利用HPLC內(nèi)標(biāo)法測定益生菌類保健食品中低聚木糖的含量

張超然 王墨陽 林林

摘 要：低聚木糖作為益生元，常應(yīng)用于益生菌類保健食品中。本文利用高效液相色譜-紫外檢測器，以鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行柱前衍生化后測定低聚木糖在益生菌保健食品中的含量。將樣品溶解后，經(jīng)硫酸水解，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）作為衍生化試劑，選擇流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L的乙酸銨溶液，進(jìn)行梯度洗脫，水解前后的木糖含量差值，即為低聚木糖的含量。該測定方法在質(zhì)量濃度20～1 000 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 6，檢出限和定量限分別是1.9 mg/100 g和6.8 mg/100 g。加標(biāo)回收率在88.7%～98.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～4.0%;在重復(fù)性試驗(yàn)中，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%。結(jié)果表明該方法在測定益生菌類保健食品中低聚木糖含量具有良好的準(zhǔn)確性和靈敏度。

關(guān)鍵詞：低聚木糖;PMP柱前衍生;益生菌類保健食品

低聚木糖來源廣泛，可從甘蔗渣、玉米棒、麥麩、稻殼和棉稈等植物中提取獲得[1]，含有2～10個(gè)木糖分子由β-1，4-糖苷鍵連接的低聚物[2]。低聚木糖具有多種生物活性，尤其是在益生菌保健食品中，作為益生元，為益生菌供能，具有促進(jìn)腸道益生菌的生長的作用[3-4]，同時(shí)還可以加速脂肪代謝，改善鈣的吸收[5]，預(yù)防齲齒[6]，作為抗氧化劑[2]。因其具有較好的穩(wěn)定性[1]，已被廣泛應(yīng)用于食品、保健食品中。

現(xiàn)有的對低聚木糖測定的標(biāo)準(zhǔn)GB/T 35545—2017和QB/T 2984—2008，主要適用于以玉米芯為原料，經(jīng)酶解精制而成的低聚木糖，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)為低聚木糖原料的測定標(biāo)準(zhǔn)，其檢測設(shè)備為高效液相色譜-示差檢測器，需要的標(biāo)準(zhǔn)品為木糖，木二糖至木六糖，葡萄糖及L-阿拉伯糖。該方法作為食品中添加的低聚木糖的檢測手段，檢測成本高，同時(shí)益生菌類保健食品中常含有大量的蛋白質(zhì)，大量蛋白質(zhì)在醇沉過程中包裹低聚木糖，使測量數(shù)據(jù)偏低，需要針對其測定方法進(jìn)行進(jìn)一步探究，可應(yīng)用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行食品中低聚木糖的測定[7-8]。有研究表明衍生化技術(shù)作為糖類物質(zhì)分析的新技術(shù)，通過使糖鏈攜帶紫外或熒光基團(tuán)，能提高離子化效率，從而提高檢測的靈敏度。其中，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）為代表的1，3取代的吡唑啉酮類衍生試劑和糖鏈還原性末端的反應(yīng)在弱堿性介質(zhì)中進(jìn)行，具有條件溫和、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、無立體異構(gòu)體、紫外吸收強(qiáng)和適于多種類型糖鏈分析等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于糖類檢測[9]。林欽恒等[10]利用柱前衍生的方法測定了潤腸通便類保健食品中低聚木糖的含量，錢韻旭等[11]對白花蛇舌草多糖成分分析中，利用柱前衍生-高效液相的方法確定其由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成。本文利用PMP柱前衍生-高效液相色譜法對于益生菌類保健食品中低聚木糖含量的測定進(jìn)行系統(tǒng)地分析，并以鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對于本類產(chǎn)品中低聚木糖的檢測具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益生菌類保健食品產(chǎn)品，來自于哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司。

木糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.5%），中國藥品生物制品檢定所;D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%），中國藥品生物制品檢定所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，分析純），天津市大茂化工有限公司;乙腈（色譜純），美國FISHER公司;乙酸銨（優(yōu)級純），福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司;甲醇（色譜純），美國FISHER公司;試驗(yàn)用水為去離子水;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯甲烷均為分析純，購自天津化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀（配有紫外檢測器），賽默飛世爾科技;HH4恒溫水浴鍋，無錫沃信儀器制造有限公司;KQ-50B型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司;FA2104電子分析天平（精度：0.000 1 g），上海良平儀器儀表有限公司;VORTEX-KB3旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國FISHER公司;流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L的乙酸銨溶液，梯度洗脫;柱溫：30 ℃;波長：250 nm;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的配制

（1）內(nèi)標(biāo)溶液制備。配制適量10 mg/mL的D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確稱取適量木糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL

容量瓶中，用去離子水溶解配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再將儲備溶液稀釋成20.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL、200.0 μg/mL、400.0 μg/mL和800.0 μg/mL的系列工作溶液，并分別按比例加入內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.3 樣品前處理

（1）樣品水解前溶液制備。準(zhǔn)確稱取樣品1.5 g（精確度為0.000 1 g），用0.005 mol/L硫酸溶液溶解并超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，定容至50 mL。

（2）樣品水解后溶液制備。準(zhǔn)確稱取樣品1.5 g（精確度為0.000 1g），用0.005 mol/L硫酸溶液溶解并超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，添加0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，添加120 μL的4.0 mol/L硫酸溶液于沸水浴水解100 min，取出，冷卻，添加240 μL的4.0 mol/L NaOH溶液，用水定容至50 mL，備用。

1.3.4 衍生化反應(yīng)

標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品水解前后溶液各吸取400 μL，加0.5 mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)120 min。再加0.3 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，混勻，冷卻后用三氯甲烷洗滌3次，棄去三氯甲烷液，水層過0.45 μm濾膜，待上機(jī)測定[10]。

1.4 低聚木糖的計(jì)算

計(jì)算水解前后木糖含量的差值即為低聚木糖（以木糖計(jì)）的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，對常用于該試驗(yàn)的流動(dòng)相進(jìn)行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)乙酸銨[2，8，11]和磷酸鈉[12]都可作為流動(dòng)相，不同的pH，對各糖類物質(zhì)出峰時(shí)間及分離程度有影響，所以本試驗(yàn)選取0.05 mol/L乙酸銨溶液，pH為5.0，7.0，8.0，分別用乙酸和三乙胺進(jìn)行pH調(diào)節(jié);0.05 mol/L磷酸鈉，pH為8.0，用磷酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，以上作為A相。B相為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。根據(jù)內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)物及產(chǎn)品的峰分離程度及出峰時(shí)間，選擇0.05 mol/L乙酸銨溶液（pH=5.0）-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分離效果最好。

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

由于前處理衍生化試驗(yàn)中，需對溶液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，且前處理相對復(fù)雜，從而試驗(yàn)操作誤差影響其溶液中木糖的含量，所以根據(jù)糖類極性上的差異，選取鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對其測定值進(jìn)行校正。同時(shí)，鹽酸氨基葡萄糖在波長250 nm下具有較大的吸收，且不會(huì)干擾產(chǎn)品中其他成分，所以鹽酸氨基葡萄糖對于該方法是比較好的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

本試驗(yàn)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為20.0 μg/mL，50.0 μg/mL，100.0 μg/mL，200.0 μg/mL，400.0 μg/mL和800.0 μg/mL，以木糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，衍生產(chǎn)物的響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)，低聚木糖質(zhì)量濃度在20～1 000 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，得到的線性方程y=1.384 4x-1.098 6，相對系數(shù)（r2）為0.999 6。按3倍信噪比計(jì)算檢出限為1.9 mg/100 g;以10倍信噪比計(jì)算定量限，定量限為6.8 mg/100 g。

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

試驗(yàn)選取了兩款低聚木糖含量不同的益生菌類保健食品樣品，分別測出本底值，在根據(jù)不同樣品的低聚木糖含量，添加標(biāo)準(zhǔn)品（按樣品含量的80%、100%和120%），每個(gè)水平制備5份樣品進(jìn)行測定。按照“1.2.4衍生化反應(yīng)”試驗(yàn)步驟進(jìn)行測定，計(jì)算回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值）。結(jié)果表明，平均回收率為88.7%～98.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～4.0%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取樣品制備液10 μL，連續(xù)6次進(jìn)樣，測得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%，證明該方法的精密度較高。

2.6 產(chǎn)品測定

選取本公司5款益生菌類保健食品（n=3）進(jìn)行檢驗(yàn)測定低聚木糖含量，檢測結(jié)果見表3，色譜圖見圖1和圖2。產(chǎn)品中含少量木糖成分，所以水解前測量值不為零，在計(jì)算時(shí)應(yīng)減去。

3 結(jié)論

本文建立了測定益生菌類保健食品中低聚木糖的測定方法，采用高效液相色譜-紫外檢測器并結(jié)合PMP柱前衍生化進(jìn)行測定。結(jié)果表明，由于樣品需經(jīng)過水解及柱前衍生化，前處理較為復(fù)雜，選擇以鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的誤差進(jìn)行了校正，從而提高了檢測準(zhǔn)確性。同時(shí)對方法的線性、靈敏度、回收率、重復(fù)性及實(shí)際產(chǎn)品測定等多個(gè)方面進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，該方法具有較高的靈敏性及準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于相關(guān)益生菌類保健食品的低聚木糖含量的測定。

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