山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌(Bibersteinia trehalosi)鐵結(jié)合蛋白A的原核表達(dá)與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

張疏桐，田 鑫，胡天豪，孫筱峰，張 耕，程方俊，羅獻(xiàn)梅，宋振輝,2*，郭建華,2* (.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院 免疫學(xué)研究中心，重慶 402460)

鐵在動(dòng)物機(jī)體生命活動(dòng)中扮演著重要的角色，參與電子傳遞、DNA合成、氧氣運(yùn)輸?shù)戎匾纳顒?dòng)，是血紅蛋白等動(dòng)物機(jī)體中重要化合物的組成成分[1]。一些奈瑟氏菌科和巴氏桿菌科細(xì)菌可從宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tf)、乳鐵蛋白等鐵絡(luò)合物分子中獲取鐵離子[2]，具體過(guò)程是細(xì)菌外膜上的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B(transferrin binding protein B，TbpB)與Tf結(jié)合，脫去其輔基后使Tf與跨細(xì)菌外膜的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A(transferrin binding protein A，TbpA)結(jié)合[3]，通過(guò)TbpA將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)空間，鐵離子在細(xì)胞周質(zhì)空間中被鐵結(jié)合蛋白A(ferric binding protein A，F(xiàn)bpA)識(shí)別并結(jié)合，F(xiàn)bpA將鐵離子遞呈給內(nèi)膜FbpB-FbpC復(fù)合體，再將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)入胞漿[4]。由此可見(jiàn)，F(xiàn)bpA在細(xì)菌鐵代謝及毒力作用過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

海藻糖比伯斯坦菌(Bibersteiniatrehalosi)為巴氏桿菌科比伯斯坦桿菌屬細(xì)菌，為人獸共患菌，可引起人面癰、腦膿腫、肺部感染及山羊發(fā)熱、呼吸急促、反復(fù)咳嗽、肺部出血性壞死等疾病，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[5]。相關(guān)研究表明，在巴氏桿菌科、奈瑟氏菌科等一些革蘭陰性菌中含有的FbpA能夠結(jié)合細(xì)菌周質(zhì)空間中的Fe3+，是細(xì)菌獲鐵的重要途徑，為細(xì)菌毒力發(fā)揮中不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。生物信息學(xué)分析顯示，海藻糖比伯斯坦菌含有FbpA，但其結(jié)構(gòu)和功能尚不明確，需通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)一步分析。

本研究基于本課題組對(duì)山羊源海藻糖比伯斯坦菌TbpB的相關(guān)研究，對(duì)FbpA進(jìn)行了原核表達(dá)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步探究FbpA在山羊源海藻糖比伯斯坦菌鐵吸收中的作用及山羊源海藻糖比伯斯坦菌的致病機(jī)理相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源2018年3月，本實(shí)驗(yàn)室從重慶市榮昌區(qū)某羊場(chǎng)肺部感染死亡羊只體內(nèi)分離純化得到1株細(xì)菌，編號(hào)為grc184，經(jīng)生理生化試驗(yàn)、16S rDNA、白細(xì)胞毒素蛋白、RNA聚合酶β亞基序列分析等方法鑒定其為海藻糖比伯斯坦桿菌[7]。將該菌株接種于含有10%無(wú)菌脫纖維兔血的瓊脂培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種5 mL BHI(brain heart infusion，腦心浸出液肉湯)培養(yǎng)基37℃、220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后用于DNA提取。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增取3 mL菌液，按照OMEGA公司的E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit說(shuō)明書，提取該菌株基因組DNA。根據(jù)fbpA基因兩端的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物：fbpA-F：5′-CCGCGGATCCATGAAAAAATCCC-3′；fbpA-R：5′-GCGCAAGCTTTTATTTTGCATCAAAC-3′。引物由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。以該菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得fbpA基因序列。反應(yīng)體系：Premix TaqTMHot Start Version 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL(約100 ng)，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保溫。

1.3fbpA基因的序列特征與進(jìn)化分析將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果由DNA序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、副豬嗜血桿菌(Haephilusparasuis)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae) 等的FbpA序列一起通過(guò)生物信息學(xué)軟件MEGA 7.0構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4fbpA基因的克隆取1.2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切12 h，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，與用同樣內(nèi)切酶切割后回收的pET28a載體片段用T4DNA連接酶在16℃連接16 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100 μL轉(zhuǎn)化后菌液，均勻涂布于含100 mg/L氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)16 h；挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(100 mg/L Amp)中，37℃、220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。取0.5 μL菌液，加入Premix TaqTMHot Start Version 12.5 μL及1.2中的上、下游引物各1 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL，按照1.2的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR鑒定，選取陽(yáng)性克隆菌株擴(kuò)增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，將序列正確的質(zhì)粒命名為pET28a-fbpA。

