基因Ⅶ型新城疫病毒F基因DNA及亞單位疫苗細(xì)胞免疫效果評(píng)估

李 樂，孫軍峰，陳林娜，師乾凱，邸 濤，劉添儀，趙 冉，張春瑋，韓宗璽，劉勝旺 (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所 禽呼吸道傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150069)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的禽類的一種以呼吸道、消化道損傷為典型特征的急性、高度接觸性傳染病[1]。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)最新報(bào)告，NDV屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，禽腮腺炎病毒亞科(Avulavirinae)，正禽腮腺炎病毒屬(Orthoavulavirus)，正禽腮腺炎病毒1型(Avinaorthoavulavirus1)。NDV基因組長(zhǎng)度分別有15 186，15 192，15 198 nt 3種類型，基于基因組大小和融合蛋白(F)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，NDV可分為ClassⅠ和ClassⅡ 兩大類，分別進(jìn)一步分為1.1.1(1a)、1.1.2(1b)、1.2(1c+1d)型和Ⅰ-ⅩⅪ型[2]。自20世紀(jì)50年代以來，疫苗廣泛應(yīng)用于該病的防控，在全世界范圍內(nèi)極大地降低了NDV引起的臨床疾病所造成的經(jīng)濟(jì)損失。中國采用了廣泛且嚴(yán)格的免疫政策用于ND的預(yù)防，其中使用最廣泛的NDV疫苗株屬于ClassⅡ類基因Ⅱ型。而20世紀(jì)90年代開始，ClassⅡ類中的基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株在免疫雞群和鵝群中持續(xù)存在，并引起了疾病的發(fā)生[3-4]。流行的基因Ⅶ型強(qiáng)毒株與基因Ⅱ型疫苗株之間的遺傳和抗原性差異被認(rèn)為是導(dǎo)致強(qiáng)毒株在免疫雞群中存在并引發(fā)疾病的主要原因[5-6]，因此，需要開發(fā)新型疫苗用于基因Ⅶ型NDV的防控。

活疫苗、滅活疫苗、病毒載體疫苗和基因工程疫苗等眾多類型的疫苗被用于保護(hù)家禽免受NDV的感染[7-8]。常規(guī)的活疫苗、滅活疫苗和病毒載體疫苗通常需要將病毒接種雞胚或易感細(xì)胞，需要在適當(dāng)?shù)纳锇踩珬l件下進(jìn)行，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力?；钜呙缒軌蛘T導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，但其在雛雞中的免疫效果容易受到母源抗體的干擾。滅活疫苗通常用于加強(qiáng)免疫，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的體液免疫，但清除病毒感染的能力較差。而病毒載體疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)力所需的時(shí)間較長(zhǎng)，限制了其在現(xiàn)地應(yīng)用[7]。基于目前所使用的疫苗存在的問題以及我國針對(duì)ND防控的政策要求，迫切需要研制新型NDV疫苗。基因工程疫苗是一種可靠的選擇，其中DNA疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗具有穩(wěn)定性和安全性高、不存在毒力返強(qiáng)的隱患、易于大量制備等優(yōu)勢(shì)，另外，利用體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的病毒蛋白作為亞單位疫苗也能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的保護(hù)性免疫。近年來研究表明，用DNA疫苗進(jìn)行首次免疫，用蛋白亞單位疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)效果更確實(shí)[9-10]。NDV具有血凝素神經(jīng)氨酸酶(HN)和F蛋白兩種囊膜糖蛋白，二者對(duì)病毒的感染和致病性是至關(guān)重要的。HN和F蛋白均能夠誘導(dǎo)針對(duì)NDV的保護(hù)性免疫，其中F蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和保護(hù)性免疫的能力要優(yōu)于HN[11]。以含有NDV F基因的質(zhì)粒作為DNA疫苗以及重組F蛋白作為亞單位疫苗已有研究報(bào)道。目前所構(gòu)建的DNA疫苗大多采用病毒自身的F基因序列，病毒與宿主的密碼子偏好性之間的差異可能會(huì)導(dǎo)致DNA疫苗所編碼的蛋白不能在自然宿主體內(nèi)高效表達(dá)，從而影響其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)水平。體外表達(dá)F蛋白所采用的系統(tǒng)主要為大腸桿菌、酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，由于上述系統(tǒng)不能進(jìn)行有效的糖基化修飾，導(dǎo)致表達(dá)的F蛋白不能或僅能發(fā)生部分糖基化修飾，從而影響F蛋白的免疫原性[12-13]。此外，細(xì)胞免疫同樣參與針對(duì)NDV感染的保護(hù)，可能有助于機(jī)體清除體內(nèi)的病毒[14]。目前，以F基因的表達(dá)質(zhì)粒作為DNA疫苗以及重組F蛋白作為亞單位疫苗免疫后是否能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫尚未有詳細(xì)報(bào)道。

