去泛素化酶抑制劑b-AP15抑制馬立克氏病病毒的復(fù)制

于 翀,王文婧，謝知航，周正軒，王 婷，范青松，王夢(mèng)涵，呂 巖，許家翠，艾永興 (吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062)

馬立克氏病(Marek's disease,MD)是致病型馬立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起雞的一種烈性傳染病，表現(xiàn)為免疫抑制、多臟器淋巴瘤和神經(jīng)麻痹等，常引發(fā)其他病原合并感染以及死亡。MD在世界各地廣泛存在，我國(guó)與埃及是MD的高發(fā)病率國(guó)家[1]。接種MD疫苗是控制MD暴發(fā)的最主要手段。近幾十年來(lái)，隨著疫苗的廣泛使用，MDV的毒力一直在不斷增強(qiáng)，出現(xiàn)了毒力更強(qiáng)的超強(qiáng)(very virulent，vv)和超超強(qiáng)(very virulent plus，vv+)型MDV株，這些毒株可造成感染雞發(fā)生嚴(yán)重的腦水腫和數(shù)日內(nèi)急性死亡[2-4]。通常每種新MD疫苗使用后約10年，就會(huì)出現(xiàn)毒力更強(qiáng)的毒株，而最有效的CVI988/Rispens疫苗早已超過(guò)了這個(gè)使用時(shí)限[2,5-6]，常有免疫雞群再次暴發(fā)MD的報(bào)道[4,7]，因此，MD對(duì)我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)仍是重要威脅。研究發(fā)現(xiàn)，MD疫苗只能暫時(shí)控制MD的暴發(fā)，但不能阻止MDV對(duì)MD疫苗免疫雞的感染以及在雞細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和釋放。MD疫苗免疫使雞壽命延長(zhǎng)，為侵入雞細(xì)胞內(nèi)的MDV提供了充足的時(shí)間進(jìn)行增殖、變異、成熟和傳播[3,5]。因此，經(jīng)MD疫苗免疫并被MDV強(qiáng)毒株感染而不發(fā)病的雞，就成為MDV新的傳染源。與此同時(shí)，疫苗免疫引起的免疫壓力還促進(jìn)MDV毒力不斷增強(qiáng)[3]。因此，世界各國(guó)都在努力探尋各種辦法加強(qiáng)MD的防控，包括使用免疫佐劑調(diào)節(jié)劑、采用新接種方式、構(gòu)建新型基因工程苗、培育抗性雞等方法[3,8-9]，同時(shí)還致力于闡明MDV致病分子機(jī)制的研究[10-15]，探尋可用于阻止MDV感染、增殖的靶點(diǎn)和通路，進(jìn)而通過(guò)抑制MDV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制阻止MDV致病、切斷傳染源、彌補(bǔ)疫苗免疫的“短板”。MDV編碼的病毒型去泛素化酶UL36參與淋巴瘤的形成[16-17]，通過(guò)突變抑制其去泛素化酶活性可以抑制MDV在雞細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，也可降低MD的發(fā)生率，減少M(fèi)DV的水平傳播[17]。而UL36的N端去泛素化酶(UL36 N端包含催化結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)的480個(gè)氨基酸片段，UL36-480)在所有致病型MDV株中完全保守[18]，這也說(shuō)明其活性對(duì)MDV生命活動(dòng)至關(guān)重要。本研究以去泛素化酶UL36-480為靶點(diǎn)，高通量篩選對(duì)UL36-480活性有抑制作用的化合物，并利用MDV細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)模型以及MD動(dòng)物模型進(jìn)一步確定所篩選化合物對(duì)MDV復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞和毒株SPF級(jí)9日齡雞胚和1日齡雛雞購(gòu)于北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；CEF細(xì)胞根據(jù)常規(guī)方法制備[19]；MDV-J1株購(gòu)于北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，液氮保存。

