肺泡灌洗液效應(yīng)T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)與RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測對(duì)涂陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值比較

黃 健 張志大 李希玖

江西省胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江西南昌 330006

肺結(jié)核是一種由結(jié)核桿菌感染肺部導(dǎo)致的傳染性疾病，早期癥狀輕微，隨著疾病發(fā)展，肺結(jié)核患者逐漸出現(xiàn)畏寒、出汗、間歇性咳嗽等癥狀，隨著疾病發(fā)展，患者甚至出現(xiàn)咯血現(xiàn)象，嚴(yán)重影響患者身體健康[1]。近年來，隨著人們健康意識(shí)提升，每年進(jìn)行健康體檢的人群增多，大批無癥狀結(jié)核患者被及早發(fā)現(xiàn)，為患者早期治療、控制結(jié)核病蔓延奠定了基礎(chǔ)。據(jù)全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查中，在參與調(diào)查的10萬人中，活動(dòng)性肺結(jié)核為459 例，占0.46%，其中，涂陰肺結(jié)核的患病率占總患病數(shù)的85.62%[2]。在診斷結(jié)核病時(shí)，疾病確診離不開細(xì)菌學(xué)，增大了涂陰肺結(jié)核快速診斷難度?，F(xiàn)有診斷技術(shù)中，涂片鏡檢迅速且便利，但敏感性不足。且結(jié)核菌培養(yǎng)時(shí)間超過2 周。結(jié)核分枝桿菌RNA 恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)（simultaneous amplification and testing for Mycobacterium tuberculosis，SAT-TB）檢測迅速，僅需要1～2 h，但容易因外力因素（如污染等）出現(xiàn)假陽性，靈敏度低，對(duì)實(shí)驗(yàn)員的專業(yè)性要求高。因結(jié)核的特異性，效應(yīng)T 細(xì)胞會(huì)向病變位置集中，依照該特點(diǎn)，本研究收集患者肺泡灌洗液，進(jìn)行結(jié)核感染效應(yīng)T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-cell spot test，T-SPOT），通過計(jì)算肺泡灌洗液內(nèi)結(jié)核桿菌特異性單核細(xì)胞，快速診斷肺結(jié)核。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至12月江西省胸科醫(yī)院收治的80 例疑似肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，按照痰涂片檢驗(yàn)結(jié)果將其分為涂陽組（35 例）與涂陰組（45 例）。涂陽組中，男24 例，女11 例；年齡25～67歲，平均（46.02±4.02）歲；病程2～6 個(gè)月，平均（4.42±0.41）個(gè)月；肺結(jié)核17 例，結(jié)核性腹膜炎13 例，其他5 例。涂陰組中，男28 例，女17 例；年齡26～67 歲，平均（46.53±4.47）歲；病程2～6 個(gè)月，平均（4.32±0.43）個(gè)月；肺結(jié)核18 例，結(jié)核性腹膜炎12 例，其他5 例。兩組患者的年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者既往無結(jié)核病史；②患者血清HIV 檢測為陰性；③遵循 《肺結(jié)核診斷和治療指南》[3]，對(duì)患者肺泡灌洗液均進(jìn)行SAT-TB、T-SPOT 檢測；④患者愿意參與本研且所有患者及其家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神障礙患者；②合并嚴(yán)重肝、腎、心臟疾病患者；③患者一般資料不全。

1.2 方法

標(biāo)本采集：使用日本1575k 型電子支氣管鏡對(duì)患者進(jìn)行檢查，于患者肺部CT 影像學(xué)檢查病灶位置的支氣管肺段，將灌洗液（0.9%氯化鈉溶液；江西科倫藥業(yè)有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：20200912）注入支氣管肺泡灌洗，以YX930D 型負(fù)壓吸引器（上海寶佳醫(yī)療器械有限公司）回收灌洗液30 ml，送檢驗(yàn)科進(jìn)行T-SPOT、SAT-TB 檢測。

T-SPOT 檢測：收集肝素抗凝肺泡灌洗液10 ml，以雙層紗布過濾，去除灌洗液內(nèi)雜質(zhì)，在離心機(jī)內(nèi)以離心半徑5 cm、離心速度1200 r/min 離心10 min，去除上層清液，留下層濃液，分離其中單核細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)達(dá)2.5×105/ml，選擇T-SPOT 試劑盒，根據(jù)說明書進(jìn)行操作，步驟如下：將單核細(xì)胞分離，和培養(yǎng)濾過蛋白CFP-10、結(jié)核特異性抗原分泌靶向抗原ESAT-6放于抗γ-干擾素抗體預(yù)包被板內(nèi)孵育，恒溫37℃，孵育16～20 h。使用ELR06IFL 型自動(dòng)讀板儀（德國艾迪公司）對(duì)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，無反應(yīng)對(duì)照0～5 孔點(diǎn)，有反應(yīng)標(biāo)本為：抗原A/B 點(diǎn)數(shù)-無反應(yīng)對(duì)照孔6 點(diǎn)為陽性；若無反應(yīng)對(duì)照孔點(diǎn)≥6，有反應(yīng)標(biāo)本為：抗原A/B 點(diǎn)數(shù)≥無反應(yīng)對(duì)照孔的2 倍為陽性。