1.5 FbpA的表達(dá)按照OMEGA公司E.Z.N.A.?Plasmid DNA Mini KitⅠ試劑盒操作說(shuō)明提取重組質(zhì)粒pET28a-fbpA，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種于自誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基ZYM-5052(STUDIER FW,2005)中[8]，37℃、220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，表達(dá)目的蛋白。

1.6 滲透休克法提取FbpA取20 mL1.5中過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌充分混勻，4℃、4 000 r/min 離心20 min；收集細(xì)菌，加入10 mL含有40%蔗糖的30 mmol/L 的Tris-HCl(pH8.0)溶液，用吸管反復(fù)吹吸菌體，充分打散菌體，室溫?fù)u晃10 min； 4℃、4 000 r/min 離心30 min；棄上清，將離心管倒置于紙巾上，徹底吸干多余溶液后，迅速加入1.5 mL 5 mmol/L 的MgSO4溶液，用吸管反復(fù)吹吸沉淀，打散菌體，然后置于冰上20 min；4℃、4 000 r/min 離心30 min，小心吸取上清至1.5 mL離心管，即為Osmotic Shock溶液[9]，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.7 結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)將得到的山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌fbpA基因的核苷酸序列轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)氨基酸序列，以已知的流感嗜血桿菌FbpA空間結(jié)構(gòu)為模板，利用I-Tasser網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)其空間結(jié)構(gòu)，將預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)保存為pdb格式。根據(jù)得到的結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)PyMoL 2.3軟件將山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA結(jié)構(gòu)與已經(jīng)發(fā)表的流感嗜血桿菌、副豬嗜血桿菌、淋病奈瑟菌等菌的FbpA結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，分析預(yù)測(cè)海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA可能與鐵離子結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1fbpA基因擴(kuò)增結(jié)果取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、GoldviewⅡ核酸染料染色后，結(jié)果如圖1所示，在1 000 bp左右可見(jiàn)明亮條帶，大小符合預(yù)期。

M.DL2000 DNA Marker；1.fbpA基因擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 海藻糖比伯斯坦菌fbpA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2fbpA基因序列及其進(jìn)化分析海藻糖比伯斯坦菌grc184株fbpA基因包含1 026個(gè)堿基對(duì)，編碼341個(gè)氨基酸，略長(zhǎng)于流感嗜血桿菌(332個(gè)氨基酸)，但短于豬胸膜肺炎放線桿菌FbpA(585個(gè)氨基酸)。進(jìn)化樹分析結(jié)果如圖2所示，海藻糖比伯斯坦菌grc184株FbpA與溶血性曼氏桿菌FbpA相似性最高，二者序列一致性約為83%，海藻糖比伯斯坦菌FbpA與溶血曼氏桿菌、副豬嗜血桿菌FbpA形成1個(gè)分支，區(qū)別于人流感嗜血桿菌、人淋病奈瑟菌、人腦膜炎奈瑟菌、百日咳波氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌FbpA。

圖2 海藻糖比伯斯坦菌FbpA N-J進(jìn)化樹

2.3 FbpA蛋白表達(dá)純化后蛋白溶液經(jīng)SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色后，如圖3所示，在37 kDa左右可見(jiàn)明顯條帶，與FbpA預(yù)期大小相符。

M.蛋白預(yù)染Marker；1.FbpA蛋白圖3 FbpA SDS-PAGE結(jié)果

2.4 FbpA結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)通過(guò)I-Tasser網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA的空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示，與已經(jīng)報(bào)道的其他細(xì)菌FbpA一樣，海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(N-lobe，C-lobe)組成，借助兩個(gè)反向平行β折疊將兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的FbpA與鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合序列分析，預(yù)測(cè)出在海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA中可能與鐵離子結(jié)合的位點(diǎn)：圖4中紅色顯示的164，221，222位酪氨酸，洋紅色顯示的32位精氨酸，33位谷氨酰胺，84位精氨酸與碳酸根離子一起與鐵離子結(jié)合。這6個(gè)氨基酸空間結(jié)構(gòu)上靠近，都位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成的裂縫中，連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的β折疊充當(dāng)柔性鉸鏈，可通過(guò)旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的相對(duì)位置結(jié)合鐵離子或釋放鐵離子。

