麥哲倫企鵝曲霉菌病的組織病理學(xué)觀察和病原分離鑒定

宋志琦，孫艷明，蘇 磊，屈亞錦，趙文杰，韓云林，秦 川* (．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 比較醫(yī)學(xué)中心 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心，北京 0002；2.北京海洋館，北京 0008)

真菌作為禽類的致病病原比較少見，大多為條件性致病菌。雖然真菌病相對(duì)不常見，但是它們對(duì)禽類宿主造成的損傷可能是致命性的，其中，曲霉菌病 (aspergillosis) 是目前最普遍的包括圈養(yǎng)企鵝在內(nèi)的禽類真菌病，也是禽類重要的呼吸道疾病之一[1]。曲霉菌病是一種由曲霉菌屬真菌感染引起的疾病，曲霉菌屬由大約180種真菌組成，主要病原為煙曲霉菌、土曲霉菌、黃曲霉菌、黑曲霉菌以及構(gòu)巢曲霉菌等[2]。曲霉菌病的臨床表現(xiàn)取決于累及的器官或系統(tǒng)以及感染區(qū)域是局灶性還是全身性。在禽類，曲霉菌病通常影響下呼吸道，在氣囊和肺臟造成紅腫病變或結(jié)節(jié)。其他相對(duì)不常見的臨床病變可能累及眼睛、大腦、皮膚、關(guān)節(jié)和內(nèi)臟等其他臟器[3]。隨著企鵝的圈養(yǎng)和家禽現(xiàn)代化、集約化飼養(yǎng)模式的發(fā)展，以及廣譜高效抗生素的濫用，抗生素對(duì)環(huán)境的污染，使禽曲霉菌病的發(fā)生率逐年上升。但是海洋館圈養(yǎng)企鵝的曲霉菌病國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。

本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室近期收診的麥哲倫企鵝 (Magellanic penguins) 病例進(jìn)行了系統(tǒng)的組織病理學(xué)觀察和病原分離鑒定，以提供企鵝曲霉菌病的病理診斷特征和病原分離數(shù)據(jù)。麥哲倫企鵝作為重要的圈養(yǎng)觀賞動(dòng)物，其患病的診斷和治療為其他同類動(dòng)物的飼養(yǎng)和護(hù)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料2019年初，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)病理分析平臺(tái)收診國(guó)內(nèi)某水族館送檢的病死企鵝3只，均屬麥哲倫企鵝，體質(zhì)量為2.5～3.5 kg。

1.2 臨床癥狀觀察、剖檢和組織病理學(xué)切片制作按照常規(guī)的傳染病規(guī)范要求進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和臨床觀察。對(duì)死亡企鵝進(jìn)行病理剖檢，觀察臨床病變并記錄，分別取肺臟、結(jié)節(jié)、心臟、肝臟、腸道和腎臟等臟器，于10%福爾馬林中固定[4]。固定的組織經(jīng)石蠟包埋后制作切片，分別進(jìn)行蘇木精-伊紅 ( hematoxylin-eosin,HE) 染色、六胺銀 (gomori methenamine silver,GMS) 染色和PAS(periodic acid-schiff)染色，置Olympus顯微鏡下觀察。

1.3 病原的分離鑒定用消毒后的器械進(jìn)行取樣，將臟器表面消毒后浸泡在無(wú)菌PBS緩沖液中，4℃保存，24 h內(nèi)分離備用。用75%酒精對(duì)臟器表面消毒30 s，用無(wú)菌水洗滌3次，用無(wú)菌手術(shù)刀切取1～2 g 組織，用無(wú)菌研缽研碎，加入0.5～1.0 mL無(wú)菌水，均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板，于25～28℃，培養(yǎng)4～7 d，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接保存，備用[5]。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列常用于真菌的鑒定和高通量測(cè)序，選用引物ITS4和ITS5用于真菌純培養(yǎng)物的鑒定、引物ITS1和ITS2用作高通量測(cè)序[6-7]。對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物ITS序列進(jìn)行測(cè)序后，通過(guò)BLAST軟件在GenBank中查找同源序列并進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)Mega 5.0軟件采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢變化3只送檢企鵝中，1只為2歲左右雌性企鵝，病程較長(zhǎng)，體質(zhì)量在2個(gè)月內(nèi)由3.5 kg 降至2.5 kg，食欲廢絕死亡。剖檢時(shí)，皮下組織干燥，尸體消瘦；打開胸腔后，在氣管兩側(cè)，肺臟周圍可見大量卵圓形結(jié)節(jié) (圖1A，B，C)，結(jié)節(jié)質(zhì)地硬實(shí)，切面磨砂感，呈乳白色，干酪樣質(zhì)感 (圖1D)。結(jié)節(jié)成串生長(zhǎng)，呈淺黃色，大小不一，被一層透明的包膜包裹 (圖1E)，直徑為2～10 mm (圖1F)。其他內(nèi)臟器官漿膜面散在大小不等黃白色斑點(diǎn)。

