一種表達(dá)eGFP的rAAV-SaCas9系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用

趙憶甜，李秀青，王曉帆，高 峰，張坤朋，翁少亭,* (.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；.安陽工學(xué)院 生命與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000)

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種相對成熟，并且簡便易行的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，是分子生物學(xué)研究和改善生物特性的常用技術(shù)[1-2]，該技術(shù)可用于制備轉(zhuǎn)基因動物[3-4]。ZHOU等[5]利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了敲除Park2和Pink1基因的細(xì)胞系，并用體細(xì)胞核移植的方法培育出了雙基因突變豬。HEO等[6]利用CRISPR/Cas9技術(shù)將eGFP序列通過同源重組的方法插入到牛多功能干細(xì)胞的Nanog基因中，使胚胎能表達(dá)出eGFP熒光蛋白。KIMURA等[7]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對斑馬魚的基因進(jìn)行了基因組定點(diǎn)編輯，通過顯微注射的方法將外源基因整合到胚胎的Evx2基因和Englb基因中。然而，轉(zhuǎn)基因動物有抗病能力弱、易癌變、繁殖障礙的缺點(diǎn)，不能被畜牧生產(chǎn)廣泛應(yīng)用。因此需要一種既能改變家畜成體生產(chǎn)性能，又不影響家畜穩(wěn)定遺傳的方法推進(jìn)畜牧業(yè)產(chǎn)能的提升。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對組織的基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯是理想的方法，但是，在組織內(nèi)進(jìn)行基因組編輯受到多種因素的影響，包括載體的選擇、Cas9蛋白的編輯效率以及內(nèi)部環(huán)境的影響等。CRISPR/Cas9的體內(nèi)表達(dá)是通過流體動力學(xué)傳遞或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的，其中病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)常用腺病毒(Ad)或腺相關(guān)病毒(AAV)載體。以AAV作為Cas9的載體是一種很有潛力的基因組定點(diǎn)編輯工具[8]。CRUDELE等[9]利用該技術(shù)對遺傳性肌營養(yǎng)不良疾病的特定肌肉區(qū)域進(jìn)行了基因編輯，改善了肌肉萎縮癥狀。然而，許多CRISPR/Cas9相關(guān)元件太大，超過AAV的容量限制(包括兩個(gè)ITR，約4.85 kb)。值得注意的是常用的化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9)約為4.3 kb，與組合必需的基因調(diào)控元件結(jié)合后超過AAV的容量。克服這一障礙的一個(gè)方法是利用來自不同原核物種的較小的Cas9同源核酸酶，如嗜熱鏈球菌Cas9(St1Cas9)、腦膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)和金黃色葡萄球菌Cas9(SaCas9)的核酸酶，都具有與SpCas9相似的酶切能力，由于它們都比SpCas9短約1 kb[10-12]，更有利于AAV的包裝。這一障礙也可以通過優(yōu)化調(diào)控元件克服。MEFFERD等[13]報(bào)道，可以由小的tRNA啟動子(約70 bp)驅(qū)動sgRNAs的表達(dá)，其大小約為帶有U6啟動子的sgRNA表達(dá)盒的一半。TABEBORDBAR等[14]重建了一個(gè)新的AAV-SaCas9載體，由EF1α啟動子驅(qū)動SaCas9的表達(dá)。還有研究人員構(gòu)建了pX601-miniCMV-SaCas9-U6-sgRNA載體，由只有39 bp的miniCMV啟動子驅(qū)動SaCas9的表達(dá)。改進(jìn)的rAAV系統(tǒng)能夠容納Cas9蛋白、sgRNA以及其他可以提高rAAV組織嗜性、靶向性或進(jìn)行熒光標(biāo)記的調(diào)控元件[15]。