1.2 主要試劑與儀器包括b-AP15(CAS 1009817-63-3)、GW7647(CAS 265129-71-3)、Rottlerin(CAS 82-08-6)、MLN9708(CAS 1201902-80-8)、6-Thioguanine(CAS 154-42-7)、Spautin-1(CAS 1262888-28-7)、Epoxomicin(CAS 134381-21-8)、MG132(CAS 133407-82-6)、USP7/USP47 inhibitor(CAS 1247825-37-1)、Pimozide(CAS 2062-78-4)、Aprotinin(CAS 9087-70-1)、Bestatin(CAS 58970-76-6)等在內(nèi)的2 448個(gè)蛋白酶抑制劑初選庫(kù)購(gòu)于MCE(中國(guó))皓元生物公司；Strep-Ub-PLA2底物、UL36-480去泛素化酶由本實(shí)驗(yàn)室制備保存[18]；各種常用分析純化學(xué)試劑均購(gòu)于鼎國(guó)公司；去泛素化酶切反應(yīng)緩沖液10×Reaction Buffer(500 mmol/L HEPES，1 g/L BSA，5 mmol/L EDTA，10 mol/L DTT)及Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)于長(zhǎng)春三邦化學(xué)公司；DMEM、ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、Gibco胎牛血清(FBS)購(gòu)于一向科技公司；LA Taq DNA聚合酶購(gòu)于TaKaRa公司； EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒購(gòu)于全式金公司；雞淋巴細(xì)胞分離液由天津?yàn)蠊旧a(chǎn)；FluoroMax 4熒光分光光度計(jì)購(gòu)自HORIBA Scientific公司；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)26610購(gòu)自ThermoFisher公司。

1.3 載體和引物用于定量分析的含有UL36 N端1 025個(gè)氨基酸片段編碼基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-T-UL36-1025為前期研究構(gòu)建[18]，其引物UL36 F：5′-AGTCCTGCGTCTTCAGTT-3′和UL-36 R：5′-CAGAAGTCGCTATTGTCC-3′由Genewiz公司合成。

1.4 UL36-480抑制劑的篩選以UL36-480酶水解Strep-Ub-PLA2底物反應(yīng)體系為基礎(chǔ)[18,20]，以低于114 μmol/L的化合物能抑制UL36-480水解反應(yīng)視為有效抑制作用[21]。反應(yīng)體系：114 μmol/L化合物、 3 nmol/L UL36-480、1 μg Strep-Ub-PLA2、2 μL 10×Reaction Buffer，加滅菌H2O至20 μL。反應(yīng)條件：先將含有不同化合物但無(wú)Strep-Ub-PLA2底物的反應(yīng)體系在4℃孵育1 h，然后補(bǔ)充1 μg 的Strep-Ub-PLA2，于37℃孵育1 h；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行15% SDS-PAGE，分析結(jié)果。在0～114 μmol/L梯度稀釋篩選出的化合物，進(jìn)一步確定完全抑制UL36-480活性的最低有效濃度。

1.5 b-AP15對(duì)UL36-480酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析反應(yīng)體系包含不同濃度(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 μmol/L)的熒光底物Ub-AMC，1.4中確定的5 μmol/L b-AP15、3 nmol/L UL36-480、10 μL 10×Reaction Buffer，加滅菌H2O至100 μL。反應(yīng)條件：先將不同濃度的b-AP15分別與UL36-480在4℃孵育1 h， 然后加入不含Ub-AMC的反應(yīng)體系，37℃孵育2 min，再加入U(xiǎn)b-AMC后立即將熒光比色皿放于熒光分光度計(jì)進(jìn)行熒光值檢測(cè)。應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件擬合酶動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，計(jì)算相關(guān)參數(shù)，分析b-AP15對(duì)UL36-480的抑制作用。對(duì)于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制按公式Ki=[I]/(Vmax/Vmaxinh-1)計(jì)算Ki值[22]，其中Vmaxinh為有抑制劑條件下的最大反應(yīng)速度，Vmax為無(wú)抑制劑條件下的最大反應(yīng)速度，[I]為抑制劑濃度，Ki為抑制常數(shù)。再應(yīng)用Cheng-Prusoff方程計(jì)算IC50，對(duì)于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制使用公式IC50=Ki(1+Km/[S])計(jì)算IC50值[23-24]，其中Ki為抑制常數(shù)，[S]為底物濃度，Km為米氏常數(shù)，IC50為50%抑制濃度。

