口蹄疫病毒樣顆粒誘導(dǎo)的肥大細胞活化對IgG應(yīng)答的影響

劉佳歡,崔 川,張俊娟,韓偉建,張義明,李麗敏,王家鑫 (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)所引起的一種熱性、急性和高度接觸性偶蹄類動物傳染病[1]，目前預(yù)防FMD的主要措施是疫苗接種。雖然滅活疫苗在臨床上廣泛使用，但滅活疫苗接種1次后不能誘導(dǎo)持續(xù)的保護性免疫應(yīng)答，而需要多次接種，且只能預(yù)防臨床疾病而不能阻止持續(xù)性感染，其生產(chǎn)過程中還存在安全隱患[2-4]。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)是一種無致病性的蛋白質(zhì)顆粒，不含核酸，極易被免疫細胞捕獲誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，因此VLP被廣泛用于新型疫苗的研發(fā)[5]。

肥大細胞(mast cells， MCs)廣泛分布于小血管和淋巴管周圍的結(jié)締組織內(nèi)，與樹突狀細胞(dendritic cell，DC)、巨噬細胞等一起構(gòu)成機體抗病原入侵的第一道防線[6-7]。作為組織內(nèi)的免疫細胞，MCs不僅參與炎癥反應(yīng)和纖維化，也發(fā)揮組織維持、血管生成、病原體清除和免疫調(diào)節(jié)的作用[8]。MCs通過其表面的模式識別受體識別細菌、寄生蟲與病毒結(jié)構(gòu)蛋白，從而引發(fā)MCs活化，釋放預(yù)先形成的顆粒成分(組胺、蛋白酶等)、新合成的脂質(zhì)介質(zhì)和細胞因子，從而調(diào)節(jié)固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答[9-11]，發(fā)揮其清除病原的重要作用[12-13]。MCs分泌的肝素和TNF-α與殼聚糖按一定的比例混合制成顆粒作為佐劑，與流感病毒血凝素混合制成試驗疫苗，用其免疫小鼠可有效模擬MCs的功能，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答抵抗致死量流感病毒的攻擊[14]。MCs活化后可以誘導(dǎo)機體血清中IgG水平顯著升高[15]，表明MCs的活化產(chǎn)物可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較好的體液免疫應(yīng)答。小鼠腹腔MCs在體外可以通過清道夫受體、甘露糖受體、TLR2和TLR4識別FMDV-VLP，從而引起脫顆粒和細胞因子的分泌[16-17]。特別值得注意的是，F(xiàn)MDV-VLP誘導(dǎo)的腹腔MCs脫顆粒產(chǎn)物可以促進脾初始淋巴細增殖，而其分泌成分則可以直接啟動脾初始B淋巴細胞增殖，從而抑制T淋巴細胞增殖[18]，但對于FMDV-VLP誘導(dǎo)機體皮膚、淋巴結(jié)、脾等器官內(nèi)MCs脫顆粒的作用尚不清晰。

因此，本研究制備了FMDV-VLP，用其免疫小鼠[16]，利用冰凍切片技術(shù)研究小鼠組織中的MCs脫顆粒情況，通過ELISA方法檢測小鼠外周血中FMDV特異性IgG水平及TNF-α、IL-10分泌情況，以期為研究FMDV新型佐劑及免疫應(yīng)答機制提供理論基礎(chǔ)與支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡的SPF級 BALB/c 小鼠(合格證書編號：11400700272257)購自北京維通利華實驗動物有限公司，飼養(yǎng)在獨立通風(fēng)鼠籠中。

1.2 主要試劑HEK-293T細胞和重組質(zhì)粒pET32a(+)-HBcAg(+)-VP1-VP4由本實驗室保存；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(CWS008)；BL21感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(CD201-01)；Lipofectamin 2000 Reagent購自美國Invitrogen(11668030)公司；Opti-MEMⅠ無血清培養(yǎng)基(11058021)和DMEM高糖培養(yǎng)基(10373017)購自美國Gibco公司；超濾管購自Millipore公司(UFC500396)；碳支持膜300目圓孔銅網(wǎng)購自新興百瑞技術(shù)有限公司(T200)；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(PW0072)和2%磷鎢酸染色液(PR0124844)購自北京雷根生物技術(shù)公司；甲苯胺藍染色液試劑盒購自索萊寶科技有限公司(G3661)；小鼠TNF-α(MTA00B)和IL-10(M1000B)定量ELISA檢測試劑盒均購自美國R&D Systems公司；山羊抗小鼠HRP-IgG抗體購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司(ZB-2035)；新西蘭胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(16140063)。

