外泌體介導小反芻獸疫病毒疫苗株N75-1在細胞間的傳播

張樂言，萬陽麗，王婉澤，許其華，馬楠謌，王晶鈺，齊雪峰* (.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 700；.山東省利津縣動物疫病防治監(jiān)控中心，山東 利津 57400)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)所引起的一種跨境性傳染性疾病。該病毒侵染對象廣泛，除了山羊等小反芻獸，許多家養(yǎng)和野生的動物都表現(xiàn)出對PPRV易感[1-3]。由于PPR具有高致死率的特性，加上長期的地方流行，該病已經(jīng)成為阻遏發(fā)展中國家畜牧業(yè)發(fā)展的重大疫病之一[4-6]。因此，探究PRRV的傳播及致病機制，對PPR防控具有重大意義。PPRV是線性單股負鏈RNA病毒，其感染宿主后會抑制宿主的免疫反應[7-12]。前期研究證實PPRV侵入機體后，首先侵染宿主的上皮細胞和淋巴細胞，受感染的淋巴細胞通過淋巴和血液循環(huán)在宿主體內(nèi)擴散傳播，進而引起炎癥反應[13-20]。

外泌體是由細胞分泌的一種納米級囊泡，大小為30～130 nm，主要來源自細胞多囊泡體內(nèi)陷，包含多種功能性物質，如蛋白質、mRNA和miRNA等，是細胞轉運物質的重要載體。近年研究表明，這些物質均參與細胞間通訊和病原體轉移等過程[21-25]。自1983年外泌體首次被發(fā)現(xiàn)以來，始終被認為只是細胞間轉運物質的一種載體。直到2003年，GOLUDS等[26]根據(jù)研究結果提出了“特洛伊木馬-外泌體假說”，認為病毒能“挾持”外泌體包裹致病蛋白、基因組等病毒組分，并轉運到全身各處，引起大規(guī)模地擴散感染，為研究病毒擴散機制提供了新的方向。研究表明，病毒利用外泌體在細胞間擴散可以逃避宿主自身的免疫作用，并導致免疫功能失調，造成病毒擴散及產(chǎn)生免疫抑制[27-28]。通過對丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)等有囊膜病毒的研究，證明外泌體可以攜帶病毒的全部或部分基因組，在外泌體吸納細胞中建立增殖性感染，促進病毒的傳播，而且，外泌體介導的病毒傳播可能是病毒逃避宿主免疫作用的一種途徑[29-30]。目前，有關PPRV致病機制的研究有很多，但是PPRV在細胞間傳播機制卻還不十分清楚。我們的前期研究表明，PPRV侵染細胞會導致宿主細胞外泌體分泌水平升高[31]，提示PPRV侵染后可能會利用外泌體在宿主細胞間進行傳播。

本研究旨在分析PPRV-exosome的特征并進一步探究外泌體在介導PPRV細胞間傳播過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒及細胞本研究所用毒株為PPRV疫苗弱毒株(N75-1)，由本實驗室擴增保存。所用細胞為Vero細胞(CCL-81)，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈，并由本實驗室傳代保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品；RIPA蛋白裂解液為碧云天生物公司產(chǎn)品；胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為上海閃晶生物公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑盒為北京全式金公司產(chǎn)品；CD81抗體、CD63抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；FITC標記二抗為AbClon公司產(chǎn)品；Hoechst 33342、Triton X-100為北京索萊寶產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)為北京博奧拓達科技有限公司產(chǎn)品；GW4869為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 病毒感染分別用MOI=1，5，10的PPRV接種Vero細胞，間隔20 min搖晃，吸附1.5 h后棄掉培養(yǎng)液，同時設置陰性對照(Mock組)，將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 外泌體提取及純度檢測利用梯度超速離心法提取外泌體，具體操作：將細胞上清以300 r/min離心10 min，棄沉淀；2 000 r/min離心10 min，收集上清；10 000 r/min離心10 min除去細胞碎片，收集上清。將上清液用0.22 μm過濾器過濾，利用Exosome(外泌體)抽提試劑盒對外泌體進行進一步分離和純化，具體步驟按照試劑盒說明書進行。利用透射電子顯微鏡及Western blot檢測外泌體純度。

1.5 Western blot分析在各組待測樣本中加入RIPA裂解液，4℃裂解20 min，提取蛋白進行SDS-PAGE，通過半干轉法將蛋白質電轉至PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉4 h，封閉結束后，TBST洗滌3次，加相應的一抗溶液(CD63 1∶200，CD81 1∶200)，4℃過夜孵育，TBST洗滌5次，加二抗溶液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光試劑顯色，采集圖像。

1.6 激光共聚焦分析將 PPRV-exosome與正常的細胞進行共孵育，對病毒N蛋白進行熒光標記，利用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞中N蛋白表達情況，具體過程：將細胞(對照組和PPRV感染組)用4%的多聚甲醛室溫固定15 min，棄固定液，用PBS洗滌3次；加入0.5% Triton X-100，室溫處理10 min，PBS洗滌3次；加入5% BSA，室溫封閉2 h，PBS洗滌3次；加入一抗(抗N蛋白抗體 1∶1 000)，4℃過夜孵育，PBST洗滌4次；加入FITC標記的二抗，室溫條件下，孵育1.5 h，PBST洗滌4次；用Hoechst 33342染細胞核5 min，PBST洗滌4次；利用激光共聚焦儀器成像，觀察N蛋白表達情況。