肌肉生長抑制素(myostatin，簡寫MSTN，又稱GDF8)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號蛋白超家族成員，是脊椎動物肌肉質(zhì)量的重要調(diào)節(jié)因子,能抑制肌肉細(xì)胞的增殖和分化。MSTN功能障礙可促進(jìn)肌肉生長，引發(fā)動物超級肌肉表型[16-17]。世界著名的比利時(shí)蘭牛和皮埃蒙特牛就是由于Mstn基因突變導(dǎo)致的“雙肌?！?。KIRK等[18]發(fā)現(xiàn)MSTN與成年動物肌肉萎縮和肌肉再生有關(guān)，它是次級肌纖維萎縮因子，再生的肌管部分MSTN含量極低。一系列研究表明，MSTN缺乏的家畜有背膘厚、生長快、飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率高等優(yōu)良生產(chǎn)性能。本研究構(gòu)建了一個(gè)針對特定組織的rAAV-SaCas9-eGFP基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)能通過eGFP在體內(nèi)的表達(dá)間接了解rAAV-SaCas9-eGFP的存在時(shí)間以及在組織中的分布。此外，通過該系統(tǒng)敲除小鼠肌肉中的Mstn基因，可以有效地增加肌肉細(xì)胞的數(shù)量和體積，為培養(yǎng)高產(chǎn)肉用型家畜提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)胞、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物pX601(pX601-CMV:SaCas9-U6:sgRNA)、pLentiCRISPR V2、th-P2A-eGFP、pAAV9-RC和pHelper由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；TOP10感受態(tài)細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備；HEK293T細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供；8周齡C57BL/10雄性小鼠由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 試劑ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；KpnⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、AgeⅠ、BamHⅠ、BbsⅠ、T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ為NEB(北京)有限公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、RIPA裂解緩沖液為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；PEI轉(zhuǎn)染試劑為Sigma試劑公司產(chǎn)品；PEG8000、氯化銫、透析袋為源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；組織和細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；SYBR Green 染色液為莊盟生物科技有限公司產(chǎn)品；兔多克隆抗MSTN、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 psgMstn載體的構(gòu)建所有質(zhì)粒均采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA克隆技術(shù)構(gòu)建。tRNAGLN和sgRNA骨架序列(5′-GGTTCCATGGTGTAATGGTTAGCAC-TCTGGACTCTGAATCCAGCGATCCGAGTTC-AAATCTCGGTGGAACCT-GAAACACCGGAG-ACCACGGCAGGTCTCAGTTTTAGTACTCTG-GAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAA-TGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCG-AGA-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用引物tRNAGLN-F:5′-AGGCATGCTGGGGAGGTACCGGTTCCATGGTGTAATGGTT-3′，Scaf-R:5′-CTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAAAA-ATCTCGCCAACAAGTTG-3′擴(kuò)增合成序列，用ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒將其克隆至被KpnⅠ和NotⅠ酶切后的pX601-CMV:SaCas9-U6:sgRNA中。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)TOP10感受態(tài)細(xì)胞，通過測序鑒定篩選出含有質(zhì)粒pX601-CMV:SaCas9-tRNA:sgRNA的菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。用引物EF1α-F:5′-CCTGCGGCCTCTAGAC-TCGAGGTGGGCAGAGCGCACATCGC-3′，EF1-α-R:5′-TGGGGCCATGGTGGCACCGGTCCTGTGTTCTGGCGGCAAAC-3′從pLentiCRISPR V2載體中擴(kuò)增出EF1α啟動子,然后，在緊鄰pX601-CMV:SaCas9-tRNA:sgRNA SaCas9基因的XhoⅠ和AgeⅠ位點(diǎn)酶切，并用ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒將EF1α啟動子插入其中，獲得pX601-EF1α:SaCas9-tRNA:sgRNA。利用引物P2A-eGFP-F：5′-CCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGCTACTAATTTCTCCT-3′，P2A-eGFP-R：5′-ATCTG-GAACATCGTATGGGTCTTGTACAGCTCGTC-3′從th-P2A-eGFP供體中擴(kuò)增出P2A-eGFP基因，用ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒將P2A-eGFP基因克隆到BamHⅠ酶切后的pX601-EF1α:SaCas9-tRNA:sgRNA載體，獲得pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。寡核苷酸sgMstn-F:5′-CACCGAAACAATCATTACCATGCCTA-3′，sgMstn-R:5′-AAACTAGGCATGGTAATGATTGTT-TC-3′經(jīng)退火反應(yīng)形成雙鏈，將之插入到pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA的BbsⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建出質(zhì)粒pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgMstn(縮寫為psgMstn)。

