PCV2/PCV3二價(jià)重組桿狀病毒疫苗的構(gòu)建與鑒定

徐 鵬，姜宇航，許 汪，宋利娜，李樂(lè)天，陳 競(jìng)，郝鵬飛，金寧一，任林柱，李 昌* (1.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 13006;.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 1301)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)為單鏈環(huán)狀無(wú)囊膜DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動(dòng)物病毒之一[1]。目前PCV分為PCV1、PCV2、PCV3和PCV4共4個(gè)基因型。PCV1是在PK-15細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的，不具有致病性[2]。PCV2于1991年在患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)的病豬中被發(fā)現(xiàn)，具有較強(qiáng)致病性與傳染性[3]。2016年，在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的PCV3同樣可以引起PMWS、PDNS等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)，具有致病性。2019年，周繼勇團(tuán)隊(duì)在湖南省患有呼吸道、消化道疾病和PDNS的豬群中首次發(fā)現(xiàn)一種新型豬圓環(huán)病毒——PCV4，其與PCV1～3型具有明顯的遺傳差異[5-6]。

PCV2全基因組的大小為1 767 bp或1 768 bp，具有11個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)[4]。其中ORF2負(fù)責(zé)編碼病毒的衣殼蛋白(Cap)，是病毒的主要抗原決定簇。PCV2是引起PCVAD的重要病原之一，患豬主要癥狀為消瘦、黃疸、貧血、皮膚蒼白[3]，還可以導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生PMWS，引起大量死亡，死亡率最高可達(dá)30%[7]，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。PCV3基因組全長(zhǎng)約為2 000 bp，含有3個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中ORF2編碼的衣殼蛋白(Cap)是主要的結(jié)構(gòu)蛋白與抗原決定簇[8]。PCV3感染的豬多會(huì)出現(xiàn)腹下黑斑、產(chǎn)死胎或木乃伊胎[9]，但種豬采食量和精神狀態(tài)良好，保育豬多發(fā)生混合感染，主要癥狀為精神狀態(tài)極差、高燒、扎堆、腹式呼吸等[9-10]，發(fā)病嚴(yán)重的豬場(chǎng)死亡率超過(guò)15%，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[10]。

當(dāng)前，PCV2與PCV3引起的PCVAD對(duì)世界各國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成威脅，由于這2種圓環(huán)病毒具有相似的病理特征與免疫抑制的特點(diǎn)，常常存在混合感染，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，市場(chǎng)上存在針對(duì)PCV2的多種不同類(lèi)型疫苗，例如滅活疫苗、亞單位疫苗、重組桿狀病毒滅活疫苗等，但是對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的PCV3，由于該病毒的病原學(xué)研究尚不明確，國(guó)內(nèi)外尚未有PCV3疫苗臨床審批與上市的報(bào)道。

病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是一類(lèi)由病毒的部分或全部結(jié)構(gòu)蛋白自動(dòng)組裝成的，具有與天然病毒結(jié)構(gòu)基本一致的空心蛋白顆粒[11]，不具有病毒的遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，作用于機(jī)體后能夠引起機(jī)體產(chǎn)生類(lèi)似于天然病毒感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。因其具有免疫原性良好、安全性較高等特點(diǎn)，目前已成為研制預(yù)防人或動(dòng)物病毒性感染疾病潛在的安全高效的候選疫苗之一[13]。為此，本研究以PCV2、PCV3為研究對(duì)象，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建可同時(shí)表達(dá)PCV2 Cap與PCV3 Cap的VLPs疫苗，可用于同時(shí)預(yù)防PCV2、PCV3引起的疫病，具有重要現(xiàn)實(shí)和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料含有目的基因PCV2 Cap及PCV3 Cap的質(zhì)粒、DH10 Bac大腸桿菌感受態(tài)、Sf9細(xì)胞(貼壁與懸浮)由軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所分子病毒學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成并保存；T4DNA Ligase，Color Prestained Protein Standard Broad Range購(gòu)自NEB公司；DL5000 DNA Marker、Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自BioFluX公司； TransStartFastPfu Fly Polymerase、pEASY-Blunt Simple購(gòu)自北京全式金生物有限公司；胎牛血清(FBS)、青-鏈霉素溶液購(gòu)自Gibco公司；Anti-6×His tag、HA tag抗體購(gòu)自Abcam公司；pFastBacTMDual雙載體、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；BSA、PBS、IPTG、X-gal購(gòu)自索萊寶公司；DAPI、Western blot及IP用細(xì)胞裂解液、HRP-山羊抗鼠IgG、HRP-山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成參考PCV2和PCV3的Cap基因設(shè)計(jì)引物，由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。擴(kuò)增PCV2 Cap基因的引物上游添加了NotⅠ酶切位點(diǎn)和HA標(biāo)簽，下游添加了HindⅢ酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增PCV3-Cap基因的引物上游添加了XhoⅠ酶切位點(diǎn)與His標(biāo)簽，下游添加了KpnⅠ酶切位點(diǎn)。引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 PCV2和PCV3的Cap基因擴(kuò)增引物相關(guān)信息

