虎杖苷對(duì)脂多糖介導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞焦亡的影響

陳白燁 陳敏健 王學(xué)明 宋湧 汪怡 袁曉野

福建省婦幼保健院整形外科，福州 350000

細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞炎性死亡方式，各種刺激因子導(dǎo)致細(xì)胞半胱天冬酶-1（caspase-1）激活，一方面引起細(xì)胞膜破裂并釋放細(xì)胞內(nèi)容物，進(jìn)而激活炎性反應(yīng)；另一方面促進(jìn)白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18的成熟及分泌，進(jìn)而介導(dǎo)炎性反應(yīng)［1］。而大量研究表明，炎癥是影響創(chuàng)面愈合的重要因素［2-3］，但細(xì)胞焦亡在創(chuàng)面愈合中的作用極少見報(bào)道，因此，在本研究中我們將探討皮膚成纖維細(xì)胞焦亡在創(chuàng)面愈合中的作用。

我們以往研究證實(shí)虎杖苷可以促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合［4］，但機(jī)制不清。有研究證實(shí)，虎杖苷可以抑制膿毒癥急性腎損傷中腎小管上皮細(xì)胞NLRP3（NACHT，LRR，and PYD domain-containing protein 3）炎性小體激活［5］，而NLRP3激活是誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的重要因子［6］。本研究推測(cè)虎杖苷可能通過抑制皮膚成纖維細(xì)胞焦亡促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人皮膚成纖維細(xì)胞購(gòu)于上海賽佰慷生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司。Ⅲ型膠原蛋白試劑盒購(gòu)于美國(guó)ADL公司；caspase-1活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；IL-1β及IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)于Abclonal生物科技有限公司；虎杖苷及Belnacasan（VX-765）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人皮膚成纖維細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃及5%CO2下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)80%以上后傳代。參照參考文獻(xiàn)［7］，以5μg/ml脂多糖（LPS）刺激人皮膚成纖維細(xì)胞建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，培養(yǎng)72 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組細(xì)胞接受正常培養(yǎng)處理；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接受5μg/ml LPS處理；治療組細(xì)胞接受5μg/ml LPS及50μmol/L虎杖苷處理［8］；抑制劑組細(xì)胞接受5μg/ml LPS及100 nmol/L VX-765（caspase-1抑制劑）處理［9］。

1.3 caspase-1活性檢測(cè) 收集細(xì)胞并裂解，離心后取上清，以50μl樣本+50μl反應(yīng)液+5μl底物建立反應(yīng)體系，37℃避光孵育120 min后酶標(biāo)儀檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)505 nm）。

1.4 炎癥因子檢測(cè) 采用IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒檢測(cè)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后取上清，參照說明書方法步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)讀數(shù)，并計(jì)算樣本濃度。

1.5 Ⅲ型膠原蛋白檢測(cè) 收集細(xì)胞并裂解，離心后取上清。根據(jù)試劑盒說明書步驟操作，充分顯色后酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度值，并計(jì)算樣品濃度。

1.6 細(xì)胞增殖檢測(cè) MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，細(xì)胞接種于96孔板中，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞后，每孔加入10μl MTT（5 mg/ml），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄液洗3次后，每孔加入100μl二甲基亞砜，10 min后酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD多重比較法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 虎杖苷及VX-765對(duì)成纖維細(xì)胞焦亡的影響 由表1可見，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞caspase-1活性，培養(yǎng)液IL-1β及IL-18含量顯著增加（均P＜0.05），提示細(xì)胞焦亡激活；與實(shí)驗(yàn)組比較，治療組及抑制劑組細(xì)胞caspase-1活性，培養(yǎng)液IL-1β及IL-18含量顯著下降（均P＜0.05），提示虎杖苷及VX-765均可以抑制LPS誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞焦亡。

表1 各組成纖維細(xì)胞焦亡檢測(cè)（±s）

表1 各組成纖維細(xì)胞焦亡檢測(cè)（±s）

注：對(duì)照組細(xì)胞不接受任何處理，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接受5μg/ml脂多糖（LPS）處理，治療組細(xì)胞接受5μg/ml LPS及50μmol/L虎杖苷處理，抑制劑組細(xì)胞接受5μg/ml LPS及100 nmol/L VX-765處理；與對(duì)照組比較，a P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組比較，b P＜0.05

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組治療組抑制劑組caspase-1活性（%）100.0±6.4 475.4±39.9a 292.1±28.5ab 185.5±16.1ab IL-1β（pg/ml）29.3±2.5 254.9±19.4a 167.5±11.8ab 127.4±16.5ab IL-18（pg/ml）19.3±2.5 212.6±22.4a 165.5±19.9ab 129.5±17.2ab