1.3 病毒樣顆粒的制備及Western blot鑒定將重組質(zhì)粒pET32a(+)-HBcAg(+)-VP1-VP4轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后通過無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。按照Lipofectamin 2000操作說明，將質(zhì)粒與Lipofectamin 2000混合并轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，收集轉(zhuǎn)染后60 h的培養(yǎng)上清， 利用His標(biāo)簽鎳離子蛋白純化柱純化目的蛋白。取純化后的蛋白，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，振蕩混勻后，100℃水浴5 min使蛋白質(zhì)變性，12 000 r/min離心2 min收集蛋白進行SDS-PAGE，電泳后對純化的蛋白進行Western blot鑒定。

1.4 VLP的透射電鏡鑒定在超濾管中加入200 mg/L FMDV VLP溶液200 μL，然后加入10 mL 經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾的超純水，濃縮至1 mL，重復(fù)3～4次，最后1次濃縮至200 μL。取20 μL濃縮液滴至透射電鏡銅網(wǎng)上，干燥后用2%磷鎢酸進行負染色，自然干燥后通過透射電鏡觀察。

1.5 動物試驗將20只BALB/c小鼠隨機分為2組。初次免疫采用頸背部多點注射方式，50 μg/只，注射劑量為0.2 mL(VLP組)；對照組小鼠注射同劑量PBS(PBS組)。首免后14 d進行加強免疫，VLP組和PBS組的免疫劑量和途徑均相同。對免疫后14，28 d的小鼠進行眼球采血，分離血清保存?zhèn)溆?；頸椎脫臼法處死小鼠，分別取脾臟、頜下淋巴結(jié)、頜下腺和皮膚，浸泡于4%多聚甲醛中，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MCs染色將上述組織在30%蔗糖的PBS中過夜脫水處理，用OTC包埋劑進行包埋，用-20℃恒溫冰凍切片機切成4 μm厚度的組織切片，用4%多聚甲醛固定后使其自然干燥；使用甲苯胺藍浸染組織切片10～15 min(具體的染色時間根據(jù)切片的厚度和組織不同而定)；染色后用蒸餾水輕輕沖洗，用0.5%冰乙酸分化切片，直到細胞核和顆粒清晰可見；用95%乙醇和無水乙醇使組織切片快速脫水，經(jīng)二甲苯透明后用中性樹膠封固組織切片。光學(xué)顯微鏡下隨機觀察5個視野，統(tǒng)計MCs及其脫顆粒狀況。

1.7 細胞因子檢測使用 ELISA定量檢測試劑盒分別測定小鼠血清中TNF-α和IL-10水平，具體操作方法按照說明書進行。每孔加入50 μL Assay Diluent RD1-63或Assay Diluent RD1W，再加入50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，室溫孵育2 h；每孔加入400 μL洗液，除去殘液，總共洗滌5次；每孔加入100 μL Mouse TNF-α Conjugate或Mouse IL-10 Conjugate，室溫孵育2 h；洗滌5次，加入100 μL Substrate Solution，避光室溫孵育30 min；加入100 μL Stop Solution，測定各孔D450 nm與D570 nm值。

1.8 FMDV特異性抗體檢測采用間接ELISA方法檢測血清中FMDV特異性IgG抗體。用VP1蛋白包被96孔板底部，4℃過夜；PBST洗滌3次后，用封閉液 (5%脫脂牛奶,PBS配制) 37℃封閉1 h；加入血清樣本，37℃孵育1 h；加入山羊抗小鼠HRP-IgG抗體，37℃孵育1 h；加入TMB底物，孵育后終止，測定各孔D450 nm值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理將細胞因子ELISA試驗所獲得數(shù)據(jù)用ELISACalc軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并對結(jié)果進行分析。使用GraphPad Prism 6.0 繪圖并使用Two-way ANOVA 方法進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 FMDV-VLP的Western blot鑒定結(jié)果如圖1A所示，在約47 kDa處出現(xiàn)1條蛋白條帶，與預(yù)期大小相符；將蛋白轉(zhuǎn)膜后通過Western blot鑒定，在47 kDa處可見特異性條帶，與預(yù)期大小相符，表明純化的蛋白為FMDV-VLP(圖1B)。

A.FMDV VLP的SDS-PAGE結(jié)果(M1.蛋白Marker；1.純化前的轉(zhuǎn)染后60 h細胞培養(yǎng)上清；2.純化后的轉(zhuǎn)染后60 h細胞培養(yǎng)上清)。B.FMDV VLP的Western blot鑒定結(jié)果(M2.蛋白Marker；3.純化后的轉(zhuǎn)染后60 h細胞培養(yǎng)上清)圖1 FMDV VLP的SDS-PAGE分析和Western blot鑒定