1.7 RT-PCR法檢測外泌體中PPRV核酸水平通過RT-PCR檢測外泌體中是否包含PPRV基因組，具體步驟如下：用 TRIzol試劑分別提取外泌體RNA以及與外泌體共孵育的受體細胞總RNA，通過反轉錄獲得cDNA，以得到的cDNA為模板，根據(jù)PPRV基因組序列設計引物，進行PCR擴增。反應體系：模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，TaqMix 2 μL，以ddH2O補足20 μL。反應程序：95℃預變性30 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產(chǎn)物，使用凝膠成像儀成像并保存。

1.8 qRT-PCR法檢測PPRV核酸以1.7中獲得的cDNA作為模板，通過qRT-PCR分析細胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中PPRV核酸水平。反應體系：模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×TransStare Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，以ddH2O補足20 μL。反應程序：94℃預變性30 s；94℃變性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個循環(huán)。

1.9 GW4869處理細胞抑制外泌體分泌通過細胞毒性檢測CCK-8法確定外泌體抑制劑GW4869的工作濃度。根據(jù)文獻[31-32]，用0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μmol/L GW4869處理Vero細胞，根據(jù)細胞毒性檢測試驗結果，確定接下來試驗中GW4869的工作濃度為1.0，5.0，10.0 μmol/L。用上述濃度的GW4869預處理細胞，24 h后接種PPRV，并且設置對照，通過Western blot檢測細胞內(nèi)N蛋白的表達水平；用不同濃度(1.0，5.0，10.0 μmol/L)GW4869預處理細胞24 h，接毒后，收集外泌體，將收集到的外泌體與受體細胞共孵育，利用Western blot和qRT-PCR，檢測受體細胞內(nèi)PPRV的復制情況。

2 結果

2.1 外泌體的特征鑒定透射電子顯微鏡下觀察到外泌體呈典型的茶托樣結構，直徑約為120 nm(圖1A)。在純化后的外泌體中沒有觀察到游離的病毒顆粒。Western blot結果表明，外泌體樣品中檢測到外泌體標志蛋白CD63和CD81，且不能檢測到PPRV N和V蛋白(圖1B)，表明分離提取的外泌體純度高，且不含有病毒顆粒。qRT-PCR檢測結果表明， PPRV-exosome中可以擴增出PPRV全基因組(圖1C)。

A.透射電子顯微鏡鑒定PPRV-exosome形態(tài)(標尺=200 nm)；B.PPRV-exosome含有CD63和CD81，且不含有PPRV的N蛋白和V蛋白；C.PPRV-exosome中可以擴增出PPRV全基因組圖1 PPRV-exosome的特征

2.2 PPRV-exosome與正常Vero細胞共培養(yǎng)后細胞中PPRV增殖水平將 PPRV-exosome與細胞共孵育72 h，并設置陰性對照組(Mock-exosome)和陽性對照組(PPRV-infection)。在顯微鏡下觀察到，陰性對照組細胞形態(tài)正常，呈上皮細胞狀；與對照組相比，試驗組細胞形態(tài)表現(xiàn)異常，出現(xiàn)合胞體型細胞病變(圖2A)。在激光共聚焦顯微鏡下，與Mock-exosome共培養(yǎng)組的細胞中沒有檢出病毒N蛋白(綠色熒光)，而在PPRV-exosome組和PPRV-infection 組中觀察到清晰明亮的綠色熒光(圖2B)。Western blot檢測結果表明，PPRV-exosome組和PPRV-infection組均檢測到PPRV-N蛋白條帶，與陽性對照組相比，PPRV-exosome組N蛋白的條帶微暗，但無明顯差異(圖3A)。TCID50檢測結果表明：陽性對照組細胞的病毒滴度較高，PPRV-exosome組細胞的病毒滴度略低，但卻沒有顯著性差異，而在陰性對照組細胞中未檢測到PPRV病毒顆粒(圖3B)。

A.Vero細胞與PPRV-exosome共孵育后細胞出現(xiàn)CPE(100×)；B.免疫熒光檢測Vero細胞與PPRV-exosome共孵育后細胞中PPRV-N蛋白(400×)圖2 正常Vero細胞與PPRV-exosome共孵育后細胞中PPRV鏡檢結果

A.Western blot法檢測Vero細胞與PPRV-exosome共孵育后細胞中PPRV-N蛋白；B.Vero細胞與PPRV-exosome共孵育后細胞的病毒滴度圖3 Vero細胞與PPRV-exosome共孵育后細胞中PPRV-N蛋白及PPRV增殖水平