本研究對(duì)基因Ⅶ型NDV毒株F基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其適合在雞體內(nèi)表達(dá)；將優(yōu)化的基因克隆至高效真核表達(dá)載體中，獲得了表達(dá)基因Ⅶ型NDV毒株F蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAF。將其轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的真核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，制備重組proF蛋白并進(jìn)行純化；將質(zhì)粒pCAF和proF作為DNA疫苗和亞單位疫苗，以不同程序免疫雛雞后評(píng)估誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平，以期為開發(fā)新型的NDV疫苗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞含有雞肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件的真核表達(dá)載體pCAGGS由本實(shí)驗(yàn)室保存；Expi293F細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存培養(yǎng)，培養(yǎng)基為無血清的Expi293 expression medium。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF雛雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫。

1.3 主要試劑高保真聚合酶KOD-Plus-Neo購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；In-Fusion HD Cloning Kit、DL5000 DNA Marker、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T購自TaKaRa公司；雞外周血淋巴細(xì)胞分離液 (P8730-200)、刀豆蛋白A (ConA)購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自HyClone公司；Expi293 expression medium及其ExpiFecTamine293轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Bradford蛋白分析試劑盒、WST-1溶液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雞細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；鎳柱瓊脂糖樹脂HisPur Ni-NTA購自Thermo Fisher Scientific公司；Strep-Tactin親和層析購自德國IBA Life sciences公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 F基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株(GenBank:KU140419)的F基因中編碼裂解位點(diǎn)“RRQKRF”的RNA序列突變?yōu)榫幋a氨基酸序列“GGQGRF”的DNA序列，使表達(dá)的蛋白不能被細(xì)胞中普遍存在的弗林樣蛋白酶切割成為F1和F2 兩個(gè)亞單位以更好地維持免疫原性；另外將F基因的跨膜區(qū)(TM)和胞漿尾部區(qū)(CT)的編碼序列替換為噬菌體T4纖維蛋白異源三聚結(jié)構(gòu)域的編碼序列，以便于表達(dá)的蛋白形成可溶性的三聚體。此外，在序列的3′末端添加His和Strep標(biāo)簽的編碼序列以利于蛋白表達(dá)后的純化。將上述基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化使其適合在雞體內(nèi)表達(dá)，由北京華大基因公司合成并克隆至pMD18-T載體。設(shè)計(jì)引物pcaf-F和pcaf-R(引物具體信息見表1)，通過PCR擴(kuò)增上述優(yōu)化的F基因，利用In-Fusion HD Cloning Kit將擴(kuò)增獲得的F基因片段與BamHⅠ和XhoⅠ酶切后的pCAGGS載體連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pCAF。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.5 proF的表達(dá)、純化和鑒定利用ExpiFecTamine293轉(zhuǎn)染試劑盒將pCAF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的Expi293F細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后5 d，收集細(xì)胞上清，10 000×g離心10 min去除細(xì)胞碎片。用Ni-NTA瓊脂糖樹脂HisPur Ni-NTA和Strep-Tactin親和層析柱純化上清中帶有His-Strep標(biāo)簽的F蛋白，獲得的蛋白命名為proF。用Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定純化后的proF濃度，將純化后的F蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色，檢測(cè)蛋白大小。另外，通過Western blot對(duì)純化的proF進(jìn)行進(jìn)一步鑒定：SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以在雞中制備的基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的抗血清作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗雞抗體作為二抗，用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。

