探究tspo基因缺陷對(duì)斑馬魚生理功能的影響

廖紫嫻，陳明瀚，鐘敏，王一川，尚靖，岳蕓蕓

（中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210000）

0 引言

TSPO是一種位于線粒體外膜上包含169個(gè)氨基酸的疏水性跨膜蛋白。TSPO在外周主要分布于骨髓、脂肪、胃、皮膚等，在中樞以膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)為主，包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。已有研究顯示，TSPO與許多重要的生理功能有關(guān)。在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和類固醇生成方面，現(xiàn)已明確TSPO能促使膽固醇從線粒體外膜向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。膽固醇是一種高親脂性化合物，起源于細(xì)胞內(nèi)不同的位置，不能自由擴(kuò)散到線粒體內(nèi)。而外線粒體膜上的TSPO的膽固醇識(shí)別序列CRAC可以結(jié)合膽固醇促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)。由于介導(dǎo)親脂性膽固醇從胞質(zhì)中通過線粒體膜間隙水溶液導(dǎo)入線粒體內(nèi)部，因此這是調(diào)節(jié)類固醇生成的限速步驟[2]。在線粒體中，膽固醇在線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)化成孕烯醇酮，孕烯醇酮在胞質(zhì)中轉(zhuǎn)化為孕酮，再進(jìn)一步代謝為別孕烯醇酮及其他神經(jīng)類固醇。而神經(jīng)類固醇作為神經(jīng)調(diào)節(jié)遞質(zhì)，影響多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體功能，并能調(diào)節(jié)情緒、記憶和應(yīng)激行為[3]。在卟啉的運(yùn)輸與積累方面主要與TSPO第二種亞型有關(guān)。TSPO主要分為兩種亞型，TSPO1普遍存在于大多數(shù)真核細(xì)胞的線粒體外膜，而TSPO2則主要與血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，位于細(xì)胞膜、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[4]。原卟啉IX(PPIX)是TSPO的內(nèi)源性配體，PPIX一方面用于合成血紅素，另一方面未被用于合成血紅素的游離PPIX可通過一種與TSPO相關(guān)的蛋白(ABCG2)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，通過這種方式可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PPIX的含量。此外，TSPO與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，如阿爾茨海默病[5-6]、顳葉癡呆癥[7]、多發(fā)性硬化癥[8]、亨廷頓病[9]、肌萎縮性側(cè)索硬化癥[10]和帕金森病[11]，以上疾病均伴有TSPO表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。而不同種類的焦慮癥患者腦中TSPO水平均低于正常值[12]，而作為TSPO重要的下游神經(jīng)類固醇別孕烯醇酮，在焦慮癥患者的血清、血漿和腦脊液中也發(fā)現(xiàn)含量顯著降低。此外，TSPO也參與細(xì)胞凋亡過程。當(dāng)細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下能促使MPTP通道開放，允許質(zhì)子與水分子等小分子進(jìn)入線粒體，線粒體膜內(nèi)外質(zhì)子濃度梯度和電勢(shì)梯度崩潰，大量水分子進(jìn)入線粒體使線粒體內(nèi)膜的嵴伸展變性，線粒體外膜膨脹破裂，導(dǎo)致細(xì)胞色素c和其他致凋亡蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[13]。

斑馬魚作為一種模式生物由于其不可替代的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)獲得越來越廣泛的應(yīng)用，例如利用藥物處理、外科手術(shù)或者基因編輯技術(shù)構(gòu)建人類疾病模型，可以實(shí)現(xiàn)藥物的高通量篩選，極大地促進(jìn)了藥物研發(fā)進(jìn)程。本研究利用實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建成功的tspo功能缺失斑馬魚（tspocpu87）[14]與野生型斑馬魚進(jìn)行對(duì)比，探索了tspo敲除突變體斑馬魚的部分表型，為進(jìn)一步闡明tspo的生理功能以及相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

尼羅紅(上海阿拉丁公司)；醋酸鈉(南京化學(xué)試劑公司)；鄰聯(lián)茴香胺(上海安譜公司)；過氧化氫、膽固醇、三卡因(美國Sigma公司)；95%乙醇、CMC-Na(上海滬試公司)；斑馬魚基礎(chǔ)飼料(美國Zeigler公司)；SZX16體式熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；SSC-DC578P彩色攝像機(jī)(日本Sony公司)；光照恒溫培養(yǎng)箱(寧波賽福公司)。