1.3 Cap基因的擴(kuò)增與重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建分別以含有PCV2 Cap、PCV3 Cap基因的質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)引物擴(kuò)增目的基因，PCV2-Cap擴(kuò)增條件：95℃ 5min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。PCV3-Cap擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，回收目的片段，將之克隆至pEASY-Blunt載體，并轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性的LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單克隆菌株至氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，分別用HindⅢ和NotⅠ、XhoⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，對(duì)酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pEPC2、pEPC3。

將含有PCV2 Cap基因的質(zhì)粒pEPC2與pFBD-Dual載體分別用HindⅢ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，通過(guò)T4DNA連接酶過(guò)夜連接，獲得含有PCV2 Cap基因的pFBD-Dual質(zhì)粒(pFBD-PCV2)。用XhoⅠ和KpnⅠ酶切pEPC3，回收目的基因片段PCV3 Cap，將其克隆至pFBD-PCV2，得到重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3。將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Trans5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別用HindⅢ和NotⅠ、XhoⅠ和KpnⅠ、HindⅢ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.4 重組桿粒的制備將質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有四環(huán)素(10 mg/L)、硫酸卡納霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L)、IPTG/X-Gal的藍(lán)白斑篩選平板上，37℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取白色菌落加入SOC培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3 h，按照表1所示通用引物(pUC/M13-F，p10R；pHF，pUC/M13R)進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取鑒定正確的菌株擴(kuò)增后提取桿粒，命名為Bacmid-PC2-PC3。

1.5 重組桿狀病毒的拯救接種Sf9貼壁細(xì)胞至6孔板中，27℃培養(yǎng)12 h后，更換原培養(yǎng)基為1 mL Grace's培養(yǎng)基。使用Grace's培養(yǎng)基稀釋陽(yáng)性重組桿粒Bacmid-PC2-PC3(3 μg)和PEI(4 μL)，輕輕混勻，靜置20 min后加入6孔板。27℃靜置培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基為含有10% FBS、1%雙抗的SF-900Ⅱ培養(yǎng)基。于27℃靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，待60%細(xì)胞出現(xiàn)病變(CPE)時(shí)，收取上清液為第1代重組桿狀病毒，用其繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞，并傳至第3代，命名為rBV-PC2-PC3。

1.6 Western blot驗(yàn)證PCV2、PCV3 Cap蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)低速離心收集感染rBV-PC2-PC3的SF9細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心3 min，收取上清液。SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，以1∶1 000稀釋的Anti-6× His tag及HA tag為一抗，1∶5 000稀釋的HRP山羊抗鼠IgG及山羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.7 間接免疫熒光(IFA)鑒定PCV2、PCV3 Cap蛋白的表達(dá)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf9貼壁細(xì)胞均勻鋪入6孔板，待細(xì)胞增殖至培養(yǎng)面積的70%，每孔接種10 μL重組桿狀病毒rBV- PC2-PC3，27℃培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基，用4%甲醛固定液固定30 min，用0.1% Trion X-100透化處理10 min，5%脫脂乳封閉1 h；加入1∶1 000稀釋的Anti-6× His tag與HA tag抗體，孵育2 h；加入1∶1 000稀釋的FITC-標(biāo)記的山羊抗鼠IgG與Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG，避光孵育1 h；加入1∶1 000稀釋的DAPI，避光孵育4 min，用熒光顯微鏡觀察。每步操作結(jié)束均使用PBST清洗3次。

1.8 電鏡觀察用rBV-PC2-PC3感染懸浮的Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)4 d即60%細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE時(shí)，收取細(xì)胞沉淀，超聲破碎后通過(guò)蔗糖密度梯度超速離心獲得濃縮樣品,1%磷鎢酸負(fù)染3 min后進(jìn)行電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 Cap基因的擴(kuò)增使用特異性引物進(jìn)行PCV2與PCV3 Cap基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增得到750 bp(PCV2 Cap)與 680 bp(PCV3 Cap)的目的條帶(圖1A)，與預(yù)期大小一致。分別回收目的片段并克隆至pEASY-Blunt載體，用限制性?xún)?nèi)切酶NotⅠ和HindⅢ、KpnⅠ和XhoⅠ分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后可見(jiàn)750 bp(PCV2 Cap)與680 bp(PCV3 Cap)左右的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1B)。對(duì)酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果顯示，擴(kuò)增所得的目的片段與原序列完全一致，表明成功獲得目的基因。