2.2 虎杖苷及VX-765對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及Ⅲ型膠原蛋白分泌的影響 由表2可見，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖及培養(yǎng)液Ⅲ型膠原蛋白含量顯著下降（均P＜0.05）；與實(shí)驗(yàn)組比較，治療組及抑制劑組細(xì)胞增殖及培養(yǎng)液Ⅲ型膠原蛋白含量顯著增加（均P＜0.05），提示虎杖苷通過抑制細(xì)胞焦亡，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及分泌Ⅲ型膠原蛋白。

表2 各組成纖維細(xì)胞增殖及Ⅲ型膠原蛋白檢測(cè)（±s）

表2 各組成纖維細(xì)胞增殖及Ⅲ型膠原蛋白檢測(cè)（±s）

注：對(duì)照組細(xì)胞不接受任何處理，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞接受5μg/ml脂多糖（LPS）處理，治療組細(xì)胞接受5μg/ml LPS及50μmol/L虎杖苷處理，抑制劑組細(xì)胞接受5μg/ml LPS及100 nmol/L VX-765處理；與對(duì)照組比較，a P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組比較，b P＜0.05

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組治療組抑制劑組細(xì)胞增殖（%）100.0±2.3 72.5±3.4a 86.8±5.5ab 83.1±7.7abⅢ型膠原蛋白（μg/L）0.12±0.02 0.06±0.01a 0.10±0.02ab 0.09±0.01ab

3 討 論

細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡，也叫細(xì)胞炎性壞死，主要依賴于炎性小體的激活，包括NLRP1、NLRP3、AIM2等；活化的炎性小體通過激活caspase家族蛋白，進(jìn)而切割并活化gasdermin蛋白；活化的gasdermin蛋白在細(xì)胞膜形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外通透性失衡，細(xì)胞不斷腫脹并破裂，進(jìn)而釋放其細(xì)胞內(nèi)容物，介導(dǎo)過度的炎性反應(yīng)［10-11］。研究表明，細(xì)胞焦亡主要分為經(jīng)典途徑（依賴caspase-1）和非經(jīng) 典 途 徑（依 賴caspase-4/5/11）［12］。在 經(jīng) 典 途 徑 中，caspase-1被炎性小體激活后通過切割gasdermin-D（GSDMD）介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，并促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟和分泌，擴(kuò)大炎性反應(yīng)。在非經(jīng)典途徑中，caspase-4/5/11直接被細(xì)胞損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）活化，切割并活化GSDMD，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

越來越多的研究表明，細(xì)胞焦亡通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)參與創(chuàng)傷、感染、退行性病變等多種疾?。?0，13-14］，但其在創(chuàng)面愈合中的作用尚未見研究報(bào)道。鑒于細(xì)胞焦亡在炎癥調(diào)節(jié)中的重要作用，而過度的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合及不愈合的重要因素，因此，我們推測(cè)細(xì)胞焦亡參與了創(chuàng)面愈合的過程。本研究中通過LPS刺激成纖維細(xì)胞模擬創(chuàng)面愈合的炎癥過程，這是參照了許多其他的類似研究［15］。我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激介導(dǎo)成纖維細(xì)胞caspase-1激活，IL-1β和IL-18分泌增加，提示在創(chuàng)面愈合中存在細(xì)胞焦亡的激活。進(jìn)一步為了探討細(xì)胞焦亡在其中的作用，我們通過caspase-1抑制劑VX-765抑制細(xì)胞焦亡，發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞焦亡可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。而研究證實(shí)，成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其細(xì)胞死亡或凋亡可以導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合或不愈合［16］，而提高成纖維細(xì)胞數(shù)量可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合［17］。成纖維細(xì)胞通過分泌膠原蛋白促進(jìn)創(chuàng)面愈合，本研究進(jìn)一步證實(shí)抑制細(xì)胞焦亡可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌Ⅲ型膠原蛋白。因此，本研究結(jié)果提示，抑制成纖維細(xì)胞焦亡可能促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

我們既往已證實(shí)虎杖苷可以促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合［4］，但機(jī)制不清。研究證實(shí)，虎杖苷可以抑制膿毒癥急性腎損傷中NLRP3炎性小體激活，而NLRP3炎性小體激活是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的重要途徑［5］。因此，本研究推測(cè)虎杖苷可能通過抑制細(xì)胞焦亡發(fā)揮作用。本研究結(jié)果證實(shí)虎杖苷可以抑制LPS誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞焦亡，并促進(jìn)其增殖并分泌膠原蛋白，提示虎杖苷可能通過抑制成纖維細(xì)胞焦亡促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

綜上，抑制LPS誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞焦亡可以促進(jìn)其增殖并分泌膠原蛋白，虎杖苷可能通過抑制成纖維細(xì)胞焦亡促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。