1.4 rAAV9-eGFP-sgMstn病毒的包裝與純化為了包裝rAAV9-eGFP-sgMstn病毒，將HEK293T細(xì)胞以5×106個(gè)/皿密度接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，添加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞長至50%～60%融合后，按照PEI轉(zhuǎn)染試劑說明書，將psgMstn、pAAV9-RC和pHelper 3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后96 h，將細(xì)胞刮入培養(yǎng)基后統(tǒng)一收集到50 mL離心管中， 1 000×g離心10 min，收集上清到另一50 mL 離心管，將細(xì)胞重懸于5 mL的PBS中，在-80℃和37℃下對細(xì)胞懸浮液反復(fù)凍融3次，釋放細(xì)胞內(nèi)病毒。離心后取上清用0.22 μm過濾器過濾，收集細(xì)胞過濾液與之前的上清混勻，用PEG8000濃縮，通過氯化銫密度梯度柱進(jìn)行純化。經(jīng)過兩輪超速離心，分離并收集高密度病毒，通過透析袋脫鹽后置于-80℃?zhèn)溆?。將質(zhì)粒pX601從1×1011拷貝/μL稀釋至1×104拷貝/μL 作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，利用引物ITR-QPCR-F:5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′，ITR-Q-PCR-R:5′-AGGAACCCCTAGTGATG-3′，通過RT-PCR方法測定純化的rAAV9-eGFP-sgMstn的病毒滴度[19]。

1.5 rAAV9-eGFP-sgMstn在肌肉組織特定位點(diǎn)的表達(dá)AAV9對肌細(xì)胞具有嗜性強(qiáng)，有利于細(xì)胞內(nèi)的基因編輯，常被應(yīng)用于肌肉組織。將15只C57BL/10雄性小鼠分為3組，5只/組，在第1試驗(yàn)組小鼠左側(cè)大腿股四頭肌注射50 μL(5×1010vg)rAAV9-eGFP-sgMstn；在第2試驗(yàn)組小鼠左側(cè)大腿內(nèi)收肌注射50 μL(5×1010vg)rAAV9-eGFP-sgMstn；對照組小鼠的左側(cè)大腿兩處肌肉各注射50 μL PBS。在第8周處死小鼠，觀察大腿肌肉中eGFP熒光的表達(dá)與分布。

1.6 肌肉組織注射rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠大腿肌肉質(zhì)量的影響將30只C57BL/10雄性小鼠分為2組， 15只/組，試驗(yàn)組小鼠左側(cè)大腿肌肉分3個(gè)點(diǎn)注射100 μL(1×1011vg)rAAV9-eGFP-sgMstn，對照組小鼠左側(cè)大腿肌肉分3個(gè)點(diǎn)注射100 μL PBS。在第6,8,10周，每周處死5只小鼠，用熒光成像系統(tǒng)檢測組織熒光的表達(dá)。取肌肉分別進(jìn)行基因組DNA提取、總蛋白提取和肌肉組織固定。