A.氣管周圍病灶；B.肺臟周圍病灶；C.結(jié)節(jié)外觀；D.結(jié)節(jié)切面；E.胸腔內(nèi)串珠樣結(jié)節(jié)整體情況；F.取樣結(jié)節(jié)的直徑測(cè)量圖1 大體病變觀察

2.2 組織病理學(xué)觀察取各臟器組織，制備切片，HE染色顯示，鏡下可見含有病理性結(jié)節(jié)的肺臟組織呈現(xiàn)典型的特異性肉芽腫結(jié)構(gòu)(圖2A)。肉芽腫與肺臟組織邊界清晰，內(nèi)部為同心圓形一層層的均質(zhì)紅染的干酪樣壞死區(qū)域，內(nèi)含大量破碎的固有細(xì)胞和炎性細(xì)胞碎片。外圍環(huán)繞豐富毛細(xì)血管網(wǎng)、成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞組成的肉芽組織，少見多核巨細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞(圖2B)；六胺銀染色顯示，肉芽腫內(nèi)部有深棕色曲霉菌菌絲(圖2C)；PAS糖原染色顯示，菌絲為紫紅色(圖2D)。尚未形成肉芽腫的固有肺臟結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞(圖3A)。企鵝肺組織大面積充血，毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)破壞，支氣管、細(xì)支氣管管腔內(nèi)充滿脫落的上皮細(xì)胞碎片和嗜酸性物質(zhì)(圖3B)。副支氣管管腔內(nèi)充滿均質(zhì)粉染的蛋白樣滲出物，夾雜藍(lán)染的碎片，小血管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。組織內(nèi)到處可見脫顆粒(紅色小顆粒)的異嗜細(xì)胞，肺房?jī)?nèi)充滿大量炎性細(xì)胞和有核血細(xì)胞(圖3C，D)。

A.肺臟結(jié)節(jié)的直徑測(cè)量；B.肺臟結(jié)節(jié)HE染色(15×)；C.肺臟結(jié)節(jié)六胺銀染色(GMS,400×);D.肺臟結(jié)節(jié)PAS染色(400×)圖2 肺臟結(jié)節(jié)大體和組織病理學(xué)特征

A.肺臟三級(jí)支氣管(HE,100×)；B.肺臟支氣管(HE,100×)；C.肺葉邊緣(HE,100×)；D.肺葉內(nèi)三級(jí)支氣管局部放大(HE,400×)圖3 肺臟組織病理學(xué)觀察

在鏡下觀察腸道漿膜處的病理性結(jié)節(jié)，可見肉芽腫結(jié)構(gòu)主要分布在腸道漿膜層(圖4A)。肉芽腫內(nèi)部含有大量破碎的固有細(xì)胞、炎性細(xì)胞碎片和斷裂的真菌菌絲或孢子結(jié)構(gòu)(圖4B，C)。外圍環(huán)繞著豐富的肉芽組織，與肺臟不同的是，外圍還排列有大量多核巨細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞，周圍大量異嗜細(xì)胞，淋巴細(xì)胞聚集(圖4D)。肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝索結(jié)構(gòu)不明顯、匯管區(qū)和中央靜脈沒有明顯的規(guī)律性，肝臟輕度淤血。在不同的區(qū)域，可見多灶性炎性細(xì)胞聚集區(qū)(圖4E)。腸道固有層和黏膜層呈現(xiàn)增生性炎癥，固有層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸絨毛腫脹變性(圖4F)。

A.消化道(HE,25×)；B.消化道局部放大(HE,50×)；C.消化道肉芽腫結(jié)節(jié)局部放大(HE,200×)；D.消化道漿膜層(HE,145×)；E.肝臟(HE,100×)；F.腸道黏膜層(HE,100×)圖4 其他臟器組織病理學(xué)觀察

2.3 病原分離鑒定對(duì)所有病理樣本同時(shí)進(jìn)行了必要的細(xì)菌學(xué)檢查，革蘭染色沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌；抗酸染色未發(fā)現(xiàn)分支桿菌。對(duì)病灶樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA含量太低，無(wú)法建庫(kù)，間接證實(shí)細(xì)菌非主要病原。因此利用真菌ITS序列建庫(kù)，經(jīng)測(cè)序獲得270個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)，其中OTU1含量最高，相對(duì)豐度為91%，屬于煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)，OTU2相對(duì)豐度為7%，屬于黃曲霉菌(Aspergillusflavus)，因此，可進(jìn)一步確定該病灶主要由曲霉菌引起(圖5，表1)。對(duì)病灶樣品進(jìn)行表面消毒，通過(guò)分離培養(yǎng)方法從企鵝肺部病灶共分離12株真菌，基于對(duì)純培養(yǎng)物ITS序列的比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，對(duì)這些菌株分別鑒定，發(fā)現(xiàn)它們屬于6個(gè)種，其中煙曲霉菌分離頻率最高，占分離菌株的33%(圖6)。