1.6 b-AP15對(duì)CEF細(xì)胞安全濃度確定96孔板每孔鋪入3×104個(gè)CEF細(xì)胞，用培養(yǎng)基將b-AP15稀釋成濃度梯度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 μmol/L)，待細(xì)胞貼壁后更換含有梯度濃度b-AP15的培養(yǎng)基，終體積為100 μL，37℃培養(yǎng)3 d后，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并根據(jù)CCK-8說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞活力，細(xì)胞活力>90%視為無(wú)顯著影響[25]，進(jìn)而確定b-AP15對(duì)CEF細(xì)胞的安全濃度。利用Origin 2019作圖，橫坐標(biāo)為藥物濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

1.7 b-AP15對(duì)MDV CPE的影響六孔板中每孔鋪入8×105個(gè)CEF細(xì)胞， 貼壁長(zhǎng)成單層后，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別更換為含有等體積DMSO或安全濃度b-AP15的培養(yǎng)基，并以120 PFU/孔接毒，3 d后在顯微鏡下觀察MDV的CPE變化，統(tǒng)計(jì)每孔CPE個(gè)數(shù)及面積。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

1.8 定量分析b-AP15對(duì)MDV在CEF細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響首先將質(zhì)粒pMD18-T-UL36-1025的質(zhì)量濃度換算成拷貝數(shù)濃度，換算公式如下：拷貝數(shù)濃度(copy/μL)=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/μL)÷質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量×NA(阿伏伽德羅常數(shù))，再以一定拷貝數(shù)梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行q-PCR，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，橫坐標(biāo)為拷貝數(shù)(102，103，104，105，106，107共6個(gè)拷貝數(shù)梯度)的log值，縱坐標(biāo)為Ct值，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，反應(yīng)條件參考q-PCR試劑盒說(shuō)明。應(yīng)用EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒提取步驟1.7中每孔細(xì)胞的總基因組，提取方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所有最終洗脫DNA體積均40 μL。以1 μL各處理組細(xì)胞基因組DNA為模板，應(yīng)用引物UL36 F/UL36 R進(jìn)行q-PCR，將每組得到的Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程得到拷貝數(shù)，再乘以40即為每孔所含總MDV基因組的拷貝數(shù)。每組進(jìn)行3次重復(fù)。

1.9 b-AP15對(duì)MDV在雞T淋巴細(xì)胞中復(fù)制的影響將1日齡SPF雛雞隨機(jī)分為3組，每組5只，分3個(gè)房間隔離飼養(yǎng)，均在1日齡時(shí)腹腔接種0.2 mL MDV-J1(約100 PFU)。參考文獻(xiàn)以及前期藥物安全劑量預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定給藥劑量[26]，2個(gè)試驗(yàn)組雞每日腹腔注射2 mg/kg和5 mg/kg的b-AP15，無(wú)藥物處理組雞每日腹腔注射等量滅菌生理鹽水(含等量藥物溶劑DMSO)，做為對(duì)照組。雞均在接種后21 d(感染后MDV增殖峰值期)采集外周抗凝血，按照雞T淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)分離T淋巴細(xì)胞[27]，每組取1×104個(gè)T淋巴細(xì)胞提取基因組，并應(yīng)用引物UL36 F/UL36 R進(jìn)行q-PCR分析。

