離出乳腺上皮細(xì)胞的目的。如圖2A所示，純化獲得的乳腺上皮細(xì)胞形狀多為多邊形或卵圓形，少數(shù)呈短梭形，細(xì)胞連接緊密成片，總體呈多邊形。由于采取的組織正處在泌乳期，有些區(qū)域出現(xiàn)了脂滴空泡(圖2B)。1周后可見有些細(xì)胞外基質(zhì)互相連接，出現(xiàn)了“拉網(wǎng)”現(xiàn)象(圖2C)。

A.純化的細(xì)胞；B.脂滴空泡；C.“拉網(wǎng)”初期圖2 純化的細(xì)胞形態(tài)

2.3 姬姆薩染色姬姆薩染色顯示，乳腺上皮細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)著色較淺，細(xì)胞核大，呈不規(guī)則圓形，多數(shù)細(xì)胞有2～5個核仁，核仁明顯，著色較深(圖3)。

圖3 乳腺上皮細(xì)胞的姬姆薩染色

2.4 生長曲線通過3種不同方法所獲得細(xì)胞的生長曲線見圖4，其中組織塊法獲得的細(xì)胞生長速度最快，膠原酶消化結(jié)合組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度次之，酶消化法獲得的細(xì)胞生長速度最慢，生長曲線均呈“S”型，符合細(xì)胞增殖的生物學(xué)規(guī)律。從生長曲線上看，前3 d是細(xì)胞生長的潛伏期，此階段的細(xì)胞生長速度較慢；第3～6天是對數(shù)增長期，該階段的細(xì)胞生長速度很快，傳代適合在該階段進(jìn)行；第6 天之后進(jìn)入細(xì)胞生長的平臺期，細(xì)胞開始逐漸老化、凋亡。

圖4 3種不同方法所獲得細(xì)胞的生長曲線

2.5 乳腺上皮細(xì)胞的免疫熒光鑒定倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，細(xì)胞膜上CK-18呈陽性，可見綠色熒光(圖5)。

A.細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光；B.細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光；C.細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)熒光疊加圖圖5 乳腺上皮細(xì)胞鑒定

2.6 RT-PCR法檢測β-酪蛋白的表達(dá)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，3種方法獲得的細(xì)胞均可檢測到180 bp 的β-酪蛋白基因條帶(圖6)。

M.DL2000 DNA Marker；1.酶消化法；2.組織塊法；3.酶消化組織塊法圖6 不同方法獲得細(xì)胞的β-酪蛋白基因的RT-PCR檢測

2.7 LPS最適質(zhì)量濃度的篩選由表1可知，10 mg/L LPS處理乳腺上皮細(xì)胞12 h對乳腺上皮細(xì)胞的促生長作用最強。

表1 LPS對乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響(n=5)

2.8 10 mg/L LPS對乳腺上皮細(xì)胞IL-8和TNF-α分泌的影響由表2可知，LPS處理乳腺上皮細(xì)胞后12 h，10 mg/L LPS可以顯著提高IL-8和TNF-α的分泌量(P<0.01)。

表2 LPS對乳腺上皮細(xì)胞IL-8和TNF-α分泌的影響 (n=5) μg/L

2.9 LPS對乳腺上皮細(xì)胞TLR-4蛋白表達(dá)的影響由圖7可知，當(dāng)LPS質(zhì)量濃度為10 mg/L時，TLR-4的蛋白表達(dá)量最高。

圖7 LPS對乳腺上皮細(xì)胞TLR-4蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前國內(nèi)外學(xué)者已成功培養(yǎng)出了多種動物的乳腺上皮細(xì)胞。培養(yǎng)的方法有組織塊法[5]、酶消化法[6]、乳汁分離法[7]、機械破碎法[8]等。本研究分別采用組織塊法、膠原酶消化組織塊法和酶消化法3種方法對乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)。酶消化法是使用Trypsin和膠原酶聯(lián)合消化后直接獲得細(xì)胞的方法，此方法用時短，采取的組織腺泡發(fā)育越好獲得的上皮細(xì)胞數(shù)目越多，缺點是會摻雜大量成纖維細(xì)胞，需要多次純化，且酶對細(xì)胞的損傷大。本研究采用酶消化法獲得的細(xì)胞中摻雜大量成纖維細(xì)胞，經(jīng)過多次純化后細(xì)胞活力降低，培養(yǎng)至4～5代后細(xì)胞會逐漸凋亡，其原因可能是Trypsin消耗過程對細(xì)胞的損傷太大，不適合乳腺上皮細(xì)胞的分離[9]。組織塊法是3種方法中操作最簡單的方法，對細(xì)胞損傷小，但培養(yǎng)時間長，由于成纖維細(xì)胞比上皮細(xì)胞先從組織塊中遷出[10]，導(dǎo)致去除成纖維細(xì)胞時會損失部分上皮細(xì)胞，因此上皮細(xì)胞的收集較難[11-12]。酶消化組織塊法是聯(lián)合兩種方法的一種比較新的方法，該方法細(xì)胞遷出速度比組織塊法快，摻入的成纖維細(xì)胞比酶消化法少，而且，由于酶的使用濃度低，所以對細(xì)胞造成的損傷也比較小，所獲細(xì)胞的活性比較好[13]。由于組織塊法培養(yǎng)細(xì)胞周期長于酶消化組織塊法，所以酶消化組織塊法是最符合預(yù)期的乳腺上皮細(xì)胞分離方法。

本研究采用免疫熒光技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。角蛋白是細(xì)胞骨架的組成成分，是上皮來源的組織標(biāo)志物，廣泛地應(yīng)用于多種動物乳腺上皮細(xì)胞的鑒定[14-15]，因而通過免疫熒光法檢測角蛋白可以鑒別乳腺上皮細(xì)胞。酪蛋白是動物乳汁蛋白的重要組成部分，β-酪蛋白是酪蛋白的主要形式，所以β-酪蛋白可以作為乳腺上皮細(xì)胞是否具有泌乳功能的重要指標(biāo)[7,14-15]。本研究中β-酪蛋白基因在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)呈陽性，說明分離的細(xì)胞都具有合成乳蛋白的能力。

多數(shù)乳房炎是由革蘭陰性菌引起的，LPS位于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的最外層，當(dāng)菌體受到破壞或者裂解死亡后會釋放到周圍環(huán)境中，引發(fā)機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[16]。田青等[17]研究表明，LPS可以誘導(dǎo)大鼠乳腺上皮產(chǎn)生炎性反應(yīng)；張馳等[18]也用LPS刺激牛乳腺上皮細(xì)胞成功構(gòu)建了奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性模型。TLR-4是LPS激活炎癥信號通路的關(guān)鍵受體，當(dāng)有炎癥發(fā)生時，TLR-4的蛋白表達(dá)量升高[19]。本研究以10 mg/L LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞12 h后，TLR-4蛋白表達(dá)量最高。

將TNF-α和IL-8兩種炎癥早期分泌的細(xì)胞因子作為衡量炎性細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功的指標(biāo)，10 mg/L LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后12 h TNF-α和IL-8的表達(dá)量顯著高于對照組，表明10 mg/L LPS作用12 h是構(gòu)建乳腺上皮細(xì)胞炎性模型的適宜條件。