1.2 動(dòng)物

野生型AB系成年斑馬魚種魚購自武漢國家斑馬魚資源中心，南京睿鷹潤澤生物醫(yī)藥科技有限公司斑馬魚實(shí)驗(yàn)室自行繁育。tspo基因敲除突變體斑馬魚(tspocpu87)由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并繁育。維持循環(huán)水系統(tǒng)28.5℃，每天固定光照時(shí)間為14 h、黑暗時(shí)間為10 h，每天喂食2次。

1.3 胚胎的收取

實(shí)驗(yàn)前一天晚上分別取相同月齡的AB和tspocpu87成年斑馬魚，相同品種的斑馬魚雌雄各一置于繁殖缸的隔板兩側(cè)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早上八點(diǎn)半抽去隔板使雌雄斑馬魚自由交配產(chǎn)卵，1小時(shí)后收取胚胎并計(jì)數(shù)。將胚胎用egg water洗凈后置于28.5℃光照培養(yǎng)箱中，后續(xù)可進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。

1.4 HCD造模

將斑馬魚胚胎隨機(jī)分為四組：AB對(duì)照組，AB高脂組，tspocpu87對(duì)照組，tspocpu87高脂組。胚胎發(fā)育前四天在玻璃皿中孵化，每天換一次水。第五天斑馬魚開始進(jìn)食，普通飼料喂養(yǎng)一天，防止直接高脂飲食造成肝臟損傷，并將幼魚從表面皿換到圓缸飼養(yǎng)。第六天起對(duì)照組給與普通飼料，高脂組給與高脂飼料，在高脂飼養(yǎng)的第5、10、15天分別進(jìn)行尼羅紅染色。

正常飼料與高脂飼料的配制：將膽固醇與基礎(chǔ)飼料溶解于乙醚中，研磨均勻，適度加熱使粉體干燥，高脂飼料中膽固醇含量為8%。正常飼料的配置方法同上，但不添加膽固醇。

1.5 尼羅紅染色

尼羅紅是一種親脂性熒光染料，可以對(duì)甘油三酯和脂肪酸進(jìn)行染色。將斑馬魚幼魚轉(zhuǎn)移至0.5ug/mL尼羅紅染液中避光染色30min，用egg water清洗3次，拍照前將斑馬魚置于0.4%三卡因溶液中麻醉，將已麻醉的斑馬魚轉(zhuǎn)移到涂有4%CMC-Na凝膠的載玻片上，調(diào)整體態(tài)，在熒光顯微鏡下觀察被染成橘黃色的脂質(zhì)并拍照。

1.6 行為學(xué)測量

取相同月齡的AB和tspocpu87成年斑馬魚雌雄各八尾分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.6.1 曠場實(shí)驗(yàn)(Open Field Test)

準(zhǔn)備一個(gè)長30 cm，寬30 cm，高9 cm的正方形魚缸，魚缸在水平方向上分為兩個(gè)區(qū)域：中間區(qū)域(upper zone)，邊緣區(qū)域(bottom zone)。攝像機(jī)放置于魚缸上方記錄5 min斑馬魚在水平方向上的運(yùn)動(dòng)視頻。處理視頻資料并分析統(tǒng)計(jì)每尾斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡，運(yùn)動(dòng)熱圖，總移動(dòng)距離，移動(dòng)速度，靜止時(shí)間，靜止頻率。

1.6.2 新魚缸實(shí)驗(yàn)(Novel Tank Test)

準(zhǔn)備一個(gè)上底26 cm，下底21 cm，高15 cm，寬6 cm的梯形狹窄透明魚缸，最大程度裝滿水，在魚缸的背面和側(cè)面貼上白色紙張有利于記錄斑馬魚的行動(dòng)軌跡，魚缸在垂直方向上分為上下兩個(gè)區(qū)域：頂部區(qū)域(upper zone)，底部區(qū)域(bottom zone)。攝像機(jī)放置于魚缸側(cè)面記錄5 min斑馬魚在垂直方向上的運(yùn)動(dòng)視頻。處理視頻資料并分析統(tǒng)計(jì)每尾斑馬魚運(yùn)動(dòng)軌跡，運(yùn)動(dòng)熱圖，總移動(dòng)距離，移動(dòng)速度，靜止時(shí)間，靜止頻率。

1.7 血紅蛋白染色

用配置好的鄰聯(lián)茴香胺染液對(duì)發(fā)育至48 hpf時(shí)期的斑馬魚胚胎進(jìn)行血紅蛋白染色，將胚胎置于6孔板中，每孔加入2 mL染液，避光染色15 min，用egg water清洗3次，將斑馬魚轉(zhuǎn)移到涂有4% CMC-Na凝膠的載玻片上，調(diào)整體態(tài)使幼魚腹面朝上，于顯微鏡的明場下觀察并拍照。