2 結(jié)果

2.1 b-AP15抑制UL36-480的去泛素化酶活性如圖1所示，用Strep-Ub-PLA2作為底物對(duì)蛋白酶抑制劑初選庫(kù)進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在114 μmol/L濃度條件下，b-AP15對(duì)UL36-480水解Strep-Ub-PLA2反應(yīng)具有抑制作用，無(wú)水解產(chǎn)物產(chǎn)生，而其他化合物對(duì)UL36-480的酶活性均無(wú)抑制作用，UL36-480仍能水解Strep-Ub-PLA2產(chǎn)生PLA2和Strep-Ub兩種產(chǎn)物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)(圖2)，濃度高于10 μmol/L 的b-AP15均可完全抑制3 nmol/L UL36-480的酶活性，無(wú)水解產(chǎn)物產(chǎn)生。根據(jù)結(jié)果，選擇5 μmol/L的b-AP15用于3 nmol/L UL36-480抑制動(dòng)力學(xué)分析。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～12.分別為添加了化合物GW7647、ML-323、MLN9708、6-Thioguanine、Spautin-1、Epoxomicin、MG132、USP7/USP47 inhibitor、Pimozide、Aprotinin、Bestatin和b-AP15在UL36-480酶切反應(yīng)體系；13.只含反應(yīng)Buffer的空白組；14.無(wú)抑制劑的UL36-480酶切反應(yīng)體系；15.Strep-Ub-PLA2蛋白圖1 部分化合物對(duì)UL36-480催化反應(yīng)的影響

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6.分別添加50，20，10，5，2，1 μmol/L b-AP15的UL36-480酶切反應(yīng)體系；7.Strep-Ub-PLA2蛋白圖2 不同濃度b-AP15對(duì)UL36-480催化反應(yīng)的影響

2.2 b-AP15非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 UL36-480的酶活性檢測(cè)5 μmol/L b-AP15對(duì)3 nmol/L UL36-480水解不同濃度Ub-AMC的抑制作用，使用GraphPad Prism 8.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如圖3所示，無(wú)抑制劑條件下，UL36-480的Vmax為4.022 nmol·L-1·s-1，Km為0.691 μmol/L；添加5 μmol/L的b-AP15的條件下，UL36-480的Vmax為3.042 nmol·L-1·s-1，Km為0.691 μmol/L。據(jù)此判定b-AP15對(duì)UL36-480的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，Ki值為15.52 μmol/L。底物濃度為0.8 μmol/L時(shí)b-AP15對(duì)3 nmol/L的 UL36-480的IC50為8.33 μmol/L。

A.米氏方程曲線(xiàn)；B.雙倒數(shù)擬合曲線(xiàn)。V.初始反應(yīng)速度；[S].底物濃度；UL36-480.無(wú)抑制劑組；b-AP15.加b-AP15組圖3 b-AP15對(duì)UL36-480抑制動(dòng)力學(xué)分析

2.3 b-AP15抑制MDV在CEF細(xì)胞中的復(fù)制為進(jìn)一步分析b-AP15是否影響MDV在CEF細(xì)胞中的復(fù)制，先確定b-AP15在CEF上的安全劑量。如圖4所示，CCK-8法分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中含1 μmol/L b-AP15時(shí)，細(xì)胞活力未發(fā)生顯著變化(細(xì)胞活力>90%)，因此，后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)使用低于1 μmol/L的b-AP15。應(yīng)用0.25，0.50 μmol/L的b-AP15處理接種了MDV的CEF，鏡下可見(jiàn)CPE個(gè)數(shù)減少，面積減小(圖5)。對(duì)各孔總CPE進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)與無(wú)b-AP15的對(duì)照組相比，b-AP15顯著抑制CPE的產(chǎn)生，對(duì)照組的CPE平均為111個(gè)，而b-AP15處理組的CPE個(gè)數(shù)和每孔CPE平均面積都顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(表1)。將含有UL36基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行拷貝數(shù)梯度稀釋?zhuān)⒌臉?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=43.131-1.702ln(x)，其中y為Ct值，x為拷貝數(shù)。提取各處理組細(xì)胞的基因組DNA，并進(jìn)行定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算各處理孔中MDV的拷貝數(shù)，如表2所示，b-AP15處理組中所含MDV的拷貝數(shù)顯著低于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，0.50 μmol/L b-AP15處理組MDV的拷貝數(shù)減少到1/407，0.25 μmol/L b-AP15處理組MDV的拷貝數(shù)減少到1/65。這些結(jié)果說(shuō)明，b-AP15 有效抑制了MDV在CEF上的CPE，并抑制MDV在CEF細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