圖5 分離樣品的PCR擴(kuò)增(A)和高通量測(cè)序分析(B)

圖6 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 企鵝病灶處分離真菌的18S rDNA/ITS序列 BLAST比對(duì)鑒定結(jié)果

3 討論

企鵝肺臟實(shí)質(zhì)區(qū)域組成肺房的內(nèi)壁襯以不完整的單層扁平上皮，上皮外側(cè)由彈性纖維包繞，肺房底部形成許多小的隱窩，與肺臟毛細(xì)血管相通，正是由于這種結(jié)構(gòu)上的特征，慢性損傷逐漸侵襲整個(gè)肺臟，各處的損傷嚴(yán)重程度不盡相同，最終發(fā)展為結(jié)節(jié)性肉芽腫性肺炎。本病例中，肺臟不同區(qū)域展現(xiàn)出損傷的不同階段，有的區(qū)域以纖維素性炎癥為主，有的區(qū)域以間質(zhì)性炎癥為主，隨著病情加重，發(fā)展為慢性肉芽腫性肺炎，出現(xiàn)多灶性壞死區(qū)域，最終壞死區(qū)域

無(wú)法降解，被結(jié)締組織包膜包裹，形成大小不一的結(jié)節(jié)性肉芽腫。因?yàn)楹粑到y(tǒng)為傳染源的侵襲門戶，病原可能由呼吸系統(tǒng)侵入，繼而造成其他實(shí)質(zhì)器官的損傷，并誘導(dǎo)慢性炎癥或形成肉芽腫。

本研究對(duì)樣品進(jìn)行病原的分離與鑒定，確定該病由曲霉菌引起，主要病原為煙曲霉菌。對(duì)于圈養(yǎng)的企鵝，曲霉菌病的出現(xiàn)可能與企鵝自身患有多種傳染病或慢性腎病導(dǎo)致的免疫力下降有關(guān)[8]，而且，該病的患病率與企鵝年齡有關(guān)，幼年時(shí)期相對(duì)易發(fā)病，成年后一般散發(fā)[1,9]。雌性企鵝一般4歲左右性成熟，本病歷中2歲的企鵝尚未成年，免疫力相對(duì)較低，對(duì)該病易感。大多數(shù)臨床上重要的真菌都可以通過(guò)產(chǎn)生孢子在空氣中傳播。曲霉菌種類眾多，廣泛分布于環(huán)境中，常存在于包括企鵝在內(nèi)的禽類畜舍、飼料、環(huán)境土壤和墻壁等區(qū)域。曲霉菌在潮濕的環(huán)境中會(huì)加速繁殖，孢子數(shù)量也會(huì)增加。外界的曲霉菌孢子往往通過(guò)空氣或飼料侵入動(dòng)物體內(nèi)[3]。曲霉菌一般為條件致病菌，在動(dòng)物免疫力正常的時(shí)候，不一定會(huì)造成動(dòng)物患病，但是當(dāng)動(dòng)物免疫力降低、環(huán)境潮濕或曲霉菌孢子數(shù)量增加的時(shí)候，曲霉菌可能迅速繁殖，致使動(dòng)物患病[3]。另外，圈養(yǎng)企鵝和商品化家禽養(yǎng)殖過(guò)程中常使用抗生素，其中很大部分抗生素以代謝物或原藥的形式，隨糞便和尿液排出，最終進(jìn)入周圍環(huán)境，長(zhǎng)此以往，對(duì)環(huán)境造成抗生素污染，可能使動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性。因此，抗生素類藥物在圈養(yǎng)企鵝和家禽養(yǎng)殖中的使用和管理，以及如何平衡抗生素的使用與環(huán)境生態(tài)的保護(hù)，需要更多標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范的約束和社會(huì)關(guān)注。一般情況下，曲霉菌病從呼吸道侵襲禽類，嚴(yán)重的時(shí)候也會(huì)累及其他臟器，本病例患病的企鵝也累及消化道等其他臟器，慢性炎癥可能影響動(dòng)物整個(gè)免疫系統(tǒng)，加重病情的發(fā)展。

臨床上，早期的企鵝曲霉菌病不易被診斷發(fā)現(xiàn)，需以預(yù)防為主[10]。飼養(yǎng)的時(shí)候，壓力應(yīng)激或環(huán)境改變可能也是該病的誘因。在繁殖和飼養(yǎng)企鵝的時(shí)候應(yīng)該注意環(huán)境通風(fēng)和嚴(yán)格的飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生管理，減少壓力應(yīng)激和周圍環(huán)境、空氣溫度及濕度的改變。本研究借助組織病理學(xué)觀察，六胺銀染色和PAS染色對(duì)企鵝曲霉菌病造成的病變進(jìn)行了系統(tǒng)的觀察，并對(duì)病原曲霉菌進(jìn)行初步的病原分離，為企鵝曲霉菌病的臨床診斷和企鵝的飼養(yǎng)管理提供數(shù)據(jù)支持。