2.3 外泌體抑制劑處理對PPRV外泌體傳播途徑的影響根據(jù)CCK-8毒性試驗結果，確定GW4869的藥物濃度為1.0，5.0，10.0 μmol/L，用不同濃度的GW4869預處理細胞后24 h，提取外泌體，Western blot結果顯示，隨著藥物濃度的不斷升高，外泌體的標志蛋白CD63表達降低(圖4A)。用5.0，10.0 μmol/L的GW4869對細胞進行預處理，培養(yǎng)24 h后接種PPRV，對照組細胞用DMSO處理24 h后接種PPRV，接種后48 h收集細胞和細胞上清，進行Western blot和TCID50檢測。結果顯示，與對照組相比，不同濃度GW4869處理的試驗組細胞N蛋白的條帶亮度不顯著，表明N蛋白表達量無明顯差異(圖4B)；TCID50檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度GW4869處理的試驗組與對照組相比，細胞內(nèi)病毒滴度幾乎相同，無明顯差異(圖4C)。利用qRT-PCR檢測上清液中病毒RNA的含量，結果顯示，經(jīng)過GW4869預處理后，病毒RNA向細胞外的釋放水平受到明顯抑制(P<0.01)，隨著劑量增高，抑制水平也在不斷增加(圖5A)。提取不同濃度GW4869預處理后PPRV接種細胞分泌的外泌體，將外泌體與Vero細胞共孵育72 h，分別設置PPRV直接感染組和PPRV-exosome共孵育組兩個試驗組，Mock-exosome共孵育組為陰性對照組。利用qRT-PCR和Western blot技術檢測細胞內(nèi)PPRV增殖情況。Western blot檢測結果顯示，與陽性對照組相比，試驗組N蛋白表達降低，結合qPCR結果可知，試驗組Vero細胞中PPRV增殖水平均顯著降低(P<0.01)，且呈增殖水平與GW4869使用劑量成反比(圖5B，C)。

A.Western blot檢測GW4869對PPRV感染Vero細胞外泌體釋放水平的影響；B.Western blot檢測GW4869對PPRV感染Vero細胞中病毒復制的影響；C.GW4869對PPRV感染Vero細胞中病毒滴度的影響圖4 抑制外泌體釋放水平對PPRV感染Vero細胞中病毒增殖的影響

A.GW4869對PPRV感染Vero細胞培養(yǎng)上清中PPRV RNA的影響；B.GW4869對外泌體介導的PPRV在Vero細胞內(nèi)復制的影響；C.GW4869對外泌體介導的PPRV在Vero細胞中病毒滴度的影響圖5 抑制外泌體釋放對外泌體介導PPRV傳播的影響

3 討論

PPRV是一種有囊膜的線性單股負鏈RNA病毒，與同屬的其他成員間存在結構和遺傳上的相似性[32]。由于外泌體具有可以在靶細胞間自由移動的特點，病毒利用外泌體進行擴散可以逃脫宿主的免疫作用，導致免疫功能失調[33-34]。本課題組前期研究表明，PPRV侵染會導致外泌體釋放水平增加，提示PPRV侵染后可能會利用外泌體在宿主細胞間傳播[31]。

分離提取得到高純度的外泌體，排除游離的PPRV對試驗結果的干擾，是研究外泌體在病毒細胞間傳播擴散機制中作用的保證。本研究采用梯度超速離心法提取外泌體，并利用外泌體提取試劑盒對外泌體進行進一步的富集純化，該方法的可靠性已經(jīng)在前期試驗中得到驗證[35]，所得外泌體純度高，且不含有病毒粒子，符合后續(xù)試驗的要求。

一些囊膜包裹的RNA病毒在細胞間進行擴散時，可以利用外泌體包裹具有感染性的病毒基因組，促進病毒的擴散[29-30]。本研究結果證實，在PPRV-exosome中，能夠檢測到完整的PPRV全基因組。合胞體是包膜病毒感染細胞后，出現(xiàn)宿主細胞與同類細胞融合的病變現(xiàn)象。在本研究中，將PPRV-exosome與細胞共孵育，顯微鏡下觀察到細胞有明顯的合胞體出現(xiàn)，與PPRV直接感染結果相同；進一步利用激光共聚焦和Western blot檢測細胞中PPRV-N蛋白的表達水平，兩種試驗結果均顯示在吸納細胞中檢測到了PPRV-N蛋白的存在，表明PPRV可以利用外泌體包裹具有感染性的基因組，感染吸納細胞并在細胞內(nèi)復制。

本研究中所使用的GW4869是一種外泌體抑制劑，該抑制劑可以抑制神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生[36]。神經(jīng)酰胺在外泌體形成過程中起著關鍵作用，神經(jīng)酰胺的抑制會導致外泌體分泌水平下降。DOMENIS等[32,34,37]相繼證明了GW4869的使用會導致腸道病毒71、戊型肝炎病毒等病毒的釋放水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過GW4869預處理的細胞接種病毒后，細胞內(nèi)PPRV的復制并沒有受到明顯影響，但是PPRV的胞外釋放水平卻受到了顯著的抑制，尤其是PPRV在吸納細胞內(nèi)的增殖水平顯著降低，并且隨著劑量的不斷增高，抑制水平也在不斷的提高，進一步證實外泌體是PPRV在細胞間傳遞擴散的一條重要途徑。