1.7 T7核酸內(nèi)切酶1(T7E1)裂解分析根據(jù)組織和細(xì)胞DNA提取劑盒說明書提取肌肉組織基因組DNA。以純化的基因組DNA為模板，用特異性引物Mstn-Test-F:5′-CGCCTGGAAACAGCTCCT-AA-3′，Mstn-Test-R:5′-TCTCA TGCTTTAACACTGCCT-3′擴(kuò)增Mstn基因片段，擬擴(kuò)增片段大小為521 bp。PCR產(chǎn)物用T7E1裂解，裂解產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用SYBR Green 染色液孵育1 h，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。用 Imge J 定量軟件計(jì)算 Indel 率，公式為：indel(%)=100%×(1-√1-f(cut))，f(cut)=(a+b)/(a+b+c)，a 和 b 表示切割產(chǎn)生的新條帶的灰度值，c 表示未被切割條帶的灰度值。

1.8 蛋白免疫印跡分析將部分股四頭肌組織勻漿后加入500 μL RIPA裂解緩沖液(50 mmol/L TrisHCl，pH8.0，150 mmol/L NaCl，1% TritonX-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉和2 mmol/L MgCl2)，在冰上用注射器對混合物吸吹30次以上，4℃ 10 000×g離心20 min去除細(xì)胞碎片，收集上清液。用BCA法測定蛋白濃度，在樣品中加入6 ×上樣緩沖液(2.7 mol/L尿素、3.3%十二烷基硫酸鈉和0.167 mol/L Tris，pH6.7)在100℃下加熱10 min。用10% SDS-PAGE凝膠分離30 μg 蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中孵育1 h后，將膜與兔抗MSTN、兔抗GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)在4℃下孵育過夜，洗凈一抗后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶2 000)，于室溫下孵育1 h。目的蛋白用Luminata Crescento免疫印跡HRP底物檢測。

1.9 組織學(xué)分析用10%多聚甲醛固定分離的股四頭肌和內(nèi)收肌，石蠟包埋后做成組織切片，用蘇木精和伊紅染色切片[20]。每組分別在放大倍數(shù)為40×，200×的視野下分析至少5個(gè)位點(diǎn)，計(jì)算出單個(gè)肌細(xì)胞的平均橫截面積(μm2)。所有數(shù)據(jù)均用Image Proplus 6.0軟件進(jìn)行分析。

1.10 小鼠肌肉質(zhì)量注射rAAV9-eGFP-sgMstn后10周，分別取各組小鼠左側(cè)大腿的股四頭肌和內(nèi)收肌，測其質(zhì)量并記錄。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/SaCas9載體的構(gòu)建重點(diǎn)構(gòu)建了pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA載體用于包裝rAAV9-eGFP-sgMstn，該載體通過EF1α啟動子控制SaCas9和eGFP的表達(dá)，SaCas9通過自切割序列P2A與eGFP相連,通過tRNA啟動子控制sgRNA表達(dá)。P2A序列使SaCas9和eGFP能夠從同一順反子中產(chǎn)生兩個(gè)獨(dú)立的具有功能的蛋白，可通過eGFP蛋白的表達(dá)間接了解rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和SaCas9介導(dǎo)的基因編輯(圖1)。

圖1 包含EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA的SaCas9/CRISPR系統(tǒng)構(gòu)建示意圖

2.2 rAAV9-eGFP-sgMstn在肌肉組織特定位點(diǎn)高效表達(dá)eGFP,通過eGFP評估rAAV9-eGFP-sgMstn在肌肉組織特定位點(diǎn)是否表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組中，分別在小鼠左側(cè)的股四頭肌和內(nèi)收肌中可見明顯的綠色熒光，在周圍組織中未見熒光。在對照組小鼠左側(cè)的對應(yīng)肌肉中未觀察到綠色熒光(圖2)，表明rAAV9-eGFP-sgMstn在體內(nèi)肌肉細(xì)胞中成功表達(dá)，并且只存在于注射的特定部位，沒有擴(kuò)散至其他組織。這一結(jié)果為后續(xù)肌肉組織細(xì)胞的基因編輯試驗(yàn)做好了rAAV有效性及安全性驗(yàn)證。