A.Cap基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(M.DL5000 DNA Marker;1.PCV2 Cap PCR產(chǎn)物；2.PCV3 Cap PCR產(chǎn)物)；B.重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果(M.DL5000 DNA Marker;1.重組質(zhì)粒HindⅢ和NotⅠ酶切產(chǎn)物；2.pEPC2 Cap重組質(zhì)粒；3.pEPC3 Cap重組質(zhì)粒；4.XhoⅠ和KpnⅠ酶切產(chǎn)物)圖1 Cap基因PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將含有PCV2 Cap與PCV3 Cap基因的質(zhì)粒及桿狀病毒穿梭表達(dá)載體pFBD-Dual分別用相應(yīng)的酶進(jìn)行酶切，并依次連接到pFBD-Dual上，構(gòu)建含有PCV2 Cap基因與PCV3 Cap基因的穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3(圖2A)。酶切鑒定結(jié)果如圖2B所示，質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3能夠分別切出單個(gè)基因片段(PCV2 Cap/NotⅠ+HindⅢ、PCV3 Cap/XhoⅠ+KpnⅠ)及含有2個(gè)基因的片段(PCV2 Cap-PCV3 Cap/Hind Ⅲ+KpnⅠ)，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3結(jié)構(gòu)示意圖；B.pFBD-PC2-PC3酶切鑒定(M.DL5000 DNA Marker;1.重組質(zhì)粒;2.XhoⅠ+KpnⅠ；3.NotⅠ+HindⅢ；4.HindⅢ+KpnⅠ)圖2 重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3結(jié)構(gòu)示意圖與酶切鑒定

2.3 重組桿粒的鑒定使用通用引物(pUC/M13-F+p10R；pHF+pUC/M13R)對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示，引物 pUC/M13-R、pHF擴(kuò)增得到1 500 bp左右的條帶，引物pUC/M13-F、p10R擴(kuò)增得到2 400 bp左右條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組桿粒Bacmid-PC2-PC3構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA Marker;1～5.重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3的菌液PCR驗(yàn)證(pHF+pUC/M13-R)；6～10.重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3的菌液PCR驗(yàn)證(pUC/M13-F+p10R)圖3 重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3的菌液PCR鑒定

2.4 重組桿狀病毒的拯救用重組桿粒Bacmid-PC2-PC3轉(zhuǎn)染Sf9貼壁細(xì)胞產(chǎn)生第1代桿狀病毒，轉(zhuǎn)染后48 h，與正常未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖4A)相比，Sf9細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞變圓、體積變大、細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞核明顯增大等現(xiàn)象(圖4B);轉(zhuǎn)染后120 h出現(xiàn)典型CPE現(xiàn)象，大部分細(xì)胞破裂，死亡(圖4C);表明重組桿狀病毒rBV-PC2-PC3拯救成功。

2.5 Western blot驗(yàn)證PCV2、PCV3 Cap蛋白在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)用rBV-PC2-PC3接種Sf9貼壁細(xì)胞，盲傳3代后，待細(xì)胞出現(xiàn)大約60%病變時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，收取蛋白質(zhì)上清,經(jīng)SDS-PAGE后，用鼠源Anti-6×His-tag與兔源Anti-HA作為一抗進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，PCV2 Cap大小為28 kDa(圖5A)，PCV3 Cap大小為 24 kDa(圖5B)，與理論值相符，而對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有條帶，進(jìn)一步表明PCV2-PCV3 Cap在Sf9貼壁細(xì)胞成功表達(dá)并具有反應(yīng)原性。

A.正常的Sf9細(xì)胞；B.轉(zhuǎn)染后48 h；C.轉(zhuǎn)染后120 h圖4 重組桿狀病毒的拯救(200×)

A.PCV2 Cap蛋白表達(dá)鑒定 (M.蛋白Marker；1.Sf9細(xì)胞；2.Anti-6×His-tag抗體檢測(cè)重組蛋白)；B.PCV3 Cap蛋白表達(dá)鑒定(M.蛋白Marker；1.Sf9細(xì)胞；2.Anti-HA抗體檢測(cè)重組蛋白)圖5 重組蛋白的鑒定

2.6 PCV2、PCV3 Cap蛋白表達(dá)的IFA鑒定利用鼠源Anti-6×His-tag抗體與兔源Anti-HA-tag抗體，通過(guò)IFA檢測(cè)Cap蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，正常Sf9細(xì)胞未出現(xiàn)特異性熒光(圖6A)，而感染重組病毒rBV-PC2-PC3的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光，帶有His-tag標(biāo)簽的PCV3表現(xiàn)為綠色熒光(圖6B、E、F)，帶有HA-tag標(biāo)簽的PCV2表現(xiàn)為紅色熒光(圖6C、E、F)，在同一細(xì)胞中共同表達(dá)呈淺紫色熒光(圖6F)，表明外源Cap基因在桿狀病毒中成功表達(dá)。