表2 b-AP15對(duì)MDV在CEF中復(fù)制的影響

圖4 不同濃度b-AP15條件下CEF細(xì)胞活力分析

表1 b-AP15對(duì)MDV在CEF上的CPE的影響

圖6 MDV拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4 b-AP15抑制MDV在雞T淋巴細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制如表3所示，與對(duì)照組相比， b-AP15處理組T細(xì)胞中MDV基因組拷貝數(shù)顯著降低(P<0.01)，2 mg/kg b-AP15組降低到1/47，5 mg/kg b-AP15組降低到1/375。此結(jié)果表明，腹腔注射b-AP15可顯著抑制MDV在雞T細(xì)胞中的復(fù)制。

表3 b-AP15對(duì)MDV在雞T細(xì)胞中復(fù)制的影響

3 討論

泛素化修飾與去修飾過(guò)程是參與幾乎所有細(xì)胞進(jìn)程的蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)節(jié)機(jī)制。宿主細(xì)胞編碼的以及一些病原體編碼的泛素化相關(guān)酶與去泛素化酶對(duì)這種機(jī)制的調(diào)節(jié)都影響著細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，使其成為一些疾病的研究靶點(diǎn)[28]，如細(xì)胞內(nèi)的去泛素化酶USP1參與DNA損傷的修復(fù)，其抑制劑具有抗癌作用[29]。USP7不但是諸多病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也是維持基因組穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)酶[30]。病毒編碼的與泛素化調(diào)節(jié)相關(guān)的E1、E2、E3酶、去泛素化酶以及調(diào)節(jié)這些酶的蛋白可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)泛素化組的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抑制宿主細(xì)胞內(nèi)參與免疫調(diào)節(jié)的泛素化系統(tǒng)[27,31-32]。揭示這些病毒編碼的蛋白活性特點(diǎn)、闡明其對(duì)宿主細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于了解病毒致病機(jī)理以及研發(fā)靶向藥物具有重要的價(jià)值。許多動(dòng)物病毒可以編碼類(lèi)似的蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HSV、KSHV、EBV、MDV、PRV、HCMV、SARS-CoV、MERS-CoV等病毒編碼USP類(lèi)去泛素化酶[33-35]，EAV、PRRSV、CCHFV、DUGV等編碼OTU類(lèi)去泛素化酶[36-37]。SARS-CoV、MERS-CoV編碼的去泛素化酶對(duì)這2種病毒的致病性至關(guān)重要，2種病毒的去泛素化酶的抑制劑可分別特異性抵抗這2種病毒，并且無(wú)交叉反應(yīng)[38]。因此，以病毒編碼的去泛素化酶為靶點(diǎn)研發(fā)抗病毒藥物，是解決疫苗“短板”的一個(gè)重要策略。

本研究的前期工作已制備出有活性的MDV編碼的去泛素化酶UL36，確定了其水解底物的特異性以及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)[18]，并揭示MDV可通過(guò)控制雞CD4+T細(xì)胞的泛素化組進(jìn)而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成瘤[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)突變破壞UL36去泛素化酶活性可以抑制MDV在雞細(xì)胞內(nèi)的增殖，減少腫瘤發(fā)生并降低MDV的水平傳播能力[16-17]。據(jù)此，應(yīng)用特異地靶向UL36的藥物抑制MDV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，不但能增強(qiáng)MD疫苗的免疫效果，也可直接用于抵抗MDV。前期的研究發(fā)現(xiàn)，MDV編碼的UL36的催化活性區(qū)與其他病毒編碼的去泛素化酶甚至同一皰疹病毒屬所編碼的去泛素化酶在氨基酸序列、空間結(jié)構(gòu)以及催化的底物特異性等方面均存在顯著性差異。本研究所建立的初選庫(kù)均為各種蛋白酶體或去泛素化酶抑制劑，經(jīng)過(guò)本研究的篩選也證實(shí)，只有個(gè)別抑制劑對(duì)MDV編碼的UL36具有抑制作用，也說(shuō)明這些去泛素化酶在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)水平上存在差異，所以可產(chǎn)生抑制作用的化合物也不同。因此，本研究通過(guò)篩選以及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析，確定所篩選化合物的靶向性，盡可能減少所篩選化合物在細(xì)胞水平的脫靶效應(yīng)，也為未來(lái)臨床應(yīng)用時(shí)盡可能減少毒副作用奠定基礎(chǔ)。