1.6 動(dòng)物免疫及樣品采集將40只14日齡的SPF雛雞隨機(jī)分為4組，每組10只。第1組雛雞用pCAF質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫，100 μg/只，在第1次免疫后14 d以同樣的方式和劑量用pCAF質(zhì)粒加強(qiáng)免疫；第2組雛雞用pCAF質(zhì)粒通過肌肉注射方式免疫，100 μg/只，在第1次免疫后14 d，肌肉注射含Marcol52礦物油佐劑的proF，50 μg/只；第3組雞在28日齡時(shí)通過肌肉注射含Marcol52礦物油佐劑的proF，50 μg/只；第4組雞通過肌肉注射無菌PBS作為對(duì)照組。在最后一次免疫后14 d，通過翅靜脈采集各組雞的抗凝血，用外周血淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。

1.7 雞外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法分離淋巴細(xì)胞[15]，獲得的淋巴細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整為5×105個(gè)/mL，于96孔板每孔中加入100 μL含淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫組、proF單獨(dú)免疫組、pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫組以及PBS對(duì)照組分離到的淋巴細(xì)胞分別用終質(zhì)量濃度為10 mg/L的ConA蛋白(陽性對(duì)照)、終質(zhì)量濃度為10 mg/L純化的proF(特異性抗原)、RPMI-1640培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)進(jìn)行處理，每種處理方式重復(fù)3個(gè)孔。處理后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，然后在每孔中加入10 μL WST-1溶液，孵育4 h，在450 nm 處測(cè)定每孔的吸光度值(D450 nm)。刺激指數(shù)(stimulation index，SI)為特異性抗原刺激細(xì)胞的平均D值與陰性對(duì)照刺激細(xì)胞的平均D值的比值。

1.8 細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的檢測(cè)按照1.7中的方法分離、培養(yǎng)和處理雞外周血淋巴細(xì)胞，用10 mg/L 的ConA蛋白(陽性對(duì)照)、10 mg/L純化的proF(特異性抗原)、RPMI-1640培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)處理淋巴細(xì)胞，處理后48 h收集培養(yǎng)上清液，用雞細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)上清液中的IL-4和IFN-γ，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所檢測(cè)樣品中細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的濃度。

2 結(jié)果

2.1 pCAF質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將PCR擴(kuò)增獲得的F基因片段與酶切后的pCAGGS質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布于抗性LB平板后過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切后，可檢測(cè)到2條帶，分別為大小5 790 bp的載體片段和1 679 bp的F基因片段，與預(yù)期相符(圖1A)。進(jìn)一步以重組質(zhì)粒為模板，利用引物pcaf-F和pcaf-R進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示能夠擴(kuò)增得到1 695 bp 的F基因片段，與預(yù)期大小相符(圖1B)。將上述鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定正確的質(zhì)粒命名為pCAF。

A.pCAF質(zhì)粒酶切鑒定(M.DL5000 DNA Marker；1.pCAF質(zhì)粒的XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物)；B.F基因PCR鑒定(M.DL5000 DNA Marker；2.F基因擴(kuò)增結(jié)果)圖1 pCAF質(zhì)粒酶切及PCR鑒定電泳圖

2.2 F蛋白的表達(dá)和純化將pCAF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的Expi293F細(xì)胞中，表達(dá)至上清中的蛋白經(jīng)HisPur Ni-NTA和Strep-Tactin純化后獲得重組proF蛋白。由于對(duì)F蛋白裂解位點(diǎn)堿性氨基酸的編碼序列進(jìn)行了突變，使表達(dá)的蛋白不能被細(xì)胞中普遍存在的弗林樣蛋白酶切割形成F1和F2 兩個(gè)亞單位。對(duì)純化后的proF進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖2A所示，在相對(duì)分子質(zhì)量約為70 kDa處有一條蛋白條帶，可見F蛋白未被切割為2個(gè)亞單位，與預(yù)期設(shè)計(jì)相符。另外，質(zhì)粒pCAF編碼的重組F蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為58 kDa，而F蛋白中存在4個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，每個(gè)糖基化位點(diǎn)發(fā)生糖基化修飾后增加的相對(duì)分子質(zhì)量為2～3 kDa，因此本研究表達(dá)獲得的蛋白應(yīng)該包含相應(yīng)的糖基化修飾。進(jìn)一步通過Western blot對(duì)純化的proF進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2B顯示，proF能夠被Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的抗血清所識(shí)別，表明proF含有能夠被NDV抗體所識(shí)別的抗原表位。