CN.注射PBS的對照組；EG-1.股四頭肌注射rAAV9-eGFP-sgMstn的試驗(yàn)1組；EG-2.內(nèi)收肌注射rAAV9-eGFP-sgMstn的試驗(yàn)2組圖2 小鼠肌肉特定位點(diǎn)的eGFP表達(dá)

2.3 rAAV9-eGFP-sgMstn在小鼠大腿肌肉中長期穩(wěn)定表達(dá)通過熒光成像系統(tǒng)觀察到，從第6周開始，在試驗(yàn)組小鼠大腿肌肉能檢測到明顯的綠色熒光，并且一直持續(xù)至第10周，綠色熒光隨著時(shí)長的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢，而對照組小鼠大腿肌肉始終沒有熒光表達(dá)(圖3)，說明試驗(yàn)組中rAAV9-eGFP-sgMstn可在小鼠肌細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并且在一定時(shí)間范圍內(nèi)該重組病毒的表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而增加。

注：圖像范圍為2×1010～5×1010 photons/(s·cm2)；采取背側(cè)位置進(jìn)行熒光成像；CN為對照組圖3 eGFP在小鼠肌細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)

2.4 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌細(xì)胞的基因編輯通過T7酶切鑒定法檢測對Mstn基因片段的編輯效率，結(jié)果顯示，Mstn基因片段的大小為521 bp，試驗(yàn)組中目的片段下有長度分別為181,340 bp的2個(gè)條帶，而對照組中則沒有這兩條帶(圖4A)。通過對條帶的灰度分析得出試驗(yàn)組的正常Mstn片段的相對含量為79.17%，其基因編輯效率為20.83%(圖4B)。此外，Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠肌肉中MSTN蛋白水平明顯降低(圖4C)，對蛋白條帶的灰度進(jìn)一步分析得出試驗(yàn)組MSTN蛋白相對表達(dá)量為47.95%(圖4D)。結(jié)果表明，rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌細(xì)胞中的Mstn基因進(jìn)行了有效地編輯并影響了MSTN蛋白的表達(dá)。

A.T7酶切鑒定法檢測基因編輯(M.50 bp DNA Marker；CN.對照組；1～4.試驗(yàn)組)；B.Mstn基因的相對表達(dá)量(CN.對照組；KO.試驗(yàn)組)； C.MSTN蛋白免疫印跡分析(CN.對照組；1～4.試驗(yàn)組)；D.MSTN蛋白的相對表達(dá)量(CN.對照組；KO.試驗(yàn)組)。*.0.01

2.5 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌肉性狀的影響觀察小鼠肌肉組織切片發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，試驗(yàn)組小鼠股四頭肌和內(nèi)收肌顯著增大，肌細(xì)胞數(shù)量也明顯增加(圖5A)。此外，通過對每組小鼠的股四頭肌和內(nèi)收肌測定質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠股四頭肌和內(nèi)收肌的平均質(zhì)量明顯高于對照組(圖5B)。這些結(jié)果表明，肌肉組織注射rAAV9-eGFP-sgMstn可使單位面積內(nèi)肌細(xì)胞數(shù)量增多，并且使肌肉質(zhì)量增加。

A.股四頭肌和內(nèi)收肌切片蘇木精和伊紅染色(HE)結(jié)果(CN.對照組；KO.試驗(yàn)組；比例尺.200 μm)；B.10周時(shí)各組小鼠股四頭肌和內(nèi)收肌的質(zhì)量(CN.對照組；KO.試驗(yàn)組)圖5 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌肉性狀的影響

2.6 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌肉質(zhì)量的影響小鼠肌細(xì)胞切片發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組小鼠股四頭肌和內(nèi)收肌細(xì)胞橫截面積比對照組明顯增大(圖6A)。其中試驗(yàn)組小鼠股四頭肌細(xì)胞的平均橫截面積為7 806 μm2，內(nèi)收肌細(xì)胞的平均橫截面積為7 315 μm2。而對照組小鼠股四頭肌細(xì)胞的平均橫截面積為5 882 μm2，內(nèi)收肌細(xì)胞的平均橫截面積為4 985 μm2，表明rAAV9-eGFP-sgMstn使小鼠肌細(xì)胞橫截面積增大(圖6B)。