本研究所中篩選出的b-AP15對(duì)UL36的酶活性、MDV的CPE以及復(fù)制具有顯著的抑制作用。已有研究發(fā)現(xiàn)b-AP15是UCHL5 和 USP14等去泛素化酶的特異性抑制劑，可以誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞、B淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞的凋亡[39-41]，并抑制荷瘤小鼠腫瘤的增殖[40]。在病毒相關(guān)研究中，只發(fā)現(xiàn)b-AP15可通過(guò)抑制人T細(xì)胞的UCH37和USP14進(jìn)而逆轉(zhuǎn)HIV的潛伏期，促進(jìn)艾滋病的治療[42]，但b-AP15針對(duì)于其他病毒的研究還未見(jiàn)報(bào)道。動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含有數(shù)百種去泛素化酶，b-AP15除了抑制MDV的UL36，是否還通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)其他去泛素化酶或其他類(lèi)型的酶進(jìn)而抑制MDV復(fù)制，還需要進(jìn)一步對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行研究。在本研究中，使用了3 μmol/L 的b-AP15，此濃度高于b-AP15誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞凋亡的濃度(1 μmol/L)[39-41]，但本研究未發(fā)現(xiàn)b-AP15誘導(dǎo)雞CEF凋亡，可能跟人與雞細(xì)胞內(nèi)泛素化調(diào)控凋亡的機(jī)制存在差異有關(guān)。MD雞模型水平的研究發(fā)現(xiàn)，使用報(bào)道5 mg/kg的每日用藥量可顯著抑制MDV在雞T細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。對(duì)照組在攻毒后20 d未出現(xiàn)明顯的腫瘤，只有個(gè)別雞有腸出血現(xiàn)象，但給藥組雞肝臟出現(xiàn)非MD的病變，這可能與b-AP15毒性有關(guān)。將每日用藥量降至2 mg/kg，給藥雞的肝臟仍有少量病變，而未用藥的對(duì)照組無(wú)此現(xiàn)象。因此，進(jìn)一步開(kāi)展b-AP15在雞體的藥代動(dòng)力學(xué)與毒理學(xué)研究，可為b-AP15抗MD的臨床使用提供重要依據(jù)。

本研究確定了b-AP15可抑制MDV在雞細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，試驗(yàn)中為防止雞紅細(xì)胞中基因組的干擾，也為確定等量T淋巴細(xì)胞內(nèi)MDV基因組的真實(shí)變化，消除MDV或b-AP15可能改變血液中T細(xì)胞含量對(duì)試驗(yàn)的影響，本研究使用了等數(shù)量的所分離的雞外周血T細(xì)胞進(jìn)行MDV基因組拷貝數(shù)變化的分析。另一重要原因是，雞T細(xì)胞是MDV最主要的復(fù)制場(chǎng)所，所以此方法所獲結(jié)果可直接體現(xiàn)MDV在雞體內(nèi)的變化，也為進(jìn)一步研究b-AP15是否影響MDV通過(guò)T細(xì)胞浸潤(rùn)毛囊細(xì)胞完成包裝、成熟以及釋放活動(dòng)提供直接參考。

由于MD疫苗不能抑制MDV在雞細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、成熟和釋放，因此，b-AP15抑制MDV在雞細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可彌補(bǔ)疫苗免疫的不足，b-AP15可作為疫苗的增強(qiáng)劑用于臨床研究。同時(shí)，本研究結(jié)果為b-AP15的分子改造以減少毒副作用以及推動(dòng)抗MD靶向新藥的研發(fā)提供了依據(jù)。還有很多病毒編碼的去泛素化酶的功能尚未闡明，本研究也可為其他動(dòng)物病毒病的靶向藥物研究提供參考。