鄰聯(lián)茴香胺染液的配制：取鄰聯(lián)茴香胺粉末60 mg，醋酸鈉30 mg，無水乙醇40 mL，30%過氧化氫650μL，用TBST定容至100 mL。配置該染液時(shí)注意避光操作，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.8 斑馬魚尾鰭再生實(shí)驗(yàn)

取成年斑馬魚(4 months post fertilization)，于0.4%三卡因溶液中麻醉，置于玻璃板上。使用手術(shù)刀整齊切除1/3尾鰭，于顯微鏡明場下拍照。盡快放回水中待其蘇醒，七日后再次拍照，對(duì)比尾鰭再生的狀況。

2 結(jié)果

2.1 tspo敲除抑制高膽固醇飲食誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚脂質(zhì)蓄積

TSPO參與了膽固醇進(jìn)入線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，將膽固醇轉(zhuǎn)化為類固醇的前體孕烯醇酮，這是類固醇生成的第一步，也是限速的一步。尼羅紅染色反映了斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)蓄積的程度。結(jié)果顯示，在AB型斑馬魚中，高脂組的熒光強(qiáng)度大于對(duì)照組，在tspo敲除斑馬魚中也體現(xiàn)這一趨勢(shì)，高脂組的脂質(zhì)蓄積程度大于對(duì)照組。同時(shí)，tspo敲除斑馬魚中無論是對(duì)照組還是高脂組的熒光強(qiáng)度均弱于AB型斑馬魚中對(duì)應(yīng)的組（圖1）。這說明tspo敲除型斑馬魚在脂質(zhì)蓄積方面與AB型斑馬魚存在差異，驗(yàn)證了TSPO參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的生理功能。

圖1 AB型斑馬魚與tspo敲除型斑馬魚的尼羅紅染色。比例尺=400 um。

2.2 TSPO功能缺失的斑馬魚表現(xiàn)出抑郁焦慮癥狀

斑馬魚的曠場實(shí)驗(yàn)與新型魚缸實(shí)驗(yàn)通常用于檢測斑馬魚的焦慮與抑郁狀態(tài)。當(dāng)斑馬魚被放入一個(gè)全新魚缸內(nèi)，最初在邊緣地帶滯留時(shí)間和沉底時(shí)間較多，且更偏向于靜止不動(dòng)。當(dāng)斑馬魚適應(yīng)該環(huán)境后，在該區(qū)域中心地帶和頂部區(qū)域滯留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)均增加。斑馬魚自發(fā)地接近該領(lǐng)域邊緣地帶的特征稱為趨觸性，自發(fā)地接近該領(lǐng)域底部的特征稱為趨地性。由于焦慮通常是伴隨著探索性行為的減少以及趨觸性和趨地性。所以通常認(rèn)為，斑馬魚在魚缸邊緣區(qū)域和下半部分的時(shí)間越長，運(yùn)動(dòng)距離減少和速度降低，靜止時(shí)間越久和次數(shù)越多更偏向于焦慮狀態(tài)。

在曠場實(shí)驗(yàn)中，tspocpu87斑馬魚比AB型斑馬魚更喜歡繞著魚缸邊緣探索，較少去到魚缸的中間區(qū)域，在新型魚缸實(shí)驗(yàn)中，tspocpu87斑馬魚更傾向于在魚缸底部運(yùn)動(dòng)。并且無論在曠場實(shí)驗(yàn)還是新型魚缸實(shí)驗(yàn)中，tspocpu87斑馬魚的移動(dòng)距離更短，速度更慢。此外，曠場實(shí)驗(yàn)中tspocpu87斑馬魚的靜止時(shí)間和靜止頻率都高于AB型斑馬魚，但在新型魚缸實(shí)驗(yàn)中二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。從整體來說，tspo基因敲除后，斑馬魚更偏向于在魚缸邊緣區(qū)域和底部區(qū)域活動(dòng)，更多的靜止?fàn)顟B(tài)，表現(xiàn)出更高的焦慮抑郁傾向。

圖2 tspo敲除型斑馬魚具有抑郁焦慮的傾向

2.3 TSPO功能缺失影響斑馬魚的繁殖能力

對(duì)AB型和tspocpu87斑馬魚的產(chǎn)卵數(shù)量進(jìn)行比較，結(jié)果表明二者之間具有顯著性差異。tspocpu87斑馬魚的產(chǎn)卵數(shù)量顯著低于AB斑馬魚（圖3）。由此判斷tspo敲除使斑馬魚的繁殖力降低。我們推測這可能是由于TSPO功能缺失使斑馬魚膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程受到影響，進(jìn)而影響到斑馬魚體內(nèi)各類激素合成。但tspocpu87中激素水平尚有待進(jìn)一步研究。