2.2 FMDV-VLP的透射電鏡鑒定結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)MDV-VLP直徑大約為30 nm，表明FMDV VP1-VP4 可以通過乙肝病毒核心抗原自組裝成FMDV-VLP。

圖2 FMDV-VLP的透射電鏡觀察結(jié)果

2.3 FMDV-VLP誘導(dǎo)小鼠MCs脫顆粒的觀察對小鼠皮膚、頜下淋巴結(jié)、脾臟和頜下腺切片的甲苯胺藍染色(圖3，4)顯示，14 dpi，MCs主要分布在表皮的小血管周圍結(jié)締組織中，并且VLP組MCs明顯脫顆粒，基本處于完全活化狀態(tài)；28 dpi，VLP組MCs在皮下組織中開始增多，且脫顆粒的MCs有增多的趨勢。在頜下淋巴結(jié)中，MCs主要分布在被膜下竇、副皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)中；PBS組髓質(zhì)中MCs非常少；14 dpi，VLP組髓質(zhì)中MCs脫顆粒數(shù)量增多但不聚集，呈現(xiàn)分散狀態(tài)；而28 dpi，VLP組髓質(zhì)中MC脫顆粒數(shù)量增多且呈聚集狀態(tài)。在脾臟中，MCs主要分布在脾索、脾竇及邊緣區(qū)，在被膜上和小梁內(nèi)未見MC分布，且脾竇中MCs脫顆粒數(shù)量有從PBS組至VLP組，從14～28 dpi有增多的趨勢。在頜下腺中，MCs散在分布于腺泡和腺導(dǎo)管周圍，且MCs脫顆粒數(shù)量亦有從PBS組至VLP組，從14～28 dpi 有增多的趨勢。以上結(jié)果表明，F(xiàn)MDV-VLP可在體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠MCs脫顆粒，由于接觸抗原的時間順序不同，在14 dpi，VLP組皮膚中主要是表皮內(nèi)的MCs脫顆粒，而淋巴結(jié)中則主要是被膜下竇的MCs脫顆粒；在28 dpi，在VLP組皮膚中，主要是皮下組織中的MCs脫顆粒，而在淋巴結(jié)中，則主要是深層髓質(zhì)的MCs脫顆粒。

注：箭頭指向MCs；VLP組左側(cè)一列為200倍放大的小鼠組織，右側(cè)一列為400倍放大的小鼠組織；PBS組左側(cè)一列為200倍放大的小鼠組織，右側(cè)一列為400倍放大的小鼠組織圖3 14 dpi組織中MCs甲苯胺藍染色結(jié)果

注：箭頭指向MCs； VLP組左側(cè)一列為200倍放大的小鼠組織，右側(cè)一列為400倍放大的小鼠組織；PBS組左側(cè)一列為200倍放大的小鼠組織，右側(cè)一列為400倍放大的小鼠組織.圖4 28 dpi組織中MCs甲苯胺藍染色結(jié)果

用甲苯胺藍對組織切片染色，在光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野統(tǒng)計MCs的數(shù)量，用GraphPad Prism 6.0軟件做圖并進行統(tǒng)計。如圖5顯示，14 dpi VLP組的皮膚(P<0.01)、淋巴結(jié)(P<0.01)和脾臟(P<0.05)中MCs脫顆粒的數(shù)目均顯著高于14 dpi PBS組，而14 dpi VLP組的頜下腺與14 dpi PBS組無顯著性差異。28 dpi VLP組的皮膚、淋巴結(jié)、脾臟MCs脫顆粒的數(shù)目均極顯著高于28 dpi PBS組(P<0.01)，而28 dpi VLP組的頜下腺亦顯著高于28 dpi PBS組(P<0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)MDV VLP可以誘導(dǎo)皮膚、淋巴結(jié)、脾臟和頜下腺中的MCs 脫顆粒，特別是皮膚和淋巴結(jié)的MCs；加強免疫后，VLP可以顯著提高皮膚和脾臟內(nèi)MCs活化水平(P<0.01)。

注：活化既包含體積變大的MCs和正在脫顆粒的細胞，又包括已經(jīng)脫顆粒細胞質(zhì)空泡化的MCs。***表示P<0.001；**表示P<0.01； *表示P<0.05；下同圖5 小鼠組織MCs活化數(shù)量統(tǒng)計圖

2.4 血液細胞因子檢測采用ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α與IL-10水平，如圖6所示，無論是初次免疫后還是再次免疫后，VLP組血清中TNF-α水平均顯著高于對照組(P<0.05)，而IL-10 水平無論是初次免疫后還是再次免疫后VLP組均與對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖6 小鼠血清中TNF-α和IL-10水平

