林麝源大腸埃希菌的分離、鑒定及耐藥性與致病性分析

趙學(xué)亮，李 哲，王晨驍，王 娟，王興龍，黨如意，楊增岐 (西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

林麝(Moschusberezovskii)屬于偶蹄目、麝科(Moschidae)、麝屬(Moschus)，是亞洲特有野生動(dòng)物，也是我國一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物[1]。麝香是雄性成年林麝分泌物，因其廣泛的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值，被列為我國傳統(tǒng)4大名貴藥材[2]。由于人們長期以來過度捕獵以及環(huán)境破壞，野生林麝已瀕臨滅絕[3-4]，因此人工飼養(yǎng)繁殖林麝，不僅可以實(shí)現(xiàn)野生林麝資源保護(hù)，同時(shí)也可以解決麝香供需問題。在飼養(yǎng)條件下，大腸桿菌等細(xì)菌病感染已成為制約林麝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素，尤其是幼麝感染大腸桿菌后容易導(dǎo)致繼發(fā)感染，在臨床上很難治愈[4-5]。

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)又稱為大腸埃希菌，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)腸桿菌屬(Escherichia)，是臨床上最常見的革蘭陰性短桿菌病原菌之一，也是近年來動(dòng)物傳染病學(xué)及流行病學(xué)領(lǐng)域重要的研究對(duì)象之一[6-7]。一般情況下，大腸埃希菌不具有致病性，但近年來越來越多的致病性大腸埃希菌被報(bào)道，這些菌常攜帶毒力基因和耐藥基因，威脅人類及動(dòng)物健康。根據(jù)生物學(xué)特性將致病性大腸埃希菌分為5大類：腸出血性大腸埃希菌(enterohemorrhagicE.coli，EHEC)、腸致病性大腸埃希菌(enteropathogenicE.coli，EPEC)、腸黏附性大腸埃希菌(enteroaggregativeE.coil，EAEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(enteroinvasiveE.coli，EIEC)和腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(enterotoxigenicE.coli，ETEC)[8]。目前在臨床上針對(duì)大腸埃希菌引起的感染仍以抗生素治療為主，然而隨著抗生素長期的廣泛使用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并且呈現(xiàn)多重耐藥和交叉耐藥嚴(yán)重的發(fā)展態(tài)勢[9]。李怡瑾等[10]對(duì)我國陜西省、四川省林麝的腸源大腸埃希菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)青霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素都具有較強(qiáng)的耐藥性。質(zhì)粒和接合轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥基因傳遞是大多數(shù)大腸埃希菌耐藥性傳播的方式，這些基因可通過接合或轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移至其他菌中表達(dá)并穩(wěn)定傳代[11]。目前，關(guān)于林麝肺源大腸埃希菌耐藥性和致病性的研究鮮有報(bào)道。2020年陜西省安康市某林麝場林麝出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、脫水，1個(gè)月內(nèi)連續(xù)死亡6只，剖檢后可見心包腔積液、皺胃、小腸和大腸內(nèi)容物呈灰黃色半液體狀并伴鼓氣，黏膜充血，淋巴結(jié)腫脹發(fā)黑。從病死林麝肺臟分離出1株病原菌，結(jié)合多種方法確定其為大腸埃希菌，對(duì)其進(jìn)行耐藥性和致病性檢測，并設(shè)計(jì)16對(duì)引物對(duì)該菌株進(jìn)行毒力基因檢測，以期為林麝養(yǎng)殖過程中大腸埃希菌病的防制、用藥及控制耐藥性傳播提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品無菌采集陜西省安康市某林麝養(yǎng)殖場病死林麝肺臟樣本，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院進(jìn)行病原菌的分離、鑒定。

1.2 主要試劑Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基等均購自海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管及藥敏紙片等購自杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭染色液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA Marker、2×Taq PCR Master Mix均購自上海基星生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化試劑(北京)有限公司；PCR反應(yīng)引物合成及產(chǎn)物測序均由西安擎科生物科技有限公司完成。

1.3 主要儀器光學(xué)顯微鏡購自上海光學(xué)公司；PCR儀及移液槍購自Eppendorf公司；電泳儀購自北京六一儀器廠；凝膠成像儀購自Kodak公司。

1.4 引物合成16S rDNA通用引物(16S-27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，16S-1492R：5′-TACGGYTACCTTACGACTT-3′)、phoA鑒定引物(phoA-F：5′-GGCAATACACTCACTATGCGCTG-3′，phoA-R：5′-AGGATTCGCAGCATGATCCTG-3′)、分子分群所需的ChuA、YjaA、TspE4C2和arpA等4對(duì)引物[12]及毒力基因鑒定所需的sfa、cnf1、papC、hlyA、rfc、sepA、etrA、aer、faeG、fasA、eltA、estA、eaeA、exhA、stx1和stx2等16對(duì)引物[13-17]均由西安擎科生物科技有限公司合成。

