一種可視化雙重?zé)晒釸T-LAMP方法鑒別不同毒力新城疫病毒

曾婷婷，謝麗基，謝芝勛，羅思思，李 孟，黃嬌玲，張民秀，張艷芳，范 晴，鄧顯文 (廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由中等毒力或強(qiáng)毒力的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的高傳染性、高致病性和高致死性的傳染病。NDV可以感染超過250種禽類和鳥類[1]，根據(jù)全基因組遺傳進(jìn)化分析，NDV被劃分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大分支[2]，目前引起發(fā)病的NDV絕大多數(shù)是ClassⅡNDV。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)根據(jù)NDV的3個(gè)致病指數(shù)，將NDV劃分為速發(fā)型、中發(fā)型和緩發(fā)型毒株[3]，即通俗稱的強(qiáng)毒、中等毒和弱毒。決定NDV毒力的主要基礎(chǔ)是F蛋白的前體F0蛋白能否被宿主蛋白酶裂解，所以F0蛋白裂解位點(diǎn)所對應(yīng)的核苷酸序列可作為判斷NDV毒力的分子標(biāo)志[3]。目前，已有研究者建立了針對這個(gè)位點(diǎn)的不同的分子生物學(xué)鑒別檢測方法，如RT-PCR[4]及qRT-PCR方法[5]等。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是NOTOMI等[6]發(fā)明的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有使用儀器簡單、檢測結(jié)果可視化、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)勢，在各種疾病檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。本研究將分子信標(biāo)引入LAMP反應(yīng)體系，設(shè)計(jì)了一套能同時(shí)擴(kuò)增ClassⅡNDV不同基因型F基因的LAMP引物，同時(shí)設(shè)計(jì)2條針對不同毒力NDV F0蛋白裂解位點(diǎn)對應(yīng)核苷酸序列的分子信標(biāo)，建立了一套能夠通過反應(yīng)后觀測熒光信號判斷NDV毒力的雙重?zé)晒釸T-LAMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株本實(shí)驗(yàn)使用病毒株均為本實(shí)驗(yàn)室保存，具體見表1。

表1 毒株信息

1.2 主要試劑與儀器EasyPure?Viral DNA/RNA Kit，EasyPure?Quick Gel Extraction Kit，EasyScript?One-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RT-LAMP試劑盒WarmStart?LAMP Kit (DNA & RNA) 購自美國New England Biolabs(NEB)公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems購自美國 Promega公司；超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；LA-320c LAMP實(shí)時(shí)濁度儀購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司；多通道熒光成像儀ChemiDoc XRS+ Imager購自美國BIO-RAD公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)使用MEGA X軟件比對不同毒力ClassⅡ NDV的 F基因，選取F基因1～600 bp片段，使用LAMP引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.html進(jìn)行通用引物設(shè)計(jì)。使用探針在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/設(shè)計(jì)探針，在探針左右兩端加上莖環(huán)序列，形成分子信標(biāo)。中等、強(qiáng)毒NDV分子信標(biāo)的5′端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3′端標(biāo)記Dabcyl淬滅基團(tuán)；弱毒NDV分子信標(biāo)的5′端標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)，3′端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)。

1.4 核酸提取及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建按照核酸提取試劑盒說明書提取NDV毒株及其他毒株的RNA/DNA。使用引物(F:5′-ACTCAATCTATCTGTCGGGCTCA-3′，R:5′-GGCATTCTGGTTGGCTTGTAT-3′)對NDV毒株La Sota和F48E8進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，回收片段后與pMD18-T載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒后經(jīng)過SpeⅠ酶切、線性化之后體外轉(zhuǎn)錄為ssRNA，測量濃度后計(jì)算拷貝數(shù)，并保存于-80℃ 備用。