SAT-TB 檢驗(yàn)：在肺泡灌洗液內(nèi)添加4%氫氧化鈉溶液，使灌洗液內(nèi)黏液液化，采用檢測試劑盒檢測，并依照說明書操作。注意：液化體積不高于標(biāo)本量1 倍。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①觀察涂陰組與涂陽組患者肺泡灌洗液T-SPOT檢測陽性率，陽性率=陽性例數(shù)/總例數(shù)。②以分子生物學(xué)檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，觀察T-SPOT 與SAT-TB 在涂陰肺結(jié)核檢測中的準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）與陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV）。準(zhǔn)確率=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%，靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%，特異度=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%，PPV=真陽性/（真陽性+假陽性）×100%，NPV=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者肺泡灌洗液T-SPOT 檢測結(jié)果的比較

涂陽組患者的陽性率為97.14%（34/35），高于涂陰組的75.56%（34/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.196，P=0.007）。

2.2 涂陰組患者T-SPOT 與SAT-TB 在涂陰肺結(jié)核中檢驗(yàn)結(jié)果的比較

T-SPOT 檢測的準(zhǔn)確率為93.33%（42/45），高于SAT-TB 檢測的80.00%（36/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.688，P=0.006）（表1）。

表1 涂陰組患者T-SPOT 與SAT-TB 在涂陰肺結(jié)核中的檢驗(yàn)結(jié)果（例）

2.3 T-SPOT 與SAT-TB 檢測涂陰肺結(jié)核的靈敏度、特異度、PPV 與NPV

T-SPOT 檢測的靈敏度、NPV 高于SAT-TB 檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩種檢測方式的特異度、PPV 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 T-SPOT 與SAT-TB 檢測涂陰肺結(jié)核的靈敏度、特異度、PPV與NPV[%（n/N）]

3 討論

目前結(jié)核病仍是全球主要傳染病之一，致死率高，危害性大，若能夠及早發(fā)現(xiàn)結(jié)核病并治療，對(duì)控制結(jié)核病具有重要意義[4-6]。結(jié)核桿菌的確診，離不開細(xì)菌學(xué)、病理學(xué)，細(xì)菌學(xué)應(yīng)用較為廣泛，但是，部分細(xì)菌檢測為陰性者也可能感染肺結(jié)核，易發(fā)生診斷疏漏，不利于結(jié)核病篩查與控制，而病理學(xué)檢測雖然準(zhǔn)確，但耗時(shí)長，不利于普及。隨著微創(chuàng)技術(shù)的完善和腔鏡器械的廣泛應(yīng)用，已有諸多研究[7-9]證實(shí)肺泡灌洗液相關(guān)檢測可顯著提升結(jié)核病診斷陽性率。

T-SPOT 作為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測技術(shù)，以結(jié)核患者特異性T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答作為基礎(chǔ)，檢驗(yàn)抗原釋放的γ-干擾素，當(dāng)受檢人體內(nèi)受到結(jié)核桿菌的抗原刺激，T 淋巴細(xì)胞致敏，并再次與同類抗原相遇，將釋放γ-干擾素[10-12]。通過檢測單細(xì)胞內(nèi)分泌γ-干擾素的數(shù)目，判斷受檢人是否感染結(jié)核桿菌。并且，活動(dòng)性肺結(jié)核患者的特異性T 細(xì)胞擴(kuò)大與克隆會(huì)濃縮于患者病灶部位，因此，以T-SPOT 檢測受檢人的肺泡灌洗液，能夠準(zhǔn)確區(qū)分受檢人為活動(dòng)性結(jié)核或者潛伏性結(jié)核[13]。本研究結(jié)果顯示，T-SPOT 檢測下，涂陽組的陽性率（97.14%）高于涂陰組（75.56%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)涂陰組檢測時(shí)，T-SPOT 檢測涂陰肺結(jié)核的陽性率（94.29%）高于SAT-TB 檢測（77.14%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T-SPOT 檢測的靈敏度、NPV 高于SAT-TB 檢測，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩種檢測方式的特異度、PPV 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示T-SPOT 檢測效果更加準(zhǔn)確，值得推廣。在王琳等[14]的研究中，T-SPOT 檢查的靈敏度較高，為91.1%，與本研究結(jié)果一致。T-SPOT 檢測用時(shí)短，特異度高，可能和涂陰肺結(jié)核的結(jié)核桿菌數(shù)量較少相關(guān)，即使利用灌洗液在病灶處收集結(jié)核桿菌，結(jié)核桿菌的數(shù)量依然有限，而T-SPOT 檢測技術(shù)主要檢測單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)抗原致敏T 細(xì)胞的數(shù)量，并非檢測細(xì)菌數(shù)量，因此，與其他檢測方式比較，T-SPOT 檢測的特異性高，敏感性強(qiáng)，診斷價(jià)值高[15-18]。

綜上所述，肺泡灌洗液效應(yīng)T 細(xì)胞檢測在涂陰肺結(jié)核中的靈敏度高，且檢測速度快，在肺結(jié)核篩查中具有重要意義，值得推廣。