1.5 細(xì)菌的分離純化用接種環(huán)無菌穿刺采集林麝樣本，分別接種于麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，于37℃溫箱中培養(yǎng)12～16 h。挑取單菌落重復(fù)培養(yǎng)純化，最后在顯色培養(yǎng)基上劃線，過夜培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征將培養(yǎng)菌落進(jìn)行革蘭染色后鏡檢。

1.6 分離菌株鑒定根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定，具體步驟按杭州濱和微生物試劑有限公司生化鑒定管操作說明進(jìn)行。phoA基因鑒定擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，27F和1492R引物各1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，50℃ 20 s，72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.7 分離菌株16S rDNA擴(kuò)增與序列分析以細(xì)菌DNA為模板，以16S rRNA基因的27F和1495R為通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，27F和1492R引物各1 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后送測序，將菌株命名為LS202010。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGA X軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.8 藥敏試驗(yàn)將菌株接種于LB培養(yǎng)基，在37℃過夜振蕩培養(yǎng)，用0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊柠準(zhǔn)瞎苓M(jìn)行比對(duì)。將菌液濃度調(diào)至1.5×107CFU/mL，均勻涂布于MH培養(yǎng)基表面，采用Kirby-Barer紙片法，將19種藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)24 h，根據(jù)抑菌圈直徑大小，參照2020中文版《M100抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》評(píng)定敏感、中介及耐藥。

1.9 分子分群及毒力基因檢測分子分群4重PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ChuA(279 bp)、YjaA(211 bp)、TspE4C2(152 bp)和arpA(400 bp)等4對(duì)引物各1 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 4 s，59℃ 20 s，30次循環(huán)；72℃ 5 min。毒力基因檢測根據(jù)文獻(xiàn)[18]進(jìn)行操作。

1.10 小鼠致病性試驗(yàn)將9只21日齡昆明小鼠隨機(jī)分為3組，每組3只。第1，2組灌服未過濾的LS202010培養(yǎng)物，分別按0.2 mL/只(2×109CFU/mL)、0.5 mL/只(5×109CFU/mL)接菌，第3組灌服生理鹽水，0.5 mL/只，作為陰性對(duì)照，接菌后分開飼養(yǎng)小鼠，觀察小鼠健康狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌的分離及生化鑒定LS202010在麥康凱培養(yǎng)基上呈光滑的桃紅色菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈黑色金屬光澤菌落，在大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基上呈藍(lán)色菌落，革蘭染色鏡檢呈陰性。生化鑒定結(jié)果顯示，LS202010對(duì)乳糖、葡萄糖、麥芽糖、三糖鐵、吲哚試驗(yàn)、蛋白胨、木糖、賴氨酸脫羧酶、甘露醇和木糖試驗(yàn)均呈陽性；VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽、硫化氫、氧化酶、山梨醇和尿素酶試驗(yàn)均呈陰性；符合大腸埃希菌的生化特征。對(duì)大腸埃希菌特異性基因phoA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測LS202010的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在761 bp處可見特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker；1～3.分離菌株LS202010圖1 分離菌株LS202010 phoA基因PCR擴(kuò)增

2.2 大腸埃希菌16S rRNA基因的測序分析以16S rRNA基因通用引物對(duì)LS202010的 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，在1 450 bp處可見特異性擴(kuò)增條帶。將測序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示，LS202010株與挪威分離株LR883965.1同源性最高，表明該菌株是大腸埃希菌。

M.DL2000 DNA Marker；1～3.分離菌株LS202010圖2 分離菌株LS202010 16S rRNA PCR擴(kuò)增

圖3 分離菌株LS202010 16S rRNA 基因序列遺傳進(jìn)化樹

2.3 藥敏檢測結(jié)果顯示，分離菌株LS202010對(duì)阿莫西林、復(fù)方阿莫西林、泰萬菌素、氨芐西林、泰樂菌素、氨芐青霉素、頭孢噻呋鈉、金霉素、新霉素、復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉、安普霉素耐藥，表明分離株LS202010具有多重耐藥性。

2.4 分子分群及毒力基因檢測分子分群結(jié)果顯示，分離菌株LS202010經(jīng)4重PCR擴(kuò)增(圖4)，可以特異性擴(kuò)增出arpA(400 bp)和TspE4C2(152 bp)基因，表明此菌株屬于A、B1、B2、C、D、E和F中的B1群。