圖3 AB型斑馬魚與tspo敲除型斑馬魚的產(chǎn)卵數(shù)量統(tǒng)計(jì)（n=48對(duì)/基因型）

2.4 tspo基因可能不參與斑馬魚血紅蛋白的生成

TSPO主要分種亞型，TSPO1普遍存在于大多數(shù)真核細(xì)胞的線粒體外膜，而TSPO2則主要與血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[15]。鄰聯(lián)茴香胺主要對(duì)血紅蛋白進(jìn)行著色，可以反映紅細(xì)胞的分布。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用抑制劑PK11195和Morpholinos兩種方式抑制tspo功能均能顯著抑制斑馬魚初始造血能力[16]。但本研究結(jié)果顯示，tspocpu87斑馬魚的紅細(xì)胞著色程度和區(qū)域大小均與AB型斑馬魚差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且使用TSPO抑制劑PK11195（10 uM）也不影響斑馬魚紅細(xì)胞的表達(dá)（圖4）。由此我們推論tspo敲除不影響斑馬魚血紅蛋白的表達(dá)。而已有研究中利用Morpholinos敲降斑馬魚tspo影響斑馬魚血紅蛋白生成可能是由于MOs的非特異性或毒性所造成的。

圖4 tspo基因敲除與PK11195（10 uM）對(duì)斑馬魚血紅蛋白含量的影響。比例尺=400 um。

2.5 TSPO功能缺失不影響斑馬魚成魚的組織再生

由于TSPO參與細(xì)胞凋亡過程，而細(xì)胞凋亡在組織重塑、再生和形態(tài)形成過程中起到了重要作用[17]，所以我們探究了tspo功能缺失是否影響成年斑馬魚組織再生能力。我們選取相同月齡的AB型和tspocpu87成年斑馬魚進(jìn)行尾鰭部分切除，觀察尾鰭再生狀況。結(jié)果顯示，tspocpu87斑馬魚尾鰭再生區(qū)域的大小與形狀均與AB型斑馬魚相似，未表現(xiàn)出顯著差異（圖5）。因此，我們推測tspo敲除不影響斑馬魚成魚的組織再生能力。

圖5 tspo功能缺失對(duì)斑馬魚組織再生的影響。比例尺=400 um。

3 討論

TSPO作為一種廣泛分布的位于線粒體外膜的跨膜蛋白，與許多重要的生理功能有關(guān)，包括膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和類固醇生成，細(xì)胞呼吸和免疫調(diào)節(jié)等。TSPO一般在腦組織中表達(dá)程度很低，但TSPO的表達(dá)水平在由炎癥介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活時(shí)明顯提高，是反映小膠質(zhì)細(xì)胞活化的敏感的生物指標(biāo)，這一特性決定了TSPO可作為檢測神經(jīng)炎癥的靶點(diǎn)[18]。在臨床上，TSPO配體常用于正電子發(fā)射斷層成像技術(shù)(Positron Emission Tomography, PET)。但我們對(duì)TSPO的更為詳細(xì)的生理功能以及如何發(fā)揮效應(yīng)仍知之甚少，這仍需要大量的工作去闡述。

我們首先探究了tspo基因敲除對(duì)斑馬魚脂質(zhì)方面的影響，從尼羅紅染色結(jié)果可以看出tspo敲除的確影響了膽固醇在斑馬魚體內(nèi)的合成與蓄積，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。由于膽固醇合成受阻可能會(huì)影響到下游產(chǎn)物四氫孕酮含量降低，而四氫孕酮與抑郁水平顯著相關(guān)，并且四氫孕酮具有抗焦慮和鎮(zhèn)靜的作用，已被FDA批準(zhǔn)用于治療產(chǎn)后抑郁癥。繼而我們從行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了tspocpu87斑馬魚的抑郁傾向。同時(shí)性激素中的孕甾酮等受類固醇合成抑制的影響，也可能是tspocpu87斑馬魚生殖力下降的原因之一[19]，具體表現(xiàn)為產(chǎn)卵數(shù)量的降低。此外我們還探究了tspo在造血方面是否發(fā)揮作用，結(jié)果顯示tspocpu87斑馬魚表現(xiàn)出與野生型斑馬魚相似的血紅蛋白合成能力，并沒有表現(xiàn)出明顯差異。并且tspo基因缺失也沒有在組織再生方面產(chǎn)生效應(yīng)，具體表現(xiàn)為tspocpu87斑馬魚尾鰭再生程度與AB型斑馬魚相似。本研究只是初步探究了tspo-/-斑馬魚部分表型，更為深入的機(jī)制研究以及TSPO的其他功能的探索有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。