圖6 IFA鑒定Cap蛋白的表達(dá)(200×)

2.7 VLPs的電鏡觀察透射電子顯微鏡下觀察經(jīng)蔗糖密度梯度離心的樣品，可見(jiàn)大量大小為20 nm左右的VLPs，呈現(xiàn)正二十面體結(jié)構(gòu),表面光滑、無(wú)凸起，符合PCV的基本形態(tài)特征(圖7)。

圖7 rBV-PC2-PC3 VLPs顆粒形態(tài)

3 討論

PCV1最早于1974年在PK15細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[14]；PCV2是引起PMWS的主要病原之一，具有較強(qiáng)的致病性[15]。2016年，PALINSKI等[16]借助宏基因組測(cè)序技術(shù)從暴發(fā)PDNS疫情的美國(guó)某商品化豬場(chǎng)的患病豬中發(fā)現(xiàn)了一種新病毒，根據(jù)該病毒的基因組結(jié)構(gòu)和遺傳特性將其歸類(lèi)為新型圓環(huán)病毒，并命名為PCV3。PCV4在患有呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉和PDNS的豬中被鑒定，表明PCV4可能對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成潛在威脅[4]。

Cap蛋白作為PCV2、PCV3的重要結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)也是病毒的抗原決定簇，是進(jìn)行新型疫苗研究的首選蛋白。針對(duì)PCV2的商業(yè)化疫苗來(lái)說(shuō)，國(guó)內(nèi)外大多研制的是亞單位疫苗，即采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)或原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的Cap蛋白與佐劑混合制成有免疫效力的疫苗[19-20]。此外，還有一小部分是PCV2全基因組滅活疫苗與嵌合病毒疫苗。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，目前出現(xiàn)了多種基因工程疫苗，比如利用其他表達(dá)系統(tǒng)的亞單位疫苗，如LIU等[21]利用腺病毒共表達(dá)PCV2 Cap蛋白與豬γ干擾素，免疫小鼠后可產(chǎn)生較強(qiáng)免疫效力；CHI等[22]利用重組偽狂犬病病毒表達(dá)PCV2 Cap的VLPs免疫小鼠和豚鼠后均能使其產(chǎn)生針對(duì)性的特異性抗體；以及具有很好免疫效果PCV1-2嵌合疫苗。此外，還有一些處于實(shí)驗(yàn)室研究階段的核酸疫苗，如SYLLA等[23]構(gòu)建了Cap蛋白的重組質(zhì)粒pEGFP-Cap，并將其免疫BLAB/c小鼠，使其產(chǎn)生大量抗Cap蛋白特異性抗體，且IFN-γ和IL-10等細(xì)胞因子的表達(dá)水平也顯著升高；以及可用于區(qū)別自然感染和疫苗免疫的重組標(biāo)記疫苗[24]。目前針對(duì)基于PCV3 Cap的疫苗只有通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備出來(lái)的亞單位疫苗，如王俊偉[25]對(duì)PCV3 Cap蛋白進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出分泌型Sc蛋白與核定位Pc蛋白，且成功構(gòu)建了具有感染力的VLPs，用其免疫均可引起體液免疫與細(xì)胞免疫。

由于桿狀病毒對(duì)外源蛋白的良好承載能力以及可產(chǎn)生類(lèi)似于天然病毒結(jié)構(gòu)的VLPs，所以本試驗(yàn)使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的雙表達(dá)核載體對(duì)PCV2、PCV3 Cap進(jìn)行同時(shí)表達(dá)，做到使用一支疫苗可同時(shí)針對(duì)于2種病毒進(jìn)行免疫，降低了疫苗的生產(chǎn)成本。

本研究分別將PCV2、PCV3 Cap插入雙表達(dá)桿狀病毒載體上，獲得穿梭質(zhì)粒，并通過(guò)藍(lán)白斑篩選獲得桿粒Bacmid-PC2-PC3，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，成功獲得具有感染力的桿狀病毒rBV-PC2-PC3。將其感染Sf9細(xì)胞后，通過(guò)IFA和Western blot結(jié)果證明，利用昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了具有良好抗原性的PCV2、PCV3 Cap蛋白，所表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約28 kDa與24 kDa，成功獲得重組桿狀病毒rBV-PC2-PC3的VLPs，可為后續(xù)研究提供借鑒。