A.proF的SDS-PAGE結(jié)果；B.proF的Western blot鑒定。M.蛋白Marker;1,2.proF圖2 proF的SDS-PAGE及Western blot鑒定

2.3 外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)為評(píng)估pCAF和proF免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平，采用pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫、proF單獨(dú)免疫、pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫3種方式免疫SPF雛雞，以注射PBS的雛雞作為對(duì)照，最后一次免疫后14 d分離外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，與用RPMI-1640培養(yǎng)基刺激相比，3個(gè)免疫組和對(duì)照組的外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA刺激后均可發(fā)生明顯的增殖。對(duì)照組雛雞的外周血淋巴細(xì)胞用proF和RPMI-1640培養(yǎng)基刺激后均未檢測(cè)到明顯的細(xì)胞增殖，而3個(gè)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞用proF刺激后發(fā)生明顯的細(xì)胞增殖，并且3個(gè)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞用proF刺激后刺激指數(shù)均顯著高于對(duì)照組。另外，用proF刺激后，pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫組的刺激指數(shù)顯著高于pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫組和proF單獨(dú)免疫組。

圖3 雞外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)刺激指數(shù)的測(cè)定結(jié)果

2.4 細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果最后一次免疫后14 d分離的淋巴細(xì)胞用proF做為特異性抗原進(jìn)行刺激，ConA和RPMI-1640培養(yǎng)基刺激作為陽性和陰性對(duì)照，檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平。IL-4檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，與用RPMI-1640培養(yǎng)基刺激相比，3個(gè)免疫組和對(duì)照組的外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA刺激后均可產(chǎn)生IL-4。對(duì)照組雛雞的外周血淋巴細(xì)胞用proF和RPMI-1640培養(yǎng)基刺激后均未檢測(cè)到明顯的IL-4，而3個(gè)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞用proF刺激后可檢測(cè)到不同水平的IL-4。其中，pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫組的外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)proF刺激后產(chǎn)生的IL-4水平顯著高于pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫組和proF單獨(dú)免疫組，并且proF單獨(dú)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)proF刺激后產(chǎn)生的IL-4水平顯著高于pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫組。

圖4 細(xì)胞因子IL-4檢測(cè)結(jié)果

IFN-γ檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，與用RPMI-1640培養(yǎng)基刺激相比，3個(gè)免疫組和對(duì)照組的外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA刺激后均可產(chǎn)生IFN-γ。對(duì)照組雛雞的外周血淋巴細(xì)胞用proF和RPMI-1640培養(yǎng)基刺激后均未檢測(cè)到明顯的IFN-γ，而3個(gè)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞用proF刺激后可檢測(cè)到不同水平的IFN-γ。其中，pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫組的外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)proF刺激后產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫組和proF單獨(dú)免疫組，并且pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫組的外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)proF刺激后產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于proF單獨(dú)免疫組。

圖5 細(xì)胞因子IFN-γ檢測(cè)結(jié)果

3 討論

各種類型的疫苗，包括弱毒活疫苗、滅活疫苗、重組病毒載體疫苗以及抗原性匹配的基因工程疫苗，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和控制NDV的傳播，但世界范圍內(nèi)仍存在由于疫苗免疫失敗導(dǎo)致ND的發(fā)生，這也表明當(dāng)前的控制策略仍不是完全有效的，也表明需要研制新型疫苗用于ND的防控。