1.5 RT-LAMP方法建立將LAMP引物稀釋并合并為引物混合物，各引物濃度：F3 5 μmol/L,B3 5 μmol/L,FIP 40 μmol/L,BIP 40 μmol/L,Floop 20 μmol/L,Bloop 20 μmol/L。RT-LAMP反應(yīng)體系：2×RT-LAMP mix 12.5 μL，引物各1 μL，模板RNA 1～2 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。分別用濁度儀和水浴鍋同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。由于商品化RT-LAMP試劑盒已將各種反應(yīng)底物優(yōu)化至最優(yōu)，因此本試驗(yàn)僅進(jìn)行反應(yīng)溫度的優(yōu)化。分別將NDV La Sota和F48E8體外轉(zhuǎn)錄的ssRNA片段濃度調(diào)整為106copies/μL作為模板，進(jìn)行單重和雙重RT-LAMP反應(yīng)。單重RT-LAMP反應(yīng)的模板量為La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL，分別加入不同反應(yīng)管；雙重RT-LAMP反應(yīng)的模板量為La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL，加入同一反應(yīng)管。溫度設(shè)置為60～70℃，每個(gè)反應(yīng)升高1℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min，擴(kuò)增結(jié)束后80℃、5 min終止反應(yīng)，通過濁度儀觀測反應(yīng)起始時(shí)間和反應(yīng)產(chǎn)物的生成效率。

1.6 分子信標(biāo)的濃度優(yōu)化在最佳反應(yīng)溫度下，在反應(yīng)體系中添加分子信標(biāo)，于0.001～1.000 μmol/L優(yōu)化工作濃度，使用熒光成像儀觀測，使反應(yīng)后陽性結(jié)果熒光強(qiáng)度足夠強(qiáng)，陰性結(jié)果熒光強(qiáng)度足夠弱。

1.7 特異性試驗(yàn)和臨床樣品檢測分別使用表1中的各毒株進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，驗(yàn)證本方法的特異性。隨機(jī)選取本實(shí)驗(yàn)室2017-2018年在廣西活禽市場進(jìn)行NDV流行病學(xué)調(diào)查采集的拭子樣品，提取RNA通過RT-LAMP進(jìn)行檢測，結(jié)果與前期的F基因測序結(jié)果互相驗(yàn)證。

1.8 敏感性試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)將La Sota和F48E8體外轉(zhuǎn)錄的ssRNA 10倍梯度稀釋為1×107～1×101copies/μL，分別進(jìn)行單重和雙重RT-LAMP反應(yīng)，單重RT-LAMP反應(yīng)的模板量為La Sota或F48E8 ssRNA 1 μL，雙重RT-LAMP反應(yīng)的模板量為同濃度的La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL。將不同濃度的La Sota和F48E8 ssRNA混合進(jìn)行雙重RT-LAMP反應(yīng)，檢測不同濃度的模板對反應(yīng)體系效果的影響。濃度組合分別為La Sota 1×106copies/μL，F(xiàn)48E8 1×102copies/μL；La Sota 1×102copies/μL，F(xiàn)48E8 1×106copies/μL；La Sota 1×107copies/μL，F(xiàn)48E8 1×103copies/μL；La Sota 1×103copies/μL，F(xiàn)48E8 1×107copies/μL。以上每個(gè)組合的每種模板各1 μL。

2 結(jié)果

2.1 引物設(shè)計(jì)使用LAMP引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站和探針在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站，獲得一套通用引物和分子信標(biāo)。LAMP引物在單核苷酸多態(tài)性豐富的區(qū)域采用了簡并堿基，分子信標(biāo)位于F0蛋白裂解位點(diǎn)對應(yīng)的核苷酸位點(diǎn)，根據(jù)該位點(diǎn)的堿基組合方式，針對強(qiáng)毒、弱毒NDV各設(shè)計(jì)了2條分子信標(biāo)，相關(guān)信息見表2。

