檢測羊腸道病毒RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用

董 坤，胡俊英，李卓宸，蔡夢露，章 凡，王瑋玉，王浴光，王新平 (吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 教育部人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

羊腸道病毒(caprine enterovirus,CEV)感染是近年來國內(nèi)外報(bào)道的新發(fā)傳染病[1]，臨床上多以消化道和呼吸道癥狀為特征，發(fā)病羊群呈現(xiàn)腹瀉、呼吸困難，某些羊群呈現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率。作為新發(fā)傳染病，CEV感染廣泛存在于國內(nèi)不同地區(qū)的羊群，給養(yǎng)羊業(yè)造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。引起CEV感染的病原體為腸道病毒，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬成員，是引起人類與動物臨床上以消化道、呼吸道、神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為特征的疫病的病原體之一[3-4]。根據(jù)國際病毒分類委員會(ICTV)的最新分類，腸道病毒屬共含有12個(gè)腸道病毒種(A～L)及3個(gè)鼻病毒種(A～C)，其中EV-E和EV-F主要感染牛，EV-G主要感染豬[5]。CEV作為新發(fā)現(xiàn)的病原體，目前被列為G種腸道病毒(EV-G)[6]。本實(shí)驗(yàn)室在國際上首次分離出的CEV-JL14毒株被ICTV收錄為 EV-G20 的參考毒株[7]。由于CEV為新發(fā)疫病，有關(guān)其診斷與檢測方法研究較少，雖然目前檢測CEV的方法有病毒分離、電鏡觀察和夾心ELISA方法，這些方法均有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)以及適用性[8]，但不適用于臨床樣品的快速檢測。因此急需建立一種具有快速、簡便、特異性好、靈敏度高、易操作等特點(diǎn)的檢測手段，便于對臨床樣品進(jìn)行快速檢測。本研究針對嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的新發(fā)CEV感染，建立了一種特異、敏感、快速、操作簡便且便于應(yīng)用于臨床樣品檢測的RT-PCR檢測方法，為CEV感染的診斷提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑TRIzol試劑、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶等購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)購自HyClone公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Sigma公司；青霉素(160×104U/瓶)、鏈霉素(100×104U/瓶)、瓊脂糖、核酸染料購自寶泰克生物科技(北京)有限公司；pGM-T載體購自安捷倫科技公司；DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病毒毒株及細(xì)胞培養(yǎng)CEV-JL14毒株、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)CC13B 毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。按照常規(guī)方法，應(yīng)用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)。臨床糞便樣品采自吉林省發(fā)生腹瀉與呼吸道癥狀的疑似CEV感染羊群和臨床健康羊群。將臨床樣品用PBS按照1∶10進(jìn)行稀釋，4℃、8 000 r/min離心20 min后取上清液通過0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒RNA提取及cDNA合成應(yīng)用Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒的培養(yǎng)。用病毒液接種細(xì)胞，當(dāng)約70%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收取細(xì)胞，應(yīng)用試劑盒提取RNA，置于-80℃保存?zhèn)溆?。病毒cDNA的合成參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系：3 μL隨機(jī)引物、3 μg RNA模板、1.5 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、6 μL 5×RT Buffer、1.5 μL 10 mmol/L dNTP，用無RNase的ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)至30 μL。反應(yīng)程序：30℃ 10 min，42℃ 59 min，70℃ 15 s，4℃ 1 min。制備的cDNA于-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)CEV-JL14毒株的基因組序列，設(shè)計(jì)合成1對CEV特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用于擴(kuò)增CEV 5′UTR序列。引物序列：CEV-5′UTR-F：5′-CTTTGCACGCCTGTTTTCC-3′；CEV-5′UTR-R：5′-CACACGCTCGGAGGTTGGGAT-3′。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為497 bp。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增及反應(yīng)體系優(yōu)化以上述合成的cDNA為模板，應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增目的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。將PCR反應(yīng)程序中的退火溫度設(shè)置在51～60℃，進(jìn)行退火溫度的梯度試驗(yàn)，確定PCR反應(yīng)的最適退火溫度。

1.6 產(chǎn)物的克隆與測序?qū)U(kuò)增的PCR產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳回收后，與pGM-T載體連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)陽性菌落，提取質(zhì)粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中的CEV序列進(jìn)行比對，確認(rèn)正確后，提取質(zhì)粒，命名為pGM-T-5′UTR，使用超微量核酸蛋白分析儀測定其濃度并計(jì)算拷貝數(shù)。

1.7 特異性試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR方法檢測CEV、小反芻獸疫病毒(PPRV)、BVDV陽性樣品，同時(shí)以未感染CEV的陰性樣品和ddH2O為陰性對照，確定方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)將構(gòu)建好的陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，以不同稀釋倍數(shù)的質(zhì)粒為模板，以ddH2O為陰性對照，通過上述優(yōu)化后的RT-PCR方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的敏感性。