A.股四頭肌和內(nèi)收肌切片蘇木精和伊紅染色(HE)顯示肌細(xì)胞的橫截面(CN.對照組；KO.試驗(yàn)組；比例尺.50 μm)；B.各組小鼠股四頭肌和內(nèi)收肌細(xì)胞的橫截面積(CN.對照組；KO.試驗(yàn)組。數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行分析)圖6 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌細(xì)胞的影響

3 討論

目前rAAV-SaCas9系統(tǒng)已被證實(shí)能在體內(nèi)進(jìn)行定點(diǎn)基因編輯[12]，而且該系統(tǒng)有與SpCas9系統(tǒng)類似的編輯效率。因此，rAAV-SaCas9系統(tǒng)可能被用來編輯特定部位的基因，以改善組織特性和治療慢性病[21-22]。本研究構(gòu)建了一個(gè)具有不同sgRNA啟動子(tRNA promoter，72 bp)和SaCas9啟動子(EF1α promoter，212 bp)的SaCas9系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以僅通過一種rAAV傳遞到細(xì)胞中介導(dǎo)基因組編輯。

由于AAV血清型、病毒滴度和注射方法的不同，AAV在組織中介導(dǎo)的基因編輯效率是不同的[23]。本試驗(yàn)選用9型AAV進(jìn)行肌肉注射是因?yàn)?型AAV對肌肉組織有高度嗜性，病毒利用度更高，因此對特定位點(diǎn)的基因編輯效果更好。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將rAAV9-eGFP-sgMstn系統(tǒng)注入小鼠大腿肌肉后，eGFP的表達(dá)僅限于該區(qū)域內(nèi)，沒有發(fā)生病毒在周圍組織的擴(kuò)散。而且在一定時(shí)間內(nèi)，rAAV9-eGFP-sgMstn作用時(shí)間越長，eGFP的熒光強(qiáng)度越高。因此，通過eGFP表達(dá)能間接得知病毒的感染量和SaCas9的基因編輯效果。

越來越多的研究證實(shí)，成肌細(xì)胞增殖隨MSTN水平的升高而降低，通過降低或抑制MSTN活性能加速細(xì)胞周期，促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖。THOMAS等[24]和JOULIA等[25]發(fā)現(xiàn)MSTN上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑的活性和水平，從而阻止細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)變，抑制肌肉細(xì)胞的增殖，并減少肌肉纖維的數(shù)量。MCPHERROR等[26]通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建了Mstn基因突變純合體小鼠，發(fā)現(xiàn)在Mstn突變小鼠中，肌肉纖維的數(shù)量比野生型小鼠多86%，表明Mstn基因敲除導(dǎo)致肌肉纖維增殖和肥大。JI等[27]將Mstn基因敲除鼠與野生型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Mstn基因敲除后小鼠脂肪含量減少。所以，對家畜的Mstn基因進(jìn)行敲除能提高家畜產(chǎn)肉性能和瘦肉率。本研究通過核酸及蛋白分析證明，構(gòu)建的rAAV9-eGFP-sgMstn系統(tǒng)可對大腿肌肉細(xì)胞Mstn進(jìn)行有效編輯。此外，該系統(tǒng)通過敲除Mstn基因顯著改善肌肉質(zhì)量和體積，為該系統(tǒng)應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究構(gòu)建的rAAV9-eGFP-sgMstn系統(tǒng)可在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，而且只在注射的特定位點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)并對Mstn基因進(jìn)行編輯，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量和肌細(xì)胞體積顯著增大，表明rAAV9-eGFP-sgMstn系統(tǒng)在提高家畜生產(chǎn)性能方面具有巨大的潛力。