表2 LAMP引物及分子信標(biāo)信息

2.1 RT-LAMP反應(yīng)溫度及分子信標(biāo)濃度優(yōu)化觀測不同溫度的反應(yīng)起始時(shí)間，結(jié)果顯示，在65℃時(shí)，濁度儀檢測到單重和雙重RT-LAMP反應(yīng)對模板的擴(kuò)增起始時(shí)間最早，擴(kuò)增效率最高。通過添加不同工作濃度的分子信標(biāo)，反應(yīng)結(jié)果如圖1顯示，分子信標(biāo)的工作濃度為0.2 μmol/L時(shí)，可獲得最優(yōu)的觀測結(jié)果。反應(yīng)后使用熒光成像儀在FAM通道下，強(qiáng)毒為綠色，弱毒無色；在CY5通道下，弱毒為紅色，強(qiáng)毒無色。雙重RT-LAMP則2個(gè)通道都顯色，2個(gè)通道合并后為黃色，陰性對照則在2個(gè)通道下均為無色。

第1排.FAM通道；第2排.CY5通道；第3排.2個(gè)通道合并。1～8.陽性對照；9～16.陰性對照。分子信標(biāo)濃度：1，9.0.8 μmol/L；2，10.0.6 μmol/L；3，11.0.4 μmol/L；4，12.0.2 μmol/L；5，13.0.1 μmol/L；6，14.0.05 μmol/L；7，15.0.025 μmol/L；8，16.0.01 μmol/L圖1 不同濃度分子信標(biāo)的熒光成像圖

2.2 特異性試驗(yàn)和臨床樣品檢測以表1中毒株的RNA/DNA為模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，檢測反應(yīng)的特異性，結(jié)果如圖2顯示，在濁度儀下，NDV毒株均有擴(kuò)增，其他病原無擴(kuò)增；在熒光成像儀下，NDV毒株C/Ulster/67、GX1806quail、GX1802pi-geon和La Sota均只顯示紅色熒光，其余NDV毒株只顯示綠色熒光，其他病原無熒光產(chǎn)生，證明本檢測方法可特異性鑒別檢測不同毒力NDV。隨機(jī)選取20份本實(shí)驗(yàn)室2017-2018年在廣西活禽市場對各種活禽進(jìn)行NDV流行病學(xué)調(diào)查時(shí)采集的拭子樣品[7-8]通過RT-LAMP檢測，結(jié)果顯示，RT-LAMP檢測結(jié)果與通過對樣品進(jìn)行NDV分離鑒定和分離株F基因測序后推導(dǎo)的強(qiáng)弱毒株結(jié)果一致?；旌细腥静煌蛐偷臉悠肪芡瑫r(shí)顯示出2種熒光(圖3)。

A.濁度儀觀測NDV毒株特異性試驗(yàn)(1.NDV-/Ulster/67；2.NDV-GX1806 quail；3.NDV-GX1802 pigeon；4.NDV-La Sota；5.NDV-Mukteswar；6.NDV-GX1807 spotted dove；7.NDV-GX1808 spotted dove；8.NDV-GX1701 spotted dove)。B.濁度儀觀測NDV毒株特異性試驗(yàn)(1.NDV-GX1810 turtle dove；2.NDV-GX1811 turtle dove；3.NDV-GX1812 pigeon；4.NDV-GX1/00；5.NDV-GX6/02；6.NDV-GX9/03；7.NDV-GX12/04；8.NDV-F48E8)。C.濁度儀觀測NDV毒株和其他常見禽類病原體特異性試驗(yàn)(1.NDV-GX19/2011；2.NDV-159 Francolinus pintadeanus19；3.NDV-158 Francolinus pintadeanus18；4.IBV-H120；5.AIV- Duck/Guangxi/1/04；6.AIV-A/Duck/42846/07；7.AIV-A/Chinese Francolin/Guangxi/020B7/2010；8.ILTV-Beijing strain)。D.濁度儀觀測NDV毒株和其他常見禽類病原體特異性試驗(yàn)(1.Mycoplasma gallisepticum-S6；2.FAdV4-GX001；3.Escherichia coli；4.Pasteurella multocida；5.Salmonella；6.陰性對照)。E.熒光成像儀觀測NDV毒株和其他常見禽類病原體特異性試驗(yàn)(1.NDV-/Ulster/67；2.NDV-GX1806 quail；3.NDV-GX1802 pigeon；4.NDV-La Sota；5.NDV-Mukteswar；6.NDV-GX1807 spotted dove；7.NDV-GX1808 spotted dove；8.NDV-GX1701 spotted dove；9.NDV-GX1810 turtle dove；10.NDV-GX1811 turtle dove；11.NDV-GX1812 pigeon；12.NDV-GX1/00；13.NDV-GX6/02；14.NDV-GX9/03；15.NDV-GX12/04；16.NDV-F48E8；17.NDV-GX19/2011；18.NDV-159 Francolinus pintadeanus19；19.NDV-158 Francolinus pintadeanus18；20.IBV-H120；21.AIV- Duck/Guangxi/1/04；22.AIV- A/Duck/42846/07；23.AIV- A/Chinese Francolin/Guangxi/020B7/2010；24.ILTV- Beijing strain；25.Mycoplasma gallisepticum-S6；26.FAdV4-GX001；27.Escherichia coli；28.Pasteurella multocida；29.Salmonella；30.陰性對照)圖2 特異性試驗(yàn)