圖4 海藻糖比伯斯坦桿菌周質(zhì)FbpA的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA與鐵離子直接結(jié)合的氨基酸放大圖可見(jiàn)，F(xiàn)bpA通過(guò)這些氨基酸的氧原子與鐵離子結(jié)合(圖5)。紅色顯示的是酪氨酸，洋紅色顯示的是精氨酸，藍(lán)色顯示的是谷氨酰胺。

圖5 海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA與Fe3+結(jié)合氨基酸放大圖

3 討論

目前，蛋白原核表達(dá)的主要誘導(dǎo)方式為IPTG誘導(dǎo)，但I(xiàn)PTG誘導(dǎo)需要對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白濃度較低[13]，因此，本研究采用了自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。相較于IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)基，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基需要加入磷酸鹽、硫酸鹽、銨鹽、鎂離子、金屬離子、甘油、葡萄糖、乳糖等物質(zhì)，其制備過(guò)程較為復(fù)雜，但其誘導(dǎo)后菌液的濃度和融合蛋白的表達(dá)量顯著高于IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)基[14]。

滲透休克法是利用高滲環(huán)境使細(xì)胞收縮，同時(shí)利用EDTA螯合吸附外膜脂多糖表面上的金屬陽(yáng)離子,使細(xì)胞外膜受損,然后將收縮的細(xì)胞置入低滲環(huán)境中，由于滲透壓的變化，導(dǎo)致細(xì)胞外膜破裂，釋放周質(zhì)蛋白。相較于傳統(tǒng)的超聲破碎法，本研究采用的滲透熱休克法能夠保證提取的細(xì)胞周質(zhì)蛋白純度，避免胞內(nèi)雜蛋白混入[15]。

通過(guò)對(duì)流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、溶血曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)、和百日咳波氏桿菌(Bordetellapseudohinzii) FbpA-Fe3+結(jié)合位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)合Fe3+的氨基酸殘基幾乎全是酪氨酸和精氨酸，且均與碳酸根離子或碳酸氫根離子一起與鐵離子結(jié)合[16]。雖然海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA與哺乳動(dòng)物Tf的一級(jí)結(jié)構(gòu)只有20%的一致性，但它們的三維結(jié)構(gòu)類似，都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域間通過(guò)反向平行β折疊連接，它們的功能都是結(jié)合鐵離子。流感嗜血桿菌FbpA的晶體結(jié)構(gòu)和人Tf的晶體結(jié)構(gòu)顯示，它們結(jié)合鐵離子的位點(diǎn)也是類似的[17]，這是由于協(xié)同進(jìn)化的原因，所以細(xì)菌FbpA被稱為細(xì)菌的Tf，只不過(guò)細(xì)菌FbpA結(jié)合的是穿過(guò)外膜的鐵離子[18]。I-TASSER是由YANG等[19]開發(fā)的在線結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具，本文通過(guò)I-TASSER在線預(yù)測(cè)了海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA三維結(jié)構(gòu)，并根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的其他菌FbpA跟鐵離子結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)，預(yù)測(cè)了海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA可能與鐵離子結(jié)合的位點(diǎn)，分別是164,221,222位酪氨酸，32,84位精氨酸，33位谷氨酰胺，這些氨基酸在一級(jí)結(jié)構(gòu)上雖然相差較遠(yuǎn)，但在空間結(jié)構(gòu)上均位于蛋白質(zhì)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的裂縫中，位置靠近，與鐵離子配體結(jié)合，在動(dòng)力學(xué)上是合理的，這個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果為進(jìn)一步研究其功能提供了參考氨基酸位點(diǎn)。此外，KHAN等[18]研究發(fā)現(xiàn)，鐵結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變的FbpA結(jié)合Fe3+的能力有所下降，表明Fe3+結(jié)合位點(diǎn)氨基酸的變化對(duì)FbpA的功能有影響。

本研究運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)原核表達(dá)的海藻糖比伯斯坦菌FbpA進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，下一步會(huì)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析、晶體衍射等試驗(yàn)，以驗(yàn)證結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析的結(jié)果。