與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括化學(xué)和生物特性穩(wěn)定、生產(chǎn)簡(jiǎn)單和易于操作等[16]，并且DNA疫苗僅含有編碼病毒保護(hù)性抗原的基因，因此不存在弱毒活疫苗的毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)，另外，DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與病毒自然感染誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)類似。質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)利用宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生病毒的蛋白，與組織相容性復(fù)合物MHC-Ⅰ或Ⅱ類分子結(jié)合，引起細(xì)胞和體液免疫。盡管DNA疫苗具有眾多優(yōu)勢(shì)，但用DNA疫苗單獨(dú)免疫通常不能對(duì)病毒的攻擊提供完全保護(hù)，例如，以表達(dá)NDV F蛋白的質(zhì)粒作為免疫原通過肌肉注射免疫雞后能夠?qū)DV的攻擊提供不同水平(10%～50%)的保護(hù)。此外，環(huán)形DNA作為疫苗免疫只能誘導(dǎo)產(chǎn)生較低水平的抗體，這也表明DNA疫苗可能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫從而對(duì)病毒的攻擊提供保護(hù)[17]。研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)免疫能夠誘導(dǎo)針對(duì)病毒的高水平免疫力，并且連續(xù)使用含有相同抗原的不同類型疫苗進(jìn)行免疫比重復(fù)使用同一種類型疫苗的免疫效果更好。因此，為提高DNA疫苗的免疫效果，通常建議用質(zhì)粒DNA進(jìn)行首次免疫，滅活疫苗或亞單位疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫，從而提高免疫反應(yīng)的水平。

本研究構(gòu)建了含有密碼子優(yōu)化的NDV F基因的質(zhì)粒pCAF，在真核細(xì)胞中成功表達(dá)后獲得了含有糖基化修飾的proF。為評(píng)估質(zhì)粒pCAF和proF免疫所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，分別采用pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫、proF單獨(dú)免疫、pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫的方式免疫SPF雞，通過淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞因子的檢測(cè)來評(píng)估免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種免疫方式均能引起明顯的淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的產(chǎn)生，其中pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫組引起的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平最高，另外，pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ的水平高于proF單獨(dú)免疫，而proF單獨(dú)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-4的水平高于pCAF質(zhì)粒單獨(dú)免疫。

細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)的發(fā)展和病毒感染的預(yù)防中起著關(guān)鍵作用。IFN-γ主要由輔助性T細(xì)胞1(Th l)分泌，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，在抗感染等方面起重要作用；IL-4主要由輔助性T細(xì)胞2(Th2)分泌，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，輔助抗體的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，proF誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞因子(IL-4)水平高于pCAF質(zhì)粒，而pCAF質(zhì)粒誘導(dǎo)的Th1細(xì)胞因子(IFN-γ)水平高于proF，并且與單獨(dú)接種pCAF質(zhì)粒或proF相比，pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫的方式誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平更高，這與之前的報(bào)道一致，即DNA疫苗免疫主要誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，而蛋白疫苗免疫主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)[18]。此外，pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了針對(duì)NDV的混合Th1/Th2型免疫反應(yīng)，并增加了細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的產(chǎn)生。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)F基因的質(zhì)粒作為DNA疫苗單獨(dú)免疫后檢測(cè)不到體液抗體，但能對(duì)NDV的攻擊提供部分保護(hù)。因此，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明F基因DNA疫苗免疫后誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫可能參與了針對(duì)NDV的保護(hù)，這需要進(jìn)一步的證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，pCAF質(zhì)粒和proF均可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，且與單獨(dú)接種pCAF質(zhì)?；騪roF相比，pCAF質(zhì)粒和proF聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果更好。此外，針對(duì)NDV HN的血凝抑制抗體通常用來評(píng)價(jià)疫苗誘導(dǎo)的免疫水平，并且可作為NDV感染的標(biāo)記。鑒于DNA疫苗免疫不受母源抗體的干擾，并且F基因DNA疫苗和亞單位疫苗免疫后不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)NDV的血凝抑制抗體，因此本研究構(gòu)建的F基因DNA疫苗和亞單位疫苗更適合“區(qū)分感染與免疫的動(dòng)物(DIVA)”這一免疫策略。本研究的結(jié)果為研制適合我國NDV防控的新型疫苗奠定理論基礎(chǔ)。