2.5 血清中FMDV-VLP特異性IgG檢測用間接ELISA法檢測血清中FMDV特異性IgG抗體，如圖7所示，在14 dpi，試驗組血清FMDV特異性 IgG呈陰性，而在28 dpi，試驗組血清 IgG呈陽性，且顯著高于14 dpi試驗組的血清IgG水平。結(jié)果表明，加強免疫FMDV-VLP可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的IgG免疫應(yīng)答。

注：- -表示陰性和陽性的臨界值圖7 小鼠血清中FMDV特異性IgG抗體水平

3 討論

MCs主要分布在皮膚、胃腸道以及鼻黏膜等病原微生物初次接觸機體的場所，在抗細菌、抗寄生蟲、抗病毒感染方面發(fā)揮重要作用[19-21]。MCs可通過其表面表達的多種模式識別受體識別病原微生物及其結(jié)構(gòu)蛋白，引發(fā)自身活化，分泌預(yù)先儲存的或新合成的顆粒，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，這對于科學(xué)設(shè)計FMDV 新型疫苗及正確使用FMDV 疫苗具有積極的指導(dǎo)意義。

已有的研究表明，F(xiàn)MDV-VLP可以誘導(dǎo)小鼠腹腔MCs(pMCs)脫顆粒，該過程由TLR2介導(dǎo)[16]。梁慧婷等[18]發(fā)現(xiàn)FMDV-VLP 刺激PMCs可引起明顯的脫顆粒，pMCs脫顆粒產(chǎn)物對脾總淋巴細胞的增殖具有一定的促進作用。目前，關(guān)于MCs負載FMDV-VLP后脫顆粒水平的研究主要基于pMCs，并且是建立在體外模型的基礎(chǔ)上。本研究對FMDV-VLP誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)組織MCs應(yīng)答效應(yīng)進行分析，試驗結(jié)果顯示，F(xiàn)MDV-VLP可以誘導(dǎo)皮膚、淋巴結(jié)、脾臟和頜下腺中的MCs 脫顆粒，且加強免疫后VLP可以顯著提高皮膚和脾臟內(nèi)MCs活化水平，這一發(fā)現(xiàn)將有助于進一步探究VLP對DC遷移和IgG形成的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)FMDV-VLP刺激機體后TNF-α分泌顯著升高，IL-10分泌無影響，且加強免疫后FMDV-VLP可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)組織中的MCs脫顆粒，VLP組皮膚、頜下淋巴結(jié)、脾臟和頜下腺內(nèi)MCs的脫顆?，F(xiàn)象明顯強于對照組。這一結(jié)果提示，如果有病原侵入皮膚，MCs會迅速作出應(yīng)答。研究證實，MCs活化后可以促進DC和淋巴細胞向引流淋巴結(jié)遷移[15]，而加強免疫后淋巴結(jié)中脫顆粒的MCs增多，意味著其促進其他部位DC向淋巴結(jié)遷移的可能性增大，這對于啟動抗FMDV適應(yīng)性免疫應(yīng)答可能會起到十分積極的作用。脾臟主要應(yīng)對血源性病原微生物，而皮下注射50 μg FMDV-VLP不一定能進入脾臟，所以脾臟MCs脫顆粒現(xiàn)象沒有皮膚和淋巴結(jié)明顯。MCs活化后可以分泌多種細胞因子和活性物質(zhì)，在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[22-23]，這使得MCs活化劑或MCs脫顆粒產(chǎn)物表現(xiàn)出一定的免疫佐劑潛力。研究顯示，MCs活化后可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的抗原特異性血清IgG[15]，而這種現(xiàn)象的產(chǎn)生與MCs脫顆粒成分密切相關(guān)，其可以招募DC和淋巴細胞向引流淋巴結(jié)遷移，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的體液免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果證明,小鼠免疫FMDV-VLP后可以引起組織中MCs活化，同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的IgG應(yīng)答，這為進一步探究FMDV-VLP在體內(nèi)引起的免疫應(yīng)答機制提供了理論基礎(chǔ)。

本研究首次在體內(nèi)探究了FMDV-VLP對鼠MCs脫顆粒的影響，表明VLP可以誘導(dǎo)組織內(nèi)MCs脫顆粒，促進機體分泌TNF-α，并產(chǎn)生較強的IgG應(yīng)答，提示MCs脫顆粒產(chǎn)物在誘導(dǎo)小鼠機體產(chǎn)生IgG應(yīng)答方面可能發(fā)揮促進作用。在后續(xù)試驗中，我們將結(jié)合MCs脫顆粒成分可以有效輔助VLP誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的現(xiàn)象，開發(fā)可以與VLP共同應(yīng)用的免疫佐劑，為VLP疫苗新型佐劑的研發(fā)提供新思路與新方法。