1.9 重復(fù)性與應(yīng)用性試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR方法重復(fù)檢測上述樣品3次，確定方法的重復(fù)性。將建立的RT-PCR方法與本實(shí)驗(yàn)室已建立的雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行比對，對28份臨床樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取與鑒定提取接毒細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，提取到的RNA質(zhì)量較好，純度較高。

M.DL2000 DNA Marker；1.接毒細(xì)胞總RNA圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 目的基因擴(kuò)增將提取的接毒細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，利用CEV 5′UTR特異性引物，通過PCR擴(kuò)增目的序列片段，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增出497 bp的目的片段，與預(yù)期大小相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對照圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化將PCR反應(yīng)程序中的退火溫度設(shè)置在51～60℃，進(jìn)行退火溫度梯度試驗(yàn)，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，確定PCR反應(yīng)的最佳退火溫度，結(jié)果如圖3所示，在51～57℃時(shí)，目的條帶均較亮，本研究選取54℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

M.DL2000 DNA Marker；1～10.51～60℃；11.陰性對照圖3 確定最適退火溫度的梯度PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR方法檢測CEV、PPRV和BVDV陽性樣品，以未感染CEV的陰性樣品和ddH2O作為對照，擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，僅有感染CEV的樣品檢測結(jié)果為陽性，其余樣品檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker;1.CEV陽性樣品；2～4.PPRV、BVDV、CEV陰性樣品;5.ddH2O圖4 RT-PCR方法特異性試驗(yàn)

2.5 敏感性試驗(yàn)所提取質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為0.5 g/L，計(jì)算出pGM-T-5′UTR質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.13×1011拷貝/μL，通過稀釋使其質(zhì)?？截悢?shù)為1.13×108拷貝/μL，再按照10倍倍比稀釋，以稀釋產(chǎn)物為模板，通過RT-PCR方法進(jìn)行檢測，確定方法的敏感性。結(jié)果如圖5所示，該方法對CEV的最低檢測限為1.13×103拷貝/μL，說明該方法具有較高的敏感性。

2.6 重復(fù)性與應(yīng)用性試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR方法重復(fù)檢測上述樣品3次，結(jié)果一致，證明該方法具有良好的重復(fù)性。應(yīng)用建立的RT-PCR和雙抗體夾心ELISA對28份臨床樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示，28份臨床樣品中含有6份陽性樣品和22份陰性樣品，G種腸道病毒檢出率為21.4%，兩種方法的符合率均為100%。

M.DL2000 DNA Marker;1～9.1.13×108～1.13×100 拷貝/μL pGM-T-5′UTR;10.陰性對照圖5 RT-PCR方法敏感性試驗(yàn)

3 討論

CEV為近年來出現(xiàn)于國內(nèi)外的新發(fā)傳染病，給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。本實(shí)驗(yàn)室于2014年從發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的山羊中分離出國際上首株CEV-JL14毒株，該病毒株目前被ICTV收錄為EV-G20的參考毒株[10-11]。CEV感染可引起以消化道、呼吸道和繁殖障礙為癥狀的疾病，如果與其他病原混合感染或發(fā)生其他病原的繼發(fā)感染，會導(dǎo)致羊群的病死率增加。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CEV可與PPRV混合感染而使羊群病死率明顯增加，對養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展造成嚴(yán)重危害[12-13]。由于CEV感染是國內(nèi)外近年來新發(fā)的疫病，有關(guān)該病的診斷與鑒別方法的研究匱乏，因此，建立腸道病毒檢測方法將會為該新發(fā)病毒感染的診斷及流行病學(xué)研究提供技術(shù)手段。目前有關(guān)CEV感染的檢測方法主要包括病毒分離鑒定和免疫學(xué)方法檢測等[14]。病毒分離成本高、耗時(shí)長、分離難度大；由于毒株之間存在明顯差異，用ELISA方法檢測病毒抗原，容易出現(xiàn)假陰性，同時(shí)溫度和時(shí)間等干擾因素對方法的重復(fù)性影響較大。RT-PCR是一種快速、準(zhǔn)確、高效、可靠的檢測方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，也是當(dāng)前用于疾病快速診斷和檢測的方法[15]。本研究根據(jù)G種腸道病毒毒株的保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物并建立了檢測CEV的RT-PCR方法，在特異性試驗(yàn)中僅擴(kuò)增出CEV的目的條帶，而對BVDV、PPRV和BEV的cDNA，未擴(kuò)增出任何條帶，表明此方法具有較高的特異性；同時(shí)通過敏感性試驗(yàn)確定了該方法的最低檢測限為1.13×103拷貝/μL，表明該方法靈敏度較高。重復(fù)性與應(yīng)用性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明此方法重復(fù)性良好，有利于該疾病診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)化，具有易于大規(guī)模應(yīng)用的潛力。應(yīng)用新建立的和已有的ELISA方法進(jìn)行比對，對6份陽性樣品和22份陰性樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，兩者的符合率為100%，表明該方法可替代現(xiàn)有的ELISA方法。本研究所建立的RT-PCR方法具有檢測時(shí)間較短、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可為羊群CEV感染的快速檢測及其流行病學(xué)調(diào)查提供有效的技術(shù)支撐。