1～23.拭子樣品；24.陰性對照圖3 雙重?zé)晒釸T-LAMP檢測活禽拭子樣品

2.3 敏感性試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)La Sota和F48E8體外轉(zhuǎn)錄的ssRNA原始濃度分別為2.1×107copies/μL 和2.3×107copies/μL，將它們的濃度都調(diào)整為1×107copies/μL后，10倍梯度稀釋至1×107～1×101copies/μL。單重RT-LAMP結(jié)果如圖4顯示，對La Sota和F48E8 ssRNA模板的最低檢測量均為100 copies/μL，雙重RT-LAMP結(jié)果顯示，對2種模板同時(shí)檢測的最低檢測值也為100 copies/μL。根據(jù)反應(yīng)起始時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)，檢測到最低檢測濃度模板的時(shí)間于30 min內(nèi)。干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示，對相差104倍的模板濃度，該方法仍能對不同的模板進(jìn)行有效擴(kuò)增，達(dá)到鑒別檢測的目的(圖5)。

A.濁度儀觀測F48E8敏感性試驗(yàn) (1.1×107 copies/μL；2. 1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)；B.濁度儀觀測La Sota敏感性試驗(yàn) ( 1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)；C.濁度儀觀測2種模板混合敏感性試驗(yàn) ( 1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)；D.熒光成像儀觀測敏感性試驗(yàn) (第1排.F48E8；第2排.La Sota；第3排.2種模板混合；1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)圖4 敏感性試驗(yàn)

1.La Sota 1×106 copies/μL；2.F48E8 1×102 copies/μL；3.La Sota 1×106 copies/μL 和F48E8 1×102 copies/μL 混合；4.陰性對照；5.La Sota 1×102 copies/μL；6.F48E8 1×106 copies/μL；7.La Sota 1×102 copies/μL 和F48E8 1×106 copies/μL 混合；9.La Sota 1×107 copies/μL；10.F48E8 1×103 copies/μL；11.La Sota 1×107 copies/μL 和F48E8 1×103 copies/μL 混合；12.陰性對照；13.La Sota 1×103 copies/μL；14.F48E8 1×107 copies/μL；15.La Sota 1×103 copies/μL和F48E8 1×107 copies/μL混合；16.陰性對照圖5 干擾試驗(yàn)