M.DL750 DNA Marker；1.arpA；2.TspE4c2；3.ChuA；4.YjaA；5.4重PCR圖4 菌株LS202010的分群鑒定

毒力基因檢測結(jié)果顯示，分離菌株LS202010經(jīng)PCR反應(yīng)，可以擴(kuò)增出毒力基因etrA，且片段大小與預(yù)期一致(圖5)，表明此菌株屬于致病性大腸埃希菌中的EAEC。

M.DL2000 DNA Marker；1～3. etrA基因擴(kuò)增結(jié)果圖5 分離菌株etrA毒力基因PCR擴(kuò)增

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)用不同濃度的菌液腹腔接種昆明小鼠，結(jié)果顯示，菌液濃度為2×109CFU/mL組的3只小鼠均發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，精神沉郁；菌液濃度為5×109CFU/mL組的3只小鼠均發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，48 h后死亡2只；而生理鹽水對(duì)照組小鼠未發(fā)生腹瀉。對(duì)腹瀉小鼠糞便和死亡小鼠肺臟進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)和鑒定，結(jié)果分離出和原始菌相同的大腸埃希菌。

3 討論

林麝作為一種珍稀的保護(hù)動(dòng)物，目前雖然已經(jīng)在陜西、四川等多個(gè)地方規(guī)?；B(yǎng)殖，但林麝數(shù)量一直無法穩(wěn)定增長，除外界環(huán)境的變化外，細(xì)菌病感染也是制約林麝數(shù)量發(fā)展的重要原因之一[19-20]。當(dāng)動(dòng)物免疫力低下或身患創(chuàng)傷時(shí)，易感染大腸埃希菌，出現(xiàn)腹瀉、腸炎等一系列癥狀，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致死亡，使林麝養(yǎng)殖遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌還會(huì)通過動(dòng)物傳播給人類，導(dǎo)致腹瀉，腸炎等癥狀[21]。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)致瀉大腸埃希菌的研究逐漸增多，EAEC作為重要的致病菌之一，已成為腹瀉病研究的重點(diǎn)[22]。大腸埃希菌作為一種條件致病菌，可感染人、牛、羊、豬、雞等多種動(dòng)物。本試驗(yàn)首次從安康市林麝中分離純化出優(yōu)勢菌株LS202010，經(jīng)過綜合分析，證明此菌株為致瀉性大腸埃希菌中的EAEC。秦思等[23]對(duì)江蘇省2018-2019年食源性疾病中致瀉大腸埃希菌的流行特征及耐藥性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EAEC型占36.48%，多重耐藥率為64.81%。李怡瑾等[10]對(duì)林麝腸源和圈舍土源大腸埃希菌分離鑒定及耐藥基因檢測，結(jié)果顯示，2種來源的大腸埃希菌均對(duì)青霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素等常用抗生素具有較強(qiáng)耐藥性。本試驗(yàn)中大腸埃希菌分離株LS202010對(duì)阿莫西林、復(fù)方阿莫西林、泰萬菌素、氨芐西林、泰樂菌素、氨芐青霉素、頭孢噻呋鈉、金霉素、新霉素、復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉、安普霉素等抗生素耐藥，而對(duì)恩諾沙星、鏈霉素敏感，因此當(dāng)林麝患致瀉大腸埃希菌病時(shí)，可用恩諾沙星和鏈霉素交替聯(lián)合用藥。耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重的原因，除了人們對(duì)抗菌藥物盲目使用和監(jiān)管缺失外，現(xiàn)代生產(chǎn)、生活方式對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞也是驅(qū)動(dòng)耐藥性進(jìn)化和傳播的重要原因。而隨著耐藥“基因池”的不斷增大，將有更多耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，長此以往，人類未來如何贏得與細(xì)菌感染性疾病之間的“戰(zhàn)役”值得深思[24-27]。

由于菌株來源不同，攜帶毒力基因不同，其致病能力也不同，因此，檢測分離菌株攜帶的毒力基因?qū)ρ芯看竽c埃希菌的致病性具有指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)中毒力基因鑒定和小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，LS202010屬于致瀉大腸埃希菌，除含有毒力基因etrA外，該菌株是否還含有其他毒力基因還需進(jìn)一步測序分析。另外，根據(jù)分子分群結(jié)果，LS202010屬于B1群，而不同分型之間大腸埃希菌的致病性與耐藥性是否有關(guān)系，值得深入探索。

本試驗(yàn)從患病林麝體內(nèi)分離出1株優(yōu)勢菌LS202010，通過解剖觀察、細(xì)菌分離、培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢、生化鑒定、16S rRNA基因測序及分析等試驗(yàn)，表明此菌株為大腸埃希菌，藥敏試驗(yàn)和毒力基因檢測結(jié)果表明該菌具有較強(qiáng)的耐藥性和毒力基因。