3 討論

LAMP技術(shù)發(fā)明以來，不斷發(fā)展改進(jìn)，從一開始通過觀測反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀來判定結(jié)果，發(fā)展到加入SYBR Green Ⅰ或鈣黃綠素、TE等染料觀測結(jié)果[9-10]，雖然提高了可視性，但SYBR Green Ⅰ往往需要反應(yīng)后開蓋加入，非常容易產(chǎn)生氣溶膠污染，且SYBR Green Ⅰ、鈣黃綠素、TE等都不能區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物、引物二聚體和非特異擴(kuò)增。所以，范晴等[11]在前人研究基礎(chǔ)上，通過在FIP上標(biāo)記熒光基團(tuán)，反應(yīng)后通過電泳觀測結(jié)果，從而消除引物二聚體或非特異擴(kuò)增所產(chǎn)生的假陽性，且能達(dá)到1個(gè)反應(yīng)體系同時(shí)鑒別檢測2種病原的目的。但這也需要開蓋并通過電泳完成，為了達(dá)到不開蓋觀察結(jié)果的目的，謝志勤等[12]在LAMP反應(yīng)體系中引入TaqMan探針，LAMP反應(yīng)過程中，TaqMan探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后再被水解，產(chǎn)生游離熒光基團(tuán)，反應(yīng)完成后可通過熒光成像儀觀測結(jié)果。分子信標(biāo)是由TYAGI等[11]發(fā)明的一種熒光標(biāo)記的分子探針，具有較高的靈敏度和極強(qiáng)的特異性，分子信標(biāo)可與實(shí)時(shí)定量PCR相結(jié)合檢測目標(biāo)基因，也可用于雙鏈DNA和蛋白質(zhì)的檢測[14]。本研究使用分子信標(biāo)與RT-LAMP技術(shù)相結(jié)合，反應(yīng)前由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)，分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠近，熒光被淬滅，反應(yīng)后，在80℃溫度下分子信標(biāo)被打開，退火至室溫過程中，與目標(biāo)片段結(jié)合，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，發(fā)出熒光，通過熒光成像儀的對應(yīng)通道觀測熒光，且無需開蓋，防止了氣溶膠污染。

NDV的HN、M和P蛋白均可以影響NDV的毒力，但主要影響因素仍然是F0蛋白可否被宿主蛋白酶裂解為F1和F2蛋白，促進(jìn)病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜融合從而感染宿主細(xì)胞[15]。絕大多數(shù)的中等毒力、強(qiáng)毒力NDV的F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸基序?yàn)?12R/K-R-Q-K/R-R-F117，而弱毒力NDV的基序?yàn)?12G/E-K/R-Q-G/E-R-L117。近年來分離到的鴿源NDV，雖然使用雞作為致病指數(shù)測定的動物，顯示為中等毒力或弱毒，但對鴿子仍然表現(xiàn)為強(qiáng)毒[16]。因此，OIE仍然將F0蛋白裂解位點(diǎn)的核苷酸序列作為判斷NDV毒力的分子標(biāo)志，在實(shí)際監(jiān)測中也仍然符合絕大多數(shù)的NDV毒力特征。本研究基于這個(gè)分子標(biāo)記設(shè)計(jì)分子信標(biāo)，達(dá)到鑒別診斷不同毒力NDV的目的。

多年來不同實(shí)驗(yàn)室對NDV的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，不同基因型和不同毒力的NDV在同一個(gè)個(gè)體中共存是非常普遍的現(xiàn)象[8,17-18]，在之前的監(jiān)測和診斷工作中，鑒別同一個(gè)個(gè)體是否感染不同毒力的NDV，需要經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增和測序等步驟，耗時(shí)長且人力、物力需求大，不利于大批量的流行病學(xué)調(diào)查和診斷。本方法可以快速鑒別不同毒力NDV，且在水浴鍋內(nèi)可完成全部反應(yīng)，直接通過熒光成像儀觀測結(jié)果，具有快速、高通量的特點(diǎn)，可以使大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的效率大大提高。

綜上所述，本研究建立的區(qū)分不同毒力NDV的可視化雙重?zé)晒釸T-LAMP檢測方法，可以在30 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增不同毒力的NDV，最低檢測量達(dá)到100 copies/μL，并且在熒光成像儀下，可以通過不同的熒光色鑒別診斷不同毒力的NDV，為提高NDV的診斷和監(jiān)測效率提供了新的技術(shù)手段，也為在不同試驗(yàn)條件下檢